液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合譜庫檢索法同時測定飼料中4種黃曲霉毒素

楊琳芬，符金華，姜文娟，邢磊，尹騰桂，董澤民，趙薇娜，樊晶，金海紅

（江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌330096）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合譜庫檢索法同時測定飼料中4種黃曲霉毒素

楊琳芬，符金華*，姜文娟，邢磊，尹騰桂，董澤民，趙薇娜，樊晶，金海紅

（江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌330096）

本文建立了飼料中4種黃曲霉毒素（黃曲霉毒素AFB1、黃曲霉毒素AFB2、黃曲霉毒素AFG1、黃曲霉毒素AFG2）多殘留的液相色譜-三重四級桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（Qtrap-LC-MS/MS）的檢測方法。樣品前處理簡單高效，經(jīng)過80%的乙腈水萃取后，再經(jīng)過SPE小柱凈化。結(jié)果表明：在濃度0.5～50 ng/mL時線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995；添加濃度為1.0～20 ng/mL時，回收率為72.5%～95.7%。在市場上購買了8種品牌飼料，實驗結(jié)果顯示黃曲霉毒素AFB1污染較為嚴(yán)重。該方法采用MRM定量的同時結(jié)合了譜庫檢索進(jìn)一步定性，實現(xiàn)了同時定性和定量檢測分析，對于常規(guī)實驗室準(zhǔn)確定量檢測有著重要參考意義。

黃曲霉毒素；液相色譜；質(zhì)譜；EPI譜庫

霉菌毒素，又稱真菌毒素，是產(chǎn)毒真菌在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。在所有霉菌毒素中，黃曲霉毒素的毒性、致癌性、污染頻率均居高首位，是毒性最強的天然物質(zhì)。可引起人類和動物急性或慢性中毒，部分已證實具有致癌、致畸、致細(xì)胞突變的“三致”作用（朱聰英等，2010；楊靜等，2009）。黃曲霉毒素對飼料質(zhì)量有嚴(yán)重的影響，會導(dǎo)致動物中毒、白細(xì)胞缺乏癥等，還會引起腎中毒、肝中毒、生殖異常以及抑制免疫反應(yīng)，給畜牧業(yè)發(fā)展和畜產(chǎn)品安全造成極大的危害。因此，我國對飼料中各種黃曲霉毒素的限量有著嚴(yán)格要求（GB 2761-2011），最低限量已達(dá)0.5 μg/kg。

目前有關(guān)毒素的檢測方法有酶聯(lián)免疫法（ELISA）、薄層色譜法（TLC）、液相色譜法（HPLC）、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS）等（朱聰英等，2010；楊靜等，2009；魏麗莉，2008；Chiar等，2005；鮑蕾等，2005），這些方法在一定程度上解決了黃曲霉毒素的檢測方法問題，但是存在諸多問題，其中免疫學(xué)法通常作為篩選方法，不能準(zhǔn)確定量，容易出現(xiàn)假陽性；液相色譜法容易受到基質(zhì)干擾，且檢測限很難達(dá)到限量標(biāo)準(zhǔn)的要求；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法往往需要衍生化等步驟，操作繁瑣。以上方法無法對樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量，因此不能作為最終的確證方法。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）是一種集高效分離和多組分定性、定量于一體的系統(tǒng)，對沸點高、不易揮發(fā)和熱不穩(wěn)定化合物的分離和鑒定具有獨特優(yōu)勢，成為近年來分析化學(xué)中發(fā)展非常快的新技術(shù)之一（Markus等，2012；Johannes等，2012；Mira等，2010）。并且該方法檢測時無需衍生化，操作簡單、省時，能夠在保證靈敏度的情況下仍可以達(dá)到在目標(biāo)范圍內(nèi)未知化合物篩選的目的。該方法已成為近年來分析檢測黃曲霉毒素的主要方法，并且已經(jīng)應(yīng)用到黃曲霉毒素的污染檢測當(dāng)中（Micheal等，2009）。

