黑土區紫花苜蓿根瘤菌特性研究與促生能力分析

朱瑞芬, 劉杰淋, 王建麗, 申忠寶, 韓微波, 陳積山

(黑龍江省農科院草業研究所，黑龍江 哈爾濱 150086)

根瘤菌是一類廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細菌，它通過侵染豆科植物根部形成根瘤后與植物根系共生固氮來為植物提供氮素營養。根瘤菌固氮不僅能提高豆科植物產量，改善品質，而且能提高土壤肥力，改善土壤結構，還可以為后茬作物提供部分氮素營養。但成功接種根瘤菌并讓其在與土著根瘤菌的競爭中獲勝，并對植物的生長產生顯著的促進作用并不容易。研究發現，接種效果差的原因是土壤中含有大量固氮效率差的土著根瘤菌，他們雖然不能有效的對植株產生促生效應，但卻能擠占高效根瘤菌接種劑的占瘤率[1,2]。根瘤菌結瘤是一個競爭的過程，受許多因素的影響，如土壤條件、土著根瘤菌數量、豆科植物品種及自身競爭力等。因此，對于在不同區域種植的不同豆科植物品種，開展其與根瘤菌共生固氮優良組合的篩選研究，提高根瘤菌植物共生體的固氮效率，一直是生物固氮研究領域中的熱點及重點工作。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上栽培最早分布最廣的多年生豆科牧草。在我國東北地區特別是黑土雨養農業區，苜蓿栽培普遍存在管理粗放，單產不高、品質低等問題，這在一定程度上限制了苜蓿的栽培利用，也影響了農民創收。國內外發展苜蓿的經驗表明，紫花苜蓿接種根瘤菌后其產量與品質都有一定程度的改善。基于此，為苜蓿主產區主要品種篩選高效根瘤菌是改善苜蓿產量和品質的一個重要途徑。目前，有關根瘤菌接種對黑土雨養區主要栽培品種如龍牧系列苜蓿的影響尚未見報道。考慮到苜蓿品種以及根瘤菌來源對于其共生體固氮效率的影響，開展該區域苜蓿品種與根瘤菌的篩選工作對于生產實踐具有重要意義。基于此，本研究立足于東北黑土區這一特殊區域，選擇紫花苜蓿這一生長適應性較好的豆科牧草為載體，進行苜蓿根瘤菌各指標的相關性探索，初步明確該地域苜蓿根瘤菌特性及其對促生植株生物量和含氮量的作用機制。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

菌株采樣地位于黑龍江哈爾濱市道外區民主鄉。試驗地前茬為玉米低產農田，土壤類型以黑土為主，土壤全鹽量0.157%，有機質8.85 g·kg-1，全氮0.335 g·kg-1，速效氮103.50 mg·kg-1，田間持水量平均22.71%，pH值6.12。供試菌株在2011年采集于2個東北區主栽品種的2齡苜蓿，分別是農牧801紫花苜蓿和肇東苜蓿，播種量均為15 kg·h-1m2。苜蓿試驗地管理與大田相同，無施肥灌水處理，人工防除雜草。供試菌株見表1。

表1 菌株編號及來源地Table 1 The code and source of tested strains

1.2 試驗方法

1.2.1利用基礎培養基將28株苜蓿根瘤菌菌株分別進行耐鹽、耐堿、耐酸、溶磷能力、生長素分泌能力、代時、固氮酶活性測試。基礎培養基選用YMA培養基[3]，配方：甘露醇10.0 g·L-1、NaCl 0.1 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2g·L-1、酵母粉1.0 g·L-1、K2HPO40.5 g·L-1、蒸餾水1 000 ml，pH值7.0～7.2。

1.2.2耐鹽、耐堿、耐酸能力測定在YMA培養基基礎上分別用NaCl、NaOH、HCl調節鹽含量與PH值。

1.2.3溶磷能力測定用P、K、O固體培養基。每個供試菌株3個重復，每培養皿4個接菌點，置生化培養箱28℃下恒溫培養，培養11 d后測量根瘤菌菌落直徑和溶磷透明圈直徑，計算根瘤菌菌落溶磷透明圈直徑與菌落直徑的比值，比值越大，溶磷能力越強，比值越小，溶磷能力越弱，比值為1時表示菌落無溶磷能力。P、K、O培養基配方(g·L-1)：10 g 葡萄糖，5.0 g Ca3(PO4)2、0.5 g (NH4)2SO4、0.2 g NaCl、0.2 g KCl、0.03 g MgSO4·7H2O、0.03 g MnSO4、0.003 g FeSO4、0.5 g酵母膏、20 g瓊脂、1 000 ml蒸餾水、pH=6.8～7.0。其中Ca3(PO4)2過篩并單獨滅菌后與培養基混合[4]。

