海洋生淀粉酶菌株發酵條件響應面優化

周新尚，逄飛，竇少華*，任楠楠，張慶芳

（1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物生物工程技術研究中心，遼寧大連116622）

海洋生淀粉酶菌株發酵條件響應面優化

周新尚1，2，逄飛1，2，竇少華1，2*，任楠楠1，2，張慶芳1，2

（1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物生物工程技術研究中心，遼寧大連116622）

生淀粉酶是催化淀粉直接水解的酶類，其可廣泛應用于食品、工業、醫學等領域。該研究首先利用單因素試驗研究發酵時間、發酵溫度，發酵初始pH、裝液量、接種量對生淀粉酶活的影響，并在此基礎上利用響應面法設計試驗，優化了海洋生淀粉酶菌株ZXS-1的發酵條件。結果表明，其最佳發酵條件為發酵時間38 h，發酵溫度25℃，初始pH 7。在此最佳發酵條件下，生淀粉酶酶活可達445.2 U/mL，較優化前提高25.6%。

生淀粉酶；發酵條件優化；響應面法

生淀粉酶是指對不經過蒸煮糊化的生淀粉顆粒能夠表現出水解活性的酶類[1]。由于生淀粉酶能將未經蒸煮糊化的生淀粉直接轉化成葡萄糖等可發酵性糖供微生物生長與代謝，其比傳統的高溫蒸煮糖化節約25%～30%的能耗。如果將其應用于無蒸煮的酒精發酵[2]，可節約總能耗的30%～40%。也可以利用生淀粉酶酶解生淀粉生成多孔淀粉[3]，正是由于生淀粉酶具有的潛在的工業應用價值和某些特殊用途，因此一直受到國內外許多研究人員的關注。日本三得利公司酶解未糊化的玉米淀粉發酵生產酒精；姚衛蓉等[4]利用生淀粉酶酶解生淀粉生成多孔淀粉，將其作為微膠囊、芯材、吸附劑等。目前，國內外研究大部分是基于陸地環境生淀粉酶菌株的篩選、酶的分離純化及酶學性質研究[5-9]，從海洋篩選生淀粉酶菌株少見于報道。若能充分研究并分析海洋生淀粉酶的性質，將為社會帶來巨大的科研和經濟效應。

本研究對大連黃海海泥中分離出一株生淀粉酶高產菌假單胞桿菌（Pseudomonassp.）ZXS-1，通過單因素試驗和響應面設計試驗優化其發酵條件[10-11]，首先基于Plackett-Burman（P-B）試驗設計找出重要影響因子，然后經Design-Expert.V8.0.6軟件中響應面Box-Behnken試驗設計對響應過程變量進行數學建模及分析，進一步優化響應因子，確定最優發酵條件[12-13]，目的是提高生淀粉酶的活力，從而為該海洋生淀粉酶更深入研究及中試實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株ZXS-1：分離自大連黃海海泥；蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、生玉米淀粉、牛肉膏、葡萄糖、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸鎂、瓊脂粉：生物工程上海股份有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設備

HZP-250全溫振蕩培養箱、DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；LTI-700低溫恒溫培養箱：上海愛朗儀器有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；UV-2102C紫外可見分光光度計：龍尼柯儀器有限公司；LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌器：上海審安醫療器械廠；GRX-02A干熱滅菌箱：上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基

種子培養基：蛋白胨12 g/L，酵母膏6 g/L，葡萄糖2 g/L，K2HPO42 g/L，pH 7.0。1×105Pa滅菌30 min。

發酵培養基：玉米淀粉12 g/L（160℃干熱滅菌2 h），蛋白胨5 g/L，牛肉膏6 g/L，NaCl 15 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 7.0；1×105Pa滅菌30 min。

1.3.2 培養方法

將斜面保藏菌種活化，將處于對數期菌種按2%的接種量轉接至裝液量為150 mL/500 mL的三角瓶中，于25℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養32 h。

1.3.3 生淀粉酶粗酶液制備

將上述于25℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養32 h的發酵液于4℃、8 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.3.4 生淀粉酶酶活測定方法

生淀粉酶酶活測定參照OKOLO B N等[14]的方法。反應體系如下：2%的生淀粉溶液2.0 mL加入25 mL具塞比色管，添加pH6.4檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液2mL，30℃預熱10 min，加入1.0 mL酶液，于30℃恒溫振蕩（180 r/min）反應10 min后，加入3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）試劑2 mL終止反應；搖勻，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20 mL。以滅活的酶液管作為空白調零點，在波長520 nm處比色測定吸光度值。生淀粉酶酶活單位定義：在分析條件下，1 min釋放1 μg的還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位（U/mL）。還原糖以葡萄糖為標準，采用DNS法進行測定[15]。