然而，隨著HPLC-MS/MS應(yīng)用的不斷深入和成熟，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在分析檢測復(fù)雜基質(zhì)樣品中的化合物時，除了具有較強抗基體干擾能力、高通量、高選擇性、高靈敏度的同時，也逐步發(fā)現(xiàn)該技術(shù)的一些不足之處。譬如：由于基質(zhì)的復(fù)雜性，會影響目標(biāo)物的離子比例發(fā)生較大變化，從而導(dǎo)致測量結(jié)果為假陰性（Trufelli等，2011）。本實驗采用高效液相色譜-串聯(lián)四級桿/線性離子阱質(zhì)譜方法，該方法具有從多級反應(yīng)檢測（MRM）-信息依賴性采集（IDA）-增強子離子掃描（EPI）-譜庫檢索的獨有檢測模式，該模式原理為：當(dāng)MRM信號超過設(shè)定的閾值（根據(jù)IDA進(jìn)行設(shè)置）時，MRM與EPI會交替進(jìn)行掃描。因此，既可以得到MRM的譜圖，也可以得到EPI二級質(zhì)譜的全部碎片信息，即該化合物的指紋圖譜，進(jìn)一步譜庫檢索達(dá)到同時定性和定量的目的。目前，國內(nèi)外單獨建立黃曲霉毒素的LC-MS/MS譜的較少，本文以4種黃曲霉毒素為例，建立了4種黃曲霉毒素的LC-MS/MS譜庫，并且利用譜庫檢索建立了快速定性和定量分析4種黃曲霉毒素的液相色譜-三重四級桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（Qtrap-LC-MS/MS）的檢測方法。該方法在準(zhǔn)確定量和定性分析飼料中黃曲霉毒素和保證飼料安全品質(zhì)方面具有重要的參考意義。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器和試劑質(zhì)譜型號為Sciex4500 Qtrap（美國Sciex公司）；液相為島津LC-20AD XR（日本Shimadzu公司）；3k30離心機（德國Sigma公司）；MS 3D S25微量振蕩器（德國IKA公司）；NEVAPTM111氮吹儀（美國Organomation Associates Inc公司）；固相萃取裝置（SPE，美國Supelco公司）；METTLER TOLEDO XP 205天平；

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精密稱取5.0 mg黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2對照品，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容，即為50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，置于-18℃冰箱中保存。分別吸取0.2 mL上述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液于10 mL的棕色容量瓶中，用甲醇稀釋到刻度，即為1.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，冷藏保存。

1.2 實驗方法液相色譜法：色譜柱為Kinetex C18，2.6 μm，2.1×100 mm（品牌為phenomenex）；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積1 μL；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈；洗脫程序見表1。

表1 洗脫梯度

質(zhì)譜條件：多級反應(yīng)檢測（MRM）掃描，ESI離子源；氣簾氣30 psi；霧化氣55 psi；輔助霧化器55 psi；溫度550℃；噴霧電壓5500 V；氣體均為氮氣；MRM離子對見表2；當(dāng)MRM響應(yīng)值大于200 cps時同時啟動線性離子阱的EPI功能。EPI掃描范圍：50～350 Da；掃描速度10000 Da/s；動態(tài)填充時間小于5 ms。

1.3 樣品前處理稱取（5±0.1）g飼料樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL 80%的乙腈水溶液，渦旋2 min，劇烈震蕩10 min，離心取上清液，重復(fù)提取一次合并上清液；在合并提取液中加入10 mL正己烷渦旋1 min，待靜止分層，去掉上清液，重復(fù)去脂一次；然后蒸干，用5 mL水復(fù)溶待凈化；復(fù)溶液用SPE小柱凈化，控制流速2 mL/min左右，抽干，搜集流出液，在60℃下氮氣吹干，用1 mL 0.1%的甲酸水（10%的甲醇）復(fù)溶，渦旋5 s，過0.22 μm濾膜上機測試。

表2 MRM離子對列表（1是定量離子）

1.4 LC-MS/MS譜庫的建立實驗分別采用低、中、高3種不同能量（20、35、50 eV）和擴展能量CES（35±15）對4種黃曲霉毒素進(jìn)行EPI掃描，并且用Access編寫4種黃曲霉毒素LC-MS/MS數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的檢出限、回收率、重復(fù)性以及線性范圍將4種黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用空白基質(zhì)依次稀釋成0.5～50 ng/mL的系列濃度進(jìn)行測定。將測得的各種毒素的峰面積的平均值Y與所對應(yīng)的濃度X（ng/mL）做回歸曲線，求得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r），外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，4種毒素在濃度0.5～50 ng/mL有著良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995；在1.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL（n=3）4個不同濃度添加水平下做了回收率實驗，回收率分別是72.5%、80.6%、88.9%、95.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）均小于5.9%；4種毒素的檢出限（信噪比大于3）和定量限（信噪比大于10）結(jié)果見表3。

