大方臭豆腐中高產納豆激酶菌株的分離鑒定

高澤鑫，何臘平，2*，劉亞兵，高冰，李翠芹，劉涵玉

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州貴陽550025；3.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北武漢430068；4.貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽550025）

大方臭豆腐中高產納豆激酶菌株的分離鑒定

高澤鑫1，何臘平1，2*，劉亞兵1，高冰3，李翠芹4，劉涵玉1

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州貴陽550025；3.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北武漢430068；4.貴州大學化學與化工學院，貴州貴陽550025）

該實驗對從大方臭豆腐中分離純化得到的8株產納豆激酶菌株進行了研究，通過纖維蛋白平板法對其產納豆激酶能力的測試，篩選出一株酶活力達到5 435.39 IU/g的高產納豆激酶菌株GUYR02。對該菌株的菌株形態、生理生化特征、16S rDNA序列分析以及系統發育樹分析，鑒定菌株GUYR02為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

大方豆腐；納豆激酶；篩選；鑒定；解淀粉芽孢桿菌

納豆起源于中國的秦漢時期，是傳統的發酵食品，唐朝時期傳入日本，食用歷史已有1 000年以上[1]。納豆類似中國的發酵豆和豆豉，主要經枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發酵而來，日本將納豆作為調味品和營養食品，國人把豆豉用鍋蒸后或炒后作為調味料[2]。日本學者SUMI H等[3]于1987年首次對納豆及其提取物首次作了系統研究，最初將酶的提取物添加到纖維蛋白平板上，發現有明顯的溶栓作用，并確定其屬于具有纖溶活性的激酶。

人類的健康常年受到血栓疾病的威脅，全球每年因患血栓類疾病死亡的人數多達1 200萬，其中中國約占總數的1/5[4]，因此溶栓藥物的開發成為了研究的熱點。由于納豆激酶具有高效溶栓作用，因此受到了廣泛的關注[5]。納豆激酶的來源有很多，如日本納豆食品[6]、一些海洋生物[7]、韓國醬油[8]、臺灣的土壤[9]、中國的豆豉[10]和亞洲發酵蝦醬等[11]。據報道納豆激酶可以降低纖維蛋白原、促進催化血纖維蛋白溶酶原轉化為血纖維蛋白溶酶、增加體內血栓溶解因子的合成的作用[12]。目前，許多研究人員的重點在對高產納豆激酶菌株的分離篩選、納豆激酶的純化和鑒定新發現的纖溶酶[13-15]。本研究從我國傳統食品臭豆腐中篩選出一株高產納豆激酶菌株，并采用菌株形態特征、生理生化實驗和16SrDNA測序對菌株進行鑒定，為納豆激酶的生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

臭豆腐：貴州省大方縣市售；黃豆：市售有機黃豆（非轉基因）。

1.1.2 試劑

牛凝血酶、牛纖維蛋白原：沈陽拜英生物技術有限公司；尿激酶（1 240 IU/瓶）：中國藥品生物制品檢定所；溶菌酶：北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

初篩培養基（酪蛋白平板）：5 g/L干酪素，1 g/L葡萄糖，1 g/L酵母膏，1 g/L K2HPO4，0.5 g/L KH2PO4，0.1 g/L MgSO4，20 g/L瓊脂，pH 7.0～7.5，121℃滅菌20 min。

斜面培養基（LB培養基）：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，20g/L瓊脂，pH7.0～7.5，121℃滅菌20min。

液體種子培養基：10 g/L葡萄糖，5 g/L酵母提取物，10 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，pH 7.0～7.5，121℃滅菌20 min。

固態發酵培養基：黃豆清洗干凈，加入3倍體積的去離子水浸泡，常溫浸泡14～18 h，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-10超凈工作臺：蘇州凈化有限公司；LS-B75L立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫療設備有限公司；101-1ASB電熱鼓風干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；DW-86L286立式超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡：上海新苗醫療器械制造有限公司；pHS-3CpH計：成都世紀方舟科技有限公司；SPX生化培養箱：上?？坪銓崢I發展有限公司；HYG-A全溫搖瓶柜：太倉市實驗設備廠；S1000TM聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Thermal Cycler公司；Gel Doc XR凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；Micro 17R微量高速冷凍離心機：美國Thermo Electron公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產納豆激酶菌株的分離與初篩