1.3.5 單因素試驗

在發酵培養基一致的條件下，控制發酵時間分別為4h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、66 h，發酵溫度分別為4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，培養基初始pH分別為3.0、4.0、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0、8.0，裝液量分別為75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL、150 mL/250 mL、175 mL/250 mL、200 mL/ 250mL，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%，測定生淀粉酶活力，研究發酵時間、發酵溫度、初始pH、裝液量及接種量對菌株產生淀粉酶的影響[16]。

1.3.6 發酵條件響應面優化

在單因素試驗的基礎上，以生淀粉酶酶活（Y）為響應值，選取對其影響顯著的因素以及因素較好的水平區間，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用響應面分析法對發酵參數進行優化，獲得最優發酵條件組成。每組試驗重復3次，結果取其平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵時間對產酶的影響

圖1 發酵時間對酶活的影響Fig.1 Effect of fermentation time on enzyme activity

由圖1可知，發酵時間在0～24 h時，生淀粉酶活快速增加；發酵時間在36 h時，酶活達到最大，為449 U/mL；發酵時間＞36h之后，生淀粉酶活有所下降。這可能與底物消耗和有害物質的積累產生的負面影響有關，所以選擇36 h為最優發酵時間。

2.1.2 發酵溫度對產酶的影響

圖2 發酵溫度對酶活的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on enzyme activity

由圖2可知，發酵溫度在5～15℃時，生淀粉酶的酶活隨發酵溫度的升高迅速增加；發酵溫度在25℃時，其生淀粉酶酶活性最高，為442 U/mL；發酵溫度＞25℃之后，隨著溫度的增加酶活性開始下降，這主要是由于菌體在溫度過高過低時都不利于其生長及產酶。因此選擇發酵溫度為25℃。

2.1.3 發酵初始pH對產酶的影響

由圖3可知，在初始pH值3～5的酸性范圍內，酶活性隨初始pH值的增加而增加，但酶活性較低，可能是因為菌株本身不耐酸，也可能是在發酵過程中其自身也產生酸加劇的酸性環境導致不利于產酶和酶活性。初始pH值在5～7范圍內，酶活性迅速增加；初始pH值為7時，酶活性達到最大，為437 U/mL；初始pH值＞7之后，隨初始pH的增加酶活降低。因此pH值為7是最優發酵初始pH。

圖3 初始pH對酶活的影響Fig.3 Effect of initial pH on enzyme activity

2.1.4 裝液量對產酶的影響

圖4 裝液量對酶活的影響Fig.4 Effect of loaded volume on enzyme activity

由圖4可知，裝液量為（75～125）mL/500mL時，生淀粉酶酶活隨著裝液量增加而增高；裝液量為125mL/500mL時，發酵酶活最高，為425U/mL；裝液量＞125mL/500mL之后，通氣量逐漸減少，生淀粉酶酶活呈下降趨勢。因此選擇裝液量為125 mL/500 mL。

2.1.5 接種量對產酶的影響

圖5 接種量對酶活的影響Fig.5 Effect of inoculum size on enzyme activity

由圖5可知，接種量在接1%～2%的種子液時，酶活隨接種量增加而較快地增加；當接種2%～4%種子液時，酶活增加速度相對減慢；當接種量達到4%時，酶活性最大，為424 U/mL；接種量＞4%之后，隨著接種量的增加，酶活緩慢開始下降，可能是因為通氣量和底物等因素的限制，發酵液中的菌體數量不宜過多。因此確定4%為最佳發酵接種量。2.2 Plackett-Burman試驗設計結果

響應面法優化發酵工藝是目前優化反應條件和加工工藝參數最常用的方法，而且在很多試驗中取得了顯著的效果[17-18]。在單因素試驗的基礎上，選用N=8的Plackett-Burman設計對生淀粉酶發酵條件中的5個因素的顯著性進行考察，試驗因素與水平見表1，設計及結果表2，利用Design-Expert V8.0.6軟件進行主效應分析，結果見表3。由表3中的P值和貢獻值可見，發酵溫度、發酵時間、發酵初始pH對酶活貢獻最大，其對酶活的貢獻大小為發酵溫度＞發酵時間＞發酵初始pH，而裝液量和接種量對酶活貢獻相對較小。因此選發酵溫度、發酵時間、發酵初始pH為評價因素設計響應面優化試驗。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design

表2 Plackett-Burman試驗結果Table 2 Results of Plackett-Burman experiments

表3 各因素主效應分析Table 3 Main effects analysis of each factor

2.3 最陡爬坡試驗研究最大響應區域

在PB試驗基礎上，將發酵時間和溫度的值按照步長依次增大，pH按照步長逐步減小進行最都爬坡試驗設計，試驗設計和結果見表4。

表4 最陡爬坡試驗設計結果Table 4 Results of the steepest ascent experimental design

由表4可知，第2組試驗，當發酵時間為36 h，發酵初始pH值為7，發酵溫度為25℃時，酶活最大。所以選擇以第2組試驗作為中心組合試驗的中心點，進行中心組合試驗設計。

