不同發酵類型乳酸菌對低水分粳稻秸稈青貯發酵 品質及有氧穩定性的影響

司華哲， 劉晗璐， 南韋肖,2， 金春愛， 李光玉*

(1.中國農業科學院特產研究所，吉林，長春 130112； 2.吉林農業大學動物科學技術學院，吉林，長春130118)

我國是產糧大國，農副秸稈資源豐富。稻米作為我國主要糧食種類，全國種植量大，但由于對秸稈綜合利用不足導致大量秸稈被堆放在田間后隨意焚燒，對空氣造成了嚴重污染。據文獻記載，稻秸年產量約為1.89億噸，其中我國主要糧食種植區之一的東北地區稻秸產量為3149.15萬噸，占全國總量的14.18%[1]。自然風干后的稻秸是一種劣質的粗飼料，刈割后的粳稻秸稈水分含量低，適口性差，干物質的消化率低，即使反芻動物瘤胃微生物也很難加以分解利用，這也是制約稻秸作為動物粗飼料的主要因素，而經過加工處理后的秸稈，可提高反芻動物的采食量和消化率[2]。

秸稈飼料的加工方式主要有物理、化學和生物處理3種，其中物理法僅停留在長度、粗細等物理狀態的改變而不能增加飼料的營養價值，化學處理法通常為堿化、氨化或酸化處理，其加工費用較高且處理液處置不當易造成環境污染，生物法因其可較好的保留秸稈營養價值且延長其保存時間等優點已在我國畜牧生產中普遍推廣使用[3]。低水分青貯為特殊青貯的方法之一，適用原料來源更加廣泛，同時克服原料水分不足的缺點，因而適用于東北刈割脫粒后的粳稻秸稈。

低水分青貯通常使用外源添加劑促進青貯過程，其中外源添加乳酸菌可克服原料本身附著乳酸菌少和緩沖能高等缺點，加速青貯過程，提高發酵品質[4]。不同發酵類型乳酸菌發酵終產物不同，其中同型發酵乳酸菌可提高青貯的乳酸含量，降低pH值，極大的提高青貯質量，而異型發酵乳酸菌可分解利用乳酸生成乙醇和乙酸，前者有一定的殺菌作用，后者則可抑制真菌的繁殖，這對青貯過程中有害細菌的減少及開窖后有氧穩定性的提高均有促進作用。Guo等研究發現，添加同型發酵乳酸菌青貯可提高青貯牛尾草的干物質、粗蛋白和乳酸生成量[5]。Kleinschmit等研究發現，在牧草、玉米與谷類秸稈青貯過程中添加異型發酵乳酸菌，可以降低青貯的pH，提高乳酸含量，并提高青貯的有氧穩定性[6]。因此，本試驗采用從吉林地區青貯狀況良好的玉米青貯飼料中分離得到的同型發酵乳酸菌植物乳桿菌(Lactobacillusplantraum)S2406和異型發酵乳酸菌布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)H4001應用于低水分青貯稻秸，監測其發酵后營養物質的變化，研究上述兩株乳酸菌對稻秸發酵品質的影響，為更科學有效地利用分離得到的優良乳酸菌及改善稻秸發酵品質提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗用菌種來源于本實驗室自主分離、鑒定、保存的布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)H4001及植物乳桿菌(Lactobacillusplantraum)S2406，使用MRS乳酸細菌液體培養基，37℃培養24 h，培養液中含活菌數約為1×1010cfu·mL-1，作為試驗用菌株。以吉林省雙陽區種植粳稻副產品稻秸為低水分青貯材料。使用直徑8 cm，高20 cm，壁厚0.1 cm，容積為1 L的螺口樹脂瓶作為青貯容器。

試驗根據添加物質不同。分為4個處理組：1組噴灑等量的無菌水(CS)；2組噴灑布氏乳桿菌H4001(HS)，添加量為5×106cfu·g-1FM；3組噴灑植物乳桿菌S2406組(SS)，添加量為5×106cfu·g-1FM；4組噴灑植物乳桿菌與布氏乳桿菌混合菌液(MS)，添加量為(2.5+2.5)×106cfu·g-1FM。