將臭豆腐切碎制成樣品懸液用8.5%的生理鹽水10倍梯度稀釋，取10-7、10-8、10-9三個稀釋度涂布于酪蛋白平板上。納豆激酶是一種堿性絲氨酸蛋白酶，可水解酪蛋白平板形成透明圈，根據這一特性在37℃條件下倒置培養24 h后挑取出8株形態不同且有明顯透明圈的菌落，在新的酪蛋白平板上進行劃線，純化3代后，接種到斜面培養基上于4℃冰箱保存備用。用接種環挑選2～3環斜面培養基上的菌苔接種到液體種子培養基中，于37℃、180r/min的條件下培養24 h。培養完成后于4℃、10 000×g離心10 min，即得粗酶液。用直徑為2 mm的無菌膠頭吸管在酪蛋白培養基上均勻打孔，每平板均勻打3孔，取10μL離心后粗酶液注入平板孔（三孔為一組平行），平板放于37℃恒溫培養18 h，培養結束后測量平板孔水解透明圈面積（mm2），選取水解透明圈面積最大的3株菌種進行復篩。

1.3.2 原料預處理與固態發酵粗酶液的制備

挑選顆粒飽滿、無蟲咬、無霉爛、無畸形、色澤淡黃的市售有機黃豆，去離子水沖洗，直至無雜物，豆水質量比1∶3浸泡14～18 h后，分裝入三角瓶各25 g放在高壓蒸汽滅菌鍋中蒸煮20min，隨即取出放入無菌操作臺內進行冷卻。挑取初篩得到的3株菌種2～3環菌苔接種到液體種子培養基中，于37℃、180 r/min的條件下培養18 h，然后按4%的接種量接種到滅菌的固態發酵培養上，在37℃條件下培養36 h，每12 h攪拌一次。稱取2 g發酵完成的納豆溶于4 mL無菌的生理鹽水中，4℃條件下浸提24 h，用玻璃棒搗碎經12 000×g離心10 min，再向離心管加入2 mL生理鹽水搗碎離心，上清液即為固態發酵粗酶液。

1.3.3 高產納豆激酶菌株的復篩

（1）纖維蛋白原平板的制作

納豆激酶活性的測定采用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法[16]。首先將1%的瓊脂糖溶于0.05mol/L的Tris-HCl（pH 7.8）緩沖溶液中，加熱至完全溶解后，取出18 mL置于大試管中，待其冷卻至55℃左右，迅速倒入2 mL的牛血纖維蛋白原溶液（1.5 mg/100 mL），不斷振蕩使其完全混合均勻，注入直徑9 cm的培養皿中，再迅速加入1 mL牛凝血酶溶液（1 000 U溶于100mL生理鹽水），不斷晃動平皿使三者混合均勻，靜置1h后，用直徑為2mm的無菌膠頭吸管在平板上均勻打4孔。

（2）尿激酶標準曲線的制作

參照楊明等[17]對瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測定納豆激酶活力方法進行的改進。尿激酶標準曲線的制作：將尿激酶標準品分別配制為248 IU/mL、496 IU/mL、744 IU/mL、992 IU/mL和1 240 IU/mL，各取10 μL點樣于新配制的纖維蛋白原平板孔中（四孔為一組平行），放置10 min，37℃培養16 h后取出，測定溶解圈的直徑，計算各溶解圈面積。以溶解圈的面積（x，mm2）為橫坐標，以尿激酶酶活（y，IU/mL）為縱坐標，繪制尿激酶標準曲線。

（3）納豆激酶酶活力測定

取納豆激酶固態發酵粗酶液10 μL點樣于纖維蛋白平板上（四孔為一組平行），放置10 min，移入37℃培養箱，保溫16 h后取出，用游標卡尺測定溶解圈的直徑并計算各溶解圈面積，根據尿激酶標準曲線回歸方程計算樣品納豆激酶酶活。