表3 方法的檢出限、回收率、重復(fù)性以及線性范圍

2.2 質(zhì)譜分析檢測實驗采用蠕動泵注射50 ng/mL的4種毒素混標(biāo)溶液，在正離子模式做一級母離子掃描，得到4種化合物的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，然后采用子離子掃描得到化合物的子離子，在MRM模式下優(yōu)化化合物去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE），優(yōu)化結(jié)果見表2。為了達(dá)到同時定性和定量的目的，本實驗采用了MRM-IDA-EPI-譜庫檢索智能化的多步模式。首先結(jié)合Qtrap的線性離子阱功能，從MRM模式（圖1）獲得化合物的保留時間、峰面積、離子比率等信息，在通過EPI掃描獲得二級質(zhì)譜圖，利用已經(jīng)建立好的譜庫進(jìn)行檢索。這種模式對化合物結(jié)構(gòu)的確認(rèn)有很大幫助。

圖1 四種黃曲霉毒素在混標(biāo)濃度為2 ng/mL的色譜圖

采用該方法對實際陽性可疑樣品進(jìn)行檢測，獲得其MRM圖，然后采用EPI圖進(jìn)行譜庫檢索。其中Fit值（匹配度）是用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)EPI與可疑樣品譜圖進(jìn)行比較后得到的匹配度，滿分為100分，F(xiàn)it值越大說明該化合物的可能性越大；RevFit值（反相匹配度）是用可疑樣品譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品的EPI圖進(jìn)行對比后獲得的匹配度；Purity值（純度值）是綜合前兩種的結(jié)果得出的數(shù)值，所有的匹配結(jié)果可以進(jìn)行排序。從圖1可知該化合物是黃曲霉毒素B1（AFB1）。

2.3 實際樣品檢測采用建立好的方法進(jìn)行樣品分析檢測，在市場上隨機購買8種不同品牌的飼料進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品普遍存在黃曲霉毒素的污染，尤其是黃曲霉毒素B1污染較為嚴(yán)重，結(jié)果見表4。實驗結(jié)果表明，該方法能滿足我國對飼料中黃曲霉毒素污染進(jìn)行監(jiān)控的需要。

表48 種飼料樣品中黃曲霉毒素的含量（N/A表示未檢出）μg/kg

3 結(jié)論

本文建立了飼料中4種黃曲霉素毒素的高效液相色譜-三重四級桿/離子阱質(zhì)譜的分析方法，結(jié)合自建的4種黃曲霉毒素LC-MS/MS標(biāo)準(zhǔn)譜庫，采用MRM-IDA-EPI-譜庫檢索的多步模式，成功實現(xiàn)了4種毒素的快速定性和定量分析。該方法前處理簡單、快速、回收率高、準(zhǔn)確度高、方法穩(wěn)定性好，可滿足對飼料中黃曲霉毒素的殘留檢測分析要求。

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In this paper，we established 4 kinds of Aspergillus flavus toxin in the feed（Aspergillus flavus toxin AFB1，aflatoxin AFB2，Aspergillus flavus toxin AFG1，Aspergillus flavus toxin AFG2）multi residue liquid phase chromatography triple four rod/linear ion trap tandem detecting method of mass spectrometry（Qtrap-LC-MS/MS）.The samples pretreatment was simple and efficient.The samples were extracted by 80%acetonitrile water and purified by SPE column.The results showed that in the concentration of 0.5～50 ng/mL linear good，the correlation coefficient was greater than 0.995；the concentration of 1～20 ng/mL，the recovery rate of 72.5%～95.7%.In the market to buy 8 kinds of brand feed，the experimental results show that aflatoxin B1pollution was more serious.The method adopts MRM quantitative analysis and combines with the further qualitative analysis of the spectral library search.It can realize both qualitative and quantitative analysis.It has important reference value for the accurate and quantitative detection of the conventional laboratory.

aflatoxin；liquid chromatography；mass spectrometry；EPI library

S816.17

A

1004-3314（2017）14-0028-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171407

*通訊作者