1.2.4生長素分泌能力測定培養基采用改良的剛果紅液體培養基。組成：0.5 g K2HPO4·3H2O、0.2 g MgSO4·7H2O、0.1 g NaCl、1 g酵母膏、10 g甘露醇、1 g NH4NO3、100 mg·L-1色氨酸，1 000 mL蒸餾水，pH值7.0；PC比色液配方：0.5 mol·mL-1FeCl3、H2SO430 mL，蒸餾水50 mL。將菌株接種于盛有50 mL培養基的三角瓶中，置于轉速125 r·min-1、溫度28℃的搖床培養,每一菌株3個重復，培養12 d。取上述培養12 d的培養液在10 000 r·min-1下4℃離心10 min，取上清液1 mL加1 mL PC比色液，黑暗下靜置30 min后，迅速用分光光度計比色(波長530 nm)[5]。

1.2.5生長曲線試驗確定：接種根瘤菌到裝有YMA液體培養基的三角瓶中，置28℃，120 r·min-1條件下恒溫搖培8 h后，每隔2 h取樣1次，36 h后每隔12 h取樣1次，至96 h結束，檢測OD600nm值(以YMA培養液為對照)，3次重復。平板計數后，作出OD值與菌數間的對應關系曲線，利用公式求得代時[6]。

公式中t1、t2為對數期的兩個時間點，Nt1、 Nt2為相應時間的菌數。結合采用平板稀釋法，把根瘤菌懸液接種于YMA平板上，28℃培養，觀測菌落出現的時間，以確定供試根瘤菌菌株屬于快生型或慢生型。

1.2.6在無菌工作臺中將供試的28個根瘤菌株接入滅菌的YMA液體培養基中，置于28℃控溫搖床中培養約48±6 h(搖床轉速為120 r·min-1)后，用分光光度計測定該培養菌液的OD600nm值，以較低OD600nm值菌液為基準(一般要求OD600nm值大于0.5)，將各菌株培養液通過加入無菌水稀釋，配制成OD600nm值相等的標準懸浮菌液。每個供試苜蓿品種選取籽粒飽滿、無損傷、大小一致的種子，按30粒/盆播種量置于90 mm的培養皿中，用等量標準懸浮菌液浸泡4 h后，菌液和種子一起均勻播種于花盆中，播種深度1.5～2 cm。對照用相同播量未接種的種子播種。待花盆苜蓿齊苗后進行間苗，每盆留生長良好的苜蓿20株，再澆一次等量OD值的根瘤菌菌液。植株生長2個月后，測量根瘤菌促生試管苗的根瘤數、根瘤重、地上生物量；并將其地上部分裝入信封烘干，用粉樣機粉碎，用凱氏定氮儀測定植株全氮。

1.2.7固氮酶活性測定：將上述中稱過重的根瘤放入5 ml入醫用抗凝管，用無菌注射器抽出1 ml的氣體，注入1 ml C2H2氣體，反應2 h。然后,用注射器抽取0.05 ml瓶內氣體注入氣相色譜儀，測定乙烯產生的量，并用乙烯生成量表示固氮酶活性大小。反映條件：Al2O/S毛細柱，柱溫50℃，進樣器溫度150℃，檢測器溫度180℃；檢測器為氫火焰檢測器(FID)。外標法計算測定結果，以mmol C2H4·mL-1·h-1表示固氮酶活性。根據下公式計算固氮酶活性大小[7]。

ARA=樣品C2H4峰面積·CC2H4·標準C2H4進樣量·樣品氣體總體積/標準C2H4峰面積·培養時間·樣品進樣量

CC2H4=n/V=P/RT=84.63kPa/8.314k·Pa·L·moL-1k-1·(273.15+27)k

1.3 數據分析

采用SPSS 20.0-GLM-Univariate-ANOVA模型分析不同處理對所測指標的影響，各處理平均值的多重比較用Duncan氏檢驗。

2 結果與分析

2.1 供試菌株性狀比較

由表1可知，不同菌株的植株粗蛋白(η1)、耐鹽(η2)、耐堿(η3)、耐酸(η4)、溶磷(η5)、生長素分泌(η6)、泌酸(η7)、代時(η8)、固氮酶活性(η9)、根瘤數(η10)、根瘤重(η11)和地上生物量(η12)不同。其中，菌株HND26ⅠB X2對植株促生在粗蛋白方面表現最好，菌株STF11ⅠB X20對植株促生在地上生物量方面表現最好，其余菌株在上述指標上均有不同程度的表現，這種表現體現在指標間的相關矩陣表中(表2)。

表1 供試菌株和參考菌株性狀表Table 1 Observation values of the main traits of strains tested and reference strains