1.2 低水分青貯制作

2016年10月7日，將刈割脫粒后的粳稻秸稈切碎至1～1.5 cm長短，將植物乳桿菌S2406與布氏乳桿菌H4001新鮮培養液使用無菌去離子水稀釋后，使用噴壺均勻噴灑于稻秸上，噴灑量為5×106cfu·g-1FM，取950～1 000 g快速壓實填緊于容積1 L的樹脂瓶中；對照組，噴灑等量的無菌水。制作結束后，青貯瓶室溫保存，定期檢查瓶口封閉狀態，如有松動及時旋緊瓶蓋。室溫發酵，試驗期60天。

1.3 樣品采集與分析

取粳稻秸稈500 g，每組3個重復，放入鼓風干燥箱內，65℃下烘干48 h，測定含水量，粗蛋白質(crude protein, CP)，粗脂肪(ether extract, EE)可溶性碳水化合物(water soluable carbohydrate, WSC)，中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)，酸性洗滌纖維(acid detergent fibre, ADF)和灰分(Ash)含量。

60 d后取樣品30 g，放入500 mL錐形瓶中，加入270 mL無菌蒸餾水，攪拌均勻后靜置2 h，將混有樣品的蒸餾水用攪拌器(方成 SG260-B，中國)攪拌10 min，攪拌液經4層紗布過濾，測定該濾液的pH值，揮發性脂肪酸(volatile fatty acids, VFAs)，乙醇(ethanol, ETH)，乳酸(lactic acid, LA)，氨態氮(ammoniacal nitrogen, NH3-N)含量。另取青貯樣品400 g進行營養物質的測定，檢測干物質(dry matter, DM)、CP、EE、WSC、ADF、NDF和Ash含量。

1.4 測定方法

水分、CP、NDF、ADF采用飼料檢測技術測定[7]；WSC的測定采用蒽酮比色法進行測定；粗灰分采用灼燒法測定；pH值使用精密pH測試儀測定；NH3-N含量采用蒸餾法測定；乳酸、乙醇和揮發性脂肪酸含量使用氣相色譜儀測定。60天后，將暴露在空氣中的青貯瓶置于相同條件下環境中，周圍環境保持24℃恒溫，使用針式食品溫度計在樣本正中插入約10 cm深，保持敞口。每隔12 h記錄一次樣本核心溫度，當樣本的溫度超過室溫2℃時作為判定標準[8]。

1.5 數據分析

試驗數據使用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，均值采用Duncan氏進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌添加劑粳稻秸稈發酵pH值的影響

發酵60 d后，CS、HS、SS和MS的pH值如表1所示。各處理組間差異顯著(P<0.05)，其中，乳酸菌添加組pH均低于4.0，分別為HS>MS>SS，而CS的pH值顯著高于其他3組，這表明，添加乳酸菌具有降低青貯pH值的效果，單獨添加植物乳桿菌對青貯pH下降更有利。

表1 青貯后各組pH值Table 1 The pH valve after silage fermentation

注：表中同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

Note：Different letters in the same row indicate significant differenc at the 0.05 level

SS組乳酸生成量大于其他三組但差異不顯著，HS的乙酸和乙醇生成量均顯著大于其他3組(P<0.05)(表2)，3個處理組戊酸、丁酸含量均顯著小于對照組(P<0.05),且互相之間差異不顯著，丙酸的生成量為CS>MS>SS>HS。表明添加布氏乳桿菌可以提高低水分青貯乙酸和乙醇的產生，減少丙酸、丁酸和戊酸的生成。植物乳桿菌可以提高乳酸的生成量。添加乳酸菌后，可以減少青貯的丙酸、丁酸和戊酸的生成量。

表2 青貯中乳酸、乙醇、乙酸、丙酸和丁酸含量Table 2 Contents of lactic, ethanol, acetic, propionic acids, butyric acids and valeric acids/μmol·g-1 FM

注：表中同列不同小寫字母表示數值差異顯著(P<0.05)

Note：Different in the same column letters indicate significant differences at the 0.05 level

2.3 添加乳酸菌對粳稻秸稈發酵前后營養成分的影響

發酵60 d后，CS、MS、SS和HS同青貯前相比各營養成分均有不同程度的變化(表3)。對比原料，4個處理組的CP、WSC、ADF、EE和Ash的含量顯著降低(P<0.05)，而青貯前DM含量與SS組差異不顯著但顯著高于其他3組(P<0.05)。