2.4 響應面設計分析結果

2.4.1 Box-Behnken試驗設計

表5 Box-Behnken試驗設計及結果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

運用Design-Expert V8.0.6軟件，以酶活（Y）為響應值，對X1發酵時間、X2pH和X3發酵溫度這3個最顯著因素進行3因素3水平的中心組合試驗設計，設計結果與響應值見表5。

2.4.2 回歸模型建立與方差分析

運用Design-Expert V8.0.6軟件對中心組合試驗數據（見表5）進行回歸模型方差分析，結果見表6。對各因素進行二次多項式回歸擬合后，得到回歸方程：

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

由表6可知，該回歸模型的影響達到極顯著水平（P＜0.01），其自變量X1，X3，X2X3，X12，X22，X32對響應值影響顯著（P＜0.05），其他項影響均不顯著（P＞0.05）。失擬項表示所用模型與試驗的擬合程度，該設計失擬項P值為0.460 8＞0.05，因而無失擬因素存在?；貧w方程的決定系數R2= 0.989 7＞0.9，校正決定系數R2（Adj）為0.971 2＞0.9，表明響應值變化有98.97%來源于所選變量，說明模型擬合度較好，該回歸方程可用于代替試驗真實點對試驗結果進行初步分析和預測。

2.5 響應面最優結果分析

為了進一步研究相關變量間的交換作用以及確定最優點，通過Design-Expert V8.0.6軟件繪制響應面曲線圖進行可視化分析，結果見圖6。3組以生淀粉酶酶活為響應值的趨勢圖，其等高線圖可直觀反應出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。圖6A，圖6B等高線均呈橢圓形，表明兩因素交互作用均顯著，圖6C等高線接近圓形，交互作用不顯著；并且發酵時間與發酵溫度，發酵時間與pH的交互作用最強。

由圖6可知，響應值存在最大值，經軟件分析獲得酶活預測值最大時對應的發酵條件為：發酵時間37.9 h，發酵溫度25.2℃，pH 7.1，軟件分析預測最大酶活為450.4U/mL。為方便實際操作，修改最佳發酵條件為發酵時間38h，發酵溫度25℃，pH7，重復3次驗證試驗，平均酶活為445.2U/mL，與理論值符合良好，表明采用響應面法優化得到的最佳條件準確可靠。

圖6 發酵時間、初始pH與發酵溫度交互作用對酶活的響應曲面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,initial pH and fermentation temperature

3 結論

以單因素試驗為基礎采用響應面法對生淀粉酶菌株ZXS-1發酵條件進行研究，得到最優發酵條件為發酵時間38h，發酵溫度25℃，pH7。在此最佳發酵條件下，生淀粉酶酶活達到445.2 U/mL，比優化之前提高了25.6%。

假單胞桿菌（Pseudomonassp.）ZXS-1最適生長溫度為25℃，根據MORITA R Y[19]對低溫微生物的定義，該菌株屬于耐冷菌，發酵粗酶液最適作用溫度為25℃，屬于低溫酶。海洋環境低溫、高鹽、高壓，菌株ZXS-1與其他國內外篩選的生淀粉酶的菌株相比[20]，具有適應低溫環境（25℃），耐鹽性極好，耐高壓等優良特征。海洋生淀粉酶對無蒸煮的酒精發酵和性質不穩定的多孔淀粉制備更具有優勢。因此，對該菌株發酵條件的研究，可為其進一步發酵放大乃至工業化生產提供理論基礎。

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Optimization of fermentation conditions of marine raw starch amylase strains by response surface method

ZHOU Xinshang1,2,PANG Fei1,2,DOU Shaohua1,2*,REN Nannan1,2,ZHANG Qingfang1,2
(1.School of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,China; 2.Liaoning Technology of Marine Microbiological Engineering Research Center,Dalian 116622,China)

Raw starch amylase is an enzyme that catalyzes starch directly,which is widely used in food,industry,medicine and other fields.In this study,the effects of fermentation time,temperature,initial pH,loaded volume and inoculum on the activity of raw starch amylase were researched by single factor experiments.On the basis of this,the fermentation conditions of the marine raw starch amylase strain ZXS-1 were optimized by response surface method.The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows:fermentation time 38 h,temperature 25℃and initial pH 7.Under the conditions,the activity of raw starch amylase was up to 445.2 U/ml,which was 25.6%higher than that of before the optimization.

raw starch amylase;optimization of fermentation conditions;response surface method

TQ920.6

0254-5071（2017）07-0080-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.018

2016-12-23

國家高技術研究發展計劃‘863計劃’項目（No.2014AA093512）；遼寧省自然科學基金項目（No.2014020134）

周新尚（1990-），男，碩士研究生，研究方向為微生物工程及酶工程。

*通訊作者：竇少華（1979-），男，副教授，博士，研究方向為微生物工程及酶工程。