表2 指標間的相關矩陣Table 2 Correlative matrix of indexes

2.2 不同菌株對植株地上生物量和全氮促生能力的比較

多重比較表明，不同菌株對促生植株地上生物量差異顯著。在根瘤菌促生作用下，除 LMⅠA以外其余27株菌株促生的苜蓿地上生物量都超過了對照，其中9株菌株促生的苜蓿地上生物量較對照顯著增大，這9株根瘤菌分別是TD26ⅠB、TD26ⅡA、TD411ⅡA、TD411ⅡB、TF26ⅡB、TF11ⅠB、TF26ⅠA、TF26ⅠB、TF11ⅠA。

對苜蓿植株有顯著促進作用的菌株有25株，占全部待測菌株的89%。菌液促生的苜蓿植株全氮量與對照之間有顯著差異，其中菌株LMⅠB對植株全氮量促進與CK(17.3313)相比最為顯著，該菌液的苜蓿全氮量為21.986%。有3株菌株(TD11ⅠB、TD26ⅡA、TD26ⅠB)對苜蓿植株全氮量貢獻與對照相比無顯著差異。

2.3 各指標與促生植株地上生物量的通徑分析

苜蓿根瘤菌菌株促生植株地上生物量的通徑分析結果見表3，其中X5(溶磷)、X7(泌酸)、X11(根瘤重)與苜蓿菌株促生植株地上生物量呈顯著相關， X1(全氮)、X2(耐鹽)、X3(耐堿)、X4(耐酸)、X6(生長素分泌)、X8(代時)、X9(固氮酶活性)、X10(根瘤數)與苜蓿地上部分相關性不顯著。通過直接效應可以看出， X5(溶磷)對苜蓿根瘤菌促生植株生物量的直接貢獻最大，而X11(瘤重)對苜蓿根瘤菌促生植株生物量的影響較小。X7(泌酸)對苜蓿根瘤菌促生植株生物量的直接貢獻最大，而X5(溶磷)對苜蓿根瘤菌促生植株生物量的影響通過X7(泌酸)表現較小。同理，X11(瘤重)對苜蓿根瘤菌促生植株生物量的影響通過X5(溶磷)和X7(泌酸)進行表現，由于苜蓿根瘤菌促生植株地上生物量與X5(溶磷)、X6(生長素分泌)、X7(泌酸)、X11(根瘤重)有顯著線性關系(P<0.01)，故建立多元線性回歸方程見表5。

表3 苜蓿根瘤菌各個指標與其地上生物量的通徑分析Table 3 Path analysis between aboveground biomass and traits in alfalfa

注：X5=溶磷、X7=泌酸、X11=根病重

Note:X5=dissolving P、X7=acid scretion、X11=weight acid seretion

2.4 各指標與促生植株全氮量的通徑分析

苜蓿根瘤菌促生植株全氮含量的通徑分析結果見表4，可以看出X7(泌酸能力)、X8(代時)、X10(根瘤數)與根瘤菌全氮含量呈顯著相關， X2(耐鹽)、X3(耐堿)、X4(耐酸)、X5(溶磷)、X6(生長素分泌)、X9(固氮酶活性)、X11(根瘤重)、X12(地上部分重量)與全氮量相關性不顯著。通過直接效應可以看出， X10(根瘤數)對苜蓿根瘤菌促生植株全氮含量直接貢獻最大，而X8(代時)對苜蓿根瘤菌促生植株全氮含量的影響為負效應。對苜蓿種菌株性狀間進行多元線性回歸分析建立最優多元線性回歸方程(表5)。通過最優多元線性回歸方程進一步表明，苜蓿根瘤菌促生植株的全氮含量與X7(泌酸)、X8(代時)、X10(促生植株根瘤數)有顯著的線性關系(P<0.01)。

表4 苜蓿根瘤菌各指標與其促生植株全氮量的通徑分析Table 4 Path analysis between total nitrogen content and traits in alfalfa

表5 苜蓿根瘤菌各指標的最優多元線性回歸方程Table 5 The optimization multiple linear regression equation of agronomic and quality traits in alfalfa varieties

注： X7=泌酸、X8=代時、X9=固氮酶活性、X10=根瘤數、X11=根瘤重、X12=地上生物量。

Note: X7=acid secretion、X8=era time、X9=enzyme、X10=numbers、X11=weight、X12=plant weight