青貯原料含水量以及蛋白含量較低，但其可溶性糖含量較高，可用于青貯。青貯后，處理組與對照組相比，DM、CP、WSC含量上均有顯著提高(P<0.05)，氨態氮含量顯著降低(P<0.05)，NDF、ADF、EE和Ash含量無顯著差異。其中，SS組DM、CP含量，HS組的WSC和ADF含量均顯著高于其他處理組(P<0.05)。這表明，添加植物乳桿菌可以降低青貯干物質和粗蛋白的損耗，而添加布氏乳桿菌可以提高青貯的WSC含量。

2.4 添加乳酸菌對粳稻秸稈發酵有氧穩定性的影響

4組的有氧穩定性時間分別為：CS組56 h，SS組92 h，HS組121 h，MS組100 h。與CS組相比，SS、HS和MS組的有氧穩定性分別延長了36 h、65 h和44 h，即分別提高了64%、116%和78%。由表4可知，添加植物乳桿菌也可以提高青貯的有氧穩定性，但添加布氏乳桿菌對提高青貯的有氧穩定性效果更佳。

表3 青貯前后營養物質變化Table 3 Chemical composition of the silages

注：表中同列不同小寫字母表示數值差異顯著(P<0.05)

Note：Different letters in the same column indicate significant differnce at the 0.05 level

表4 青貯有氧穩定性結果Table 4 Aerobic stability of silage exposed to air/h

3 討論

3.1 不同乳酸菌添加劑對粳稻秸稈發酵pH值、有機酸及揮發性脂肪酸含量的影響

乳酸菌添加劑對青貯發酵品質的影響主要表現在兩個方面：一是加快發酵速度，二是改變發酵終產物的含量[9]。本試驗中植物乳桿菌組乳酸含量顯著低于其他3組，而布氏乳桿菌組乙醇、乙酸生成量顯著高于其他3組，這與Weinters和Muck的研究結果一致，同型發酵乳酸菌發酵終產物為乳酸，而異型發酵乳酸菌在厭氧條件下將乳酸分解成乙酸、1,2-丙二醇、CO2和乙醇[10-11]。混合組的乳酸含量低于植物乳桿菌組但高于布氏乳桿菌添加組，其乙醇和乙酸含量則表現出相反結果，這表明混合添加不同發酵類型乳酸菌，可有效提高低水分青貯稻秸乳酸和乙酸生成量。

丁酸的發酵程度是鑒定青貯飼料好壞的重要指標，丁酸含量越多，青貯料品質越差。本試驗中，處理組丙酸、丁酸、戊酸生成量均顯著低于對照組，這是因為外源乳酸菌添加活性強，且壓實的青貯提供了乳酸菌繁殖所需的厭氧環境，其大量繁殖生成乳酸，降低了青貯的pH值，酸性環境與厭氧環境抑制了其他細菌的繁殖及對青貯DM和CP等營養物質的損耗，從而提高了青貯的發酵品質[12]。而對照組青貯pH值、丙酸、丁酸和戊酸顯著高于其他處理組，這可能是因為水稻本身附著的乳酸菌數量少，且稻秸中空，壓實后仍有少量空氣存在，延緩了形成厭氧環境的時間，使乳酸菌無法快速繁殖產酸，并降低青貯的pH值，從而使產丙酸、丁酸和戊酸的好氧細菌，如丁酸菌等活動并大量繁殖，將葡萄糖和乳酸分解成丙酸、丁酸和戊酸等，降低青貯飼料的品質。反芻動物雖然可以直接利用揮發性脂肪酸供能，但由于其易揮發的特點，在開窖到飼喂過程中，可能有大量揮發性脂肪酸損失。本試驗中，60 d后乳酸含量偏低，乙酸含量較高。可能是由于原料本身附著乳酸菌多為異型發酵乳酸菌[13]，在青貯后期，分解乳酸生成乙酸導致的，其真正原因仍需進一步研究。因此，在稻秸青貯過程中，應額外添加乳酸菌或碳水化合物以便提高其發酵品質，降低營養物質的損耗。