1.3.4 高產納豆激酶菌株的鑒定

（1）菌種形態鑒定

將復篩得到的納豆激酶酶活最高的一株菌，在酪蛋白平板上畫線，37℃培養24 h，觀察單菌落形態，對該菌株進行革蘭氏染色，觀察菌體形態。

（2）生理生化鑒定

根據第八版《伯杰細菌鑒定手冊》[18]對菌株進行生理生化鑒定。將菌株接入細菌微量生化反應管，37℃條件下培養12 h，考察對色氨酸、丙酮酸鹽、Kohn明膠、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、密二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖的利用情況。

（3）樣品中DNA提取

將復篩得到的納豆激酶酶活最高菌株接種于液體種子培養基，于37℃、180 r/min的條件下培養18 h。將培養液置于2 mL離心管，10 000×g離心6 min，重復兩次收集沉淀，取上述沉淀加入300 μL溶菌酶（質量濃度50 mg/mL），置于37℃水浴1h，后使用細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取。

（4）16S rDNA序列鑒定

擴增使用的上游引物為27F（AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT），下游引物為1492R（TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC）。25 μL聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）體系為模板DNA 2 μL；27F 2.5 μL；1492R 2.5 μL；GoTaqGreen Master Mix（2×）12.5 μL；去離子水5.5 μL。反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性1 min，退火溫度從65℃降至55℃，每個循環降低0.5℃，退火時間為3 s，72℃延伸1 min，35個循環；恒定退火溫度下進行94℃變性1min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min。將PCR產物送上海生工公司測序，登錄美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）將所得序列結果與數據庫中的已知序列進行相似性比對，采用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 產納豆激酶菌株的分離與初篩結果

通過在酪蛋白平板上稀釋涂布分離出8株菌落形態不同且具有明顯水解酪蛋白能力的菌株，分別編號為GUYR01、GUYR02、GUYR03、GUYR04、GUYR05、GUYR06、GUYR07、GUYR08。

在已經完成菌株分離純化的基礎上，將菌種進行初篩實驗，測量透明圈直徑計算水解透明圈面積，初篩結果見表1。

表1 產納豆激酶菌株初篩結果Table 1 Results of preliminary screening of nattokinase-producing strains

由表1可知，8株菌種溶解蛋白能力從高到低依次是：菌株GUYR02、GUYR05、GUYR04、GUYR01、GUYR07、GUYR06、GUYR03、GUYR08。其中菌株GUYR02、GUYR05、GUYR04的水解透明圈面積分別為（198±14.7）mm2、（190±12.6）mm2、（176±17.3）mm2明顯高于其他5株菌，所以選取水解透明圈面積最大的這3株菌種進行復篩。

2.2 高產納豆激酶菌株的復篩結果

2.2.1 尿激酶標準曲線

以溶解圈的面積（x，mm2）為橫坐標，以尿激酶酶活（y，IU/mL）為縱坐標作尿激酶標準曲線，結果見圖1。

圖1 尿激酶標準曲線Fig.1 Standard curve of urokinase

由圖1可知，尿激酶標準曲線回歸方程為y=4.201 6x－10.874，相關系數為R2為0.999 4。結果表明，二者線性關系良好。

2.2.2 產納豆激酶活力結果

將酪蛋白平板初篩得到的菌株GUYR02、GUYR05、GUYR04進行納豆固態發酵，離心取上清液10 μL點樣于纖維蛋白平板上，37℃條件下培養16 h后用游標卡尺測量溶解圈直徑，得出溶解圈面積并放入尿激酶標準曲線回歸方程進行計算，結果如表2所示。

表2 復篩菌株納豆激酶活力Table 2 Nattokinase activities of secondary screening strains

由表2可知，通過瓊脂糖-纖維蛋白原平板法得到的3株納豆芽孢桿菌的納豆激酶活力分別為5 435.39 IU/g、4 813.55 IU/g和4 578.26 IU/g。國內外有關篩選產納豆激酶菌株酶活力的報道多數為100～3 000 IU/g，還有部分較高納豆激酶酶活力的報道為3000～5000IU/mL[19-23]。另外，夏麗等[24]經過紫外誘變篩選的高產菌株U-5納豆激酶活力均穩定在5 440.37 IU/mL以上。董艷山等[25]以豆粕粉為氮源優化搖瓶發酵再通過7 L發酵罐使納豆激酶活性達到6 717 IU/mL。與國內文獻報道的酶活比較，本試驗所分離篩選菌株GUYR02的納豆激酶活力高達5 435.39 IU/g，屬于高產納豆激酶菌株。