3 討論

根瘤菌對紫花苜蓿幼苗生長的影響與根瘤菌劑、苜蓿品種以及生長環境密切相關。與此相似，本研究中無論是盆栽試驗還是大田試驗，根瘤菌對紫花苜蓿幼苗的生長受接種菌株和苜蓿品種的影響顯著。多重比較表明，不同菌株對促生植株地上生物量影響差異顯著。其中9株菌株(TD26ⅠB、TD26ⅡA、TD411ⅡA、TD411ⅡB、TF26ⅡB、TF11ⅠB、TF26ⅠA、TF26ⅠB、TF11ⅠA)促生的苜蓿地上生物量較對照顯著增加。根、莖、葉是構成植物生物量的主要因素。本研究中多數接種處理都提高了植物的莖葉生物量，說明接種根瘤菌后有利于植物生物量向莖和葉分布，一是有利于增加植物的同化面積，二是有利于植物通過接種根瘤菌根瘤與根的共生組織為植株提供更多的氮素營養，營養充足也會間接的提高植物抗逆性。本研究中回接菌液促生的苜蓿植株全氮量與對照之間有顯著差異。

試驗分析表明，菌株通過自身泌酸、代時、植株根瘤數來提高促生植株全氮量；通過溶磷、泌酸、植株根瘤重來提高促生植株地上生物量。選擇生長速度快的根瘤菌做促生菌肥對牧草粗蛋白的提高有積極作用。通過直接效應可以看出，溶磷對苜蓿根瘤菌促生植株地上生物量的直接貢獻最大，苜蓿根瘤菌的溶磷、泌酸能力和促生植株根瘤重均能促進苜蓿地上部分的正向積累。溶磷菌的種類和數量及溶磷量受土壤物理結構、有機質含量、土壤類型、土壤肥力、耕作方式和措施等因素的影響[8-9]。微生物的溶磷能力主要是利用菌株自身產生的有機酸通過滲透擴散于周圍，對培養基中的磷酸鈣進行溶解最終形成一個透明圈，以此確定該菌株是否具有溶磷能力[10]，但本試驗未發現菌株泌酸能力與溶磷能力顯著相關性，這一結果與趙小蓉的研究結果一致[11]。也有研究者認為該方法可靠性值得懷疑。因為有些PKO平板上不能產生溶磷圈的菌株經液體培養基振蕩培養可溶解多種形態的磷，同時Shekhar Nautiyal[12]研究指出PKO并非是溶磷微生物溶磷的最佳培養基，建議用NBRIP液體培養基，以上觀點尚待進一步研究。

根瘤菌的競爭結瘤能力是根瘤菌本身的遺傳因素和它長期所處的生態環境共進化的結果。土壤的類型、pH值及其它理化性質也會影響根瘤菌的產酸(堿)及競爭結瘤的能力[13]。有研究者認為高鹽度(NaCl)對根瘤菌數量影響較大，而較低水平的鹽度對根瘤菌數量影響不大，但對固氮酶活性、豆血紅蛋白的含量以及類菌體中蛋白質含量有一定影響[14]。某些根瘤菌能夠產酸產堿，具有改良鹽堿地的作用[15]。某些特殊地理生態環境也會產生一些具有特殊抗性的根瘤菌。如新疆地區根瘤菌的生長繁殖和對寄主的侵染結瘤和固氮作用明顯與其他生態區的根瘤菌有所差異，它們不僅能在高溫、干旱、鹽堿等不利條件下很好的生長繁殖，并且還可以成功侵染寄主植物使結瘤固氮，表現出對環境良好的適應性[16]。楊江科等曾報道泌酸能力強的根瘤菌有較強的抗堿能力[17]，國外有學者報道在低磷狀態下菌株會通過釋放有機酸來促進植株吸收難溶性磷。偏酸和偏堿的環境條件對瘤菌的生長和結瘤均有明顯的抑制作用[18]，國內外學者對根瘤菌抗逆性的研究結果差異較大[19-26]。本試驗發現菌株抗堿能力與其泌酸能力顯著相關，初步認為這就是泌酸能力與植株全氮量、地上生物量顯著相關的原因。菌株生長速度與其競爭能力有一定關系，生長速度快，占領空間和獲得營養的能力強，易在競爭中獲勝，本試驗表明代時與促生植株全氮量顯著相關，符合以上觀點。促生植株的根瘤數與全氮量顯著正相關，根瘤重與地上生物量顯著正相關，但根瘤數與根瘤重通過什么途徑各自影響促生植株全氮量與地上生物量還需進一步研究。

4 結論

菌株促生植株的全氮量與根瘤菌泌酸能力、代時、促生植株根瘤數顯著相關；菌株促生植株地上生物量與菌株溶磷能力、泌酸能力、促生植株根瘤重呈極顯著相關。通過多元線性回歸分析，我們初步建立了苜蓿根瘤菌促生植株全氮量、地上生物量的最優多元線性回歸方程，通過該方程可以為今后大量菌株篩選工作和優異菌株判別提供依據。