3.2 不同乳酸菌添加劑對粳稻秸稈發酵營養成分的影響

青貯后稻秸的營養物質對比青貯前均有一定程度的下降，這是由青貯過程中微生物的利用導致的。乳酸菌處理組與對照組相比，DM、CP、ADF和WSC的含量均有顯著提高，這與Vaitiekunas與Francisco等人的試驗結果一致[14,15]。添加乳酸菌可以加快發酵速度，減少其他細菌繁殖對青貯營養物質的消耗，其中添加植物乳桿菌后青貯的DM和CP含量提高效果顯著高于布氏乳桿菌，這可能是因為布氏乳桿菌作為異型發酵乳酸菌發酵的終產物不同引起的。當青貯中乳酸過高時，布氏乳桿菌可分解乳酸，導致青貯的pH值上升，降低了對其他細菌的抑制能力，對青貯DM和CP的保留能力較植物乳桿菌減弱，但在試驗過程中發現布氏乳桿菌組WSC和ADF含量顯著高于植物乳桿菌，這與Kung的研究結果并不一致[16]，原因可能是微生物繁殖需利用青貯中的WSC作為發酵底物，而異型發酵乳酸菌在實際青貯過程中繁殖速度和數量少于植物乳桿菌，植物乳桿菌大量繁殖的同時加大了對青貯WSC消耗[17]。布氏乳桿菌分解乳酸生成乙醇和乙酸，乙醇有殺菌作用，且乙酸可以抑制一些真菌繁殖，加之布氏乳桿菌繁殖速度弱于植物乳桿菌，因此青貯的WSC含量高于其他組。試驗中對照組和植物乳酸菌處理組ADF含量顯著低于原料，可能是由于青貯過程中水稻秸稈中纖維素被微生物降解利用后生成半纖維素導致的，半纖維素含量的增高導致了酸性洗滌可溶物的增加，減少了ADF的含量，而HS與MS可能由于其乙酸乙醇含量高于其他組抑制了纖維素降解菌的繁殖[18]。NH3-N含量與青貯CP含量密切相關，其由腐敗微生物消耗CP產生[19]。本試驗中，植物乳桿菌組CP含量顯著高于其他組，其NH3-N含量顯著低于其他組。青貯后各組粗脂肪含量顯著低于原料，原因可能是霉菌等微生物大量生長，從而分解消耗粗脂肪[20]。混合組在青貯過程中，綜合了兩種乳酸菌對提高營養物質的優點，雖在各項指標中均未顯著高于其他3組，但顯著性均介于兩者之間。這表明，單獨或混合使用不同發酵類型乳酸菌可獲得不同的發酵品質，針對不同情況，可以自由選擇添加。通過以上試驗結果可以說明，適量使用乳酸菌添加劑可有效提高水稻秸稈的發酵品質，減少營養物質損耗。

3.3 添加乳酸菌對粳稻秸稈發酵有氧穩定性的影響

青貯的有氧穩定性定義為青貯飼料在空氣中暴露后其內部溫度比外界溫度高出2℃所需要的小時數[8]。前人研究發現異型發酵乳酸菌可影響青貯有氧穩定性，但延長的時間并無統一定論。Danna通過對比多種影響青貯有氧穩定性的化學物質時發現，乙酸可大幅度提高青貯的有氧穩定性[21]。本試驗中，布氏乳桿菌組乙酸生成量顯著高于其他組，并且其有氧穩定性時間最長，比對照組延長了65 h，這可以說明乙酸生成量與有氧穩定性成正比。目前同型發酵乳酸菌對有氧穩定性提高的報道很少。而在本試驗中植物乳桿菌處理組的有氧穩定性較對照組提高了36 h，這可能是因為乳酸菌具有較強的耐酸作用，當pH下降到4時，其他細菌受抑制活性下降，而其中的異型發酵乳酸菌可在酸性環境利用乳酸。在青貯后期，即使未添加布氏乳桿菌的處理組，如果青貯原料生長環境中存在該菌，則青貯后會存在一定比例的布氏乳桿菌，而同型發酵乳酸菌對青貯有氧穩定性的提高仍是由其中布氏乳桿菌存在導致的[16]。混合組的有氧穩定性時間較對照組提高了44 h，這表明混合添加不同發酵類型乳酸菌在青貯粳稻秸稈開窖后對有氧穩定性有延長作用。

4 結論

本試驗中，添加不同發酵類型乳酸菌對粳稻秸稈發酵品質提高效果不同，針對生產實際情況，建議單獨或混合添加兩種發酵類型乳酸菌，發揮不同組合的優勢，解決實際生產中不同問題。乳酸菌處理后的粳稻秸稈，不僅對秸稈資源的合理利用起到重要作用，而且可以緩解北方地區冬春季青飼料缺乏的問題。在未來的研究中，仍需進一步通過試驗評價使用添加劑青貯低水分粳稻秸稈對動物生產性能的影響。