2.2.3 高產納豆激酶菌株GUYR02的鑒定

（1）形態鑒定

菌株GYYR02在酪蛋白平板的單菌落形態和革蘭氏染色菌體形態見圖2。由圖2A可知，菌株GUYR02菌落在酪蛋白平板上形成圓形、扁平、有黏性的小菌落，其顏色為乳白色，邊緣規則，較濕潤，稍隆起，不透明。由圖2B可知，該菌株革蘭氏染色菌體紫色，為革蘭氏陽性菌，桿狀。

圖2 菌株GUYR02的菌落形態(A)及細胞形態(B)Fig.2 Colonial morphology(A)and cell morphology(B)of strain GUYR02

（2）生理生化鑒定

對篩選出菌株GUYR02進行了部分生理生化特征試驗，結果見表3。

表3 菌株GUYR02生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain GUYR02

由表3可知，菌株GUYR02能發酵丙酮酸鹽、Kohn明膠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖，不能發酵色氨酸、肌醇、鼠李糖、蜜二糖、苦杏仁苷和阿拉伯糖。

（3）16S rDNA序列分析及基因系統發育分析

菌株GUYR02PCR產物擴增電泳圖見圖3，通過MEGA 5.0軟件進行系統進化樹的構建系統發育樹結果見圖4。

由圖3可知，PCR產物擴增片段送上海生工基因公司測序，測序結果顯示菌株GUYR0216SrDNA全長1476bp。

由圖4可知，BLAST分析結果顯示該基因同解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16S rDNA基因相似度達到99%。該系統樹以萊西式菌（Laceyella tengchongensis）（FJ426598）作為一個單獨的外群種，其中GUYR02菌株與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌株在同一分支，結合前面的形態學和生理生化鑒定結果，最后鑒定菌株GUYR02為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物Fig.3 PCR amplification products identified by agarose gel electrophoresis

圖4 菌株GUYR02的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain GUYR02

3 結論

本研究從貴州大方縣臭豆腐中分離篩選出一株高產納豆激酶菌株GUYR02，其在37℃、pH 7.0、培養36 h的固態發酵條件下，其納豆激酶產量可高達5 435.39 IU/g。通過對該菌株的細胞形態、菌落形態、生理生化特征、16SrDNA序列分析以及系統發育分析，可以鑒定菌株GUYR02為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）。由于菌株GUYR02為野生菌未做培養優化，相對其他工程菌有更大的上升空間。若對其發酵原料和工藝進行優化，提高其產納豆激酶的發酵性能，這將能明顯改善現在國內工程菌生產納豆激酶的產量不足和產納豆激酶菌株種類過于單一的研究現狀。有利于可持續發展和溶栓藥物產業體系的構建，對擴大納豆激酶產能和解淀粉芽孢桿菌的綜合利用范圍具有積極意義。

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Screening and identification of strains with high yield nattokinase form Dafang stinky tofu

GAO Zexin1,HE Laping1,2*,LIU Yabing1,GAO Bing3,LI Cuiqin4,LIU Hanyu1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store&Processing of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China;3.College of Bioengineering and Food Science,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China;4.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University, Guiyang 550025,China)

Eight nattokinase-producing strains separated from Dafang stinky tofu were investigated in the study.The ability to produce natto kinase of the strains was determined by fibrinogen plate method,and a high yield nattokinase strain GUYR02 with enzyme activity of 5 435.39 IU/g was screened.By morphology,physiological and biochemical characteristics,16S rDNA sequence and phylogenetic tree analysis,the strain GUYR02 was identified asBacillus amyloliquefaciens.

Dafang stinky tofu;nattokinase;screening;identification;Bacillus amyloliquefaciens

Q939.97

0254-5071（2017）07-0058-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.013

2017-05-01

貴州省重大專項（黔科合重大專項字[2015]6004-5號）；貴州省農業攻關項目（黔科合支撐[2016]2580號）

高澤鑫（1993-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物。

*通訊作者：何臘平（1972-），男，教授，博士，研究方向為發酵工程、生物催化與生物轉化。