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一株植物乳桿菌的分離鑒定及應用

2017-07-31 23:58:10劉宗敏周紅麗譚興和李清明王鋒郭紅英劉楚岑姚荷王欄樹嚴欽武
中國釀造 2017年7期

劉宗敏,周紅麗,譚興和*,李清明,王鋒,郭紅英,劉楚岑,姚荷,王欄樹,嚴欽武

(1.湖南農業大學食品科技學院,湖南長沙410128;2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室,湖南長沙410128;3.湖南佳宴食品有限公司,湖南長沙410123;4.湖南插旗菜業有限公司,湖南岳陽414207)

一株植物乳桿菌的分離鑒定及應用

劉宗敏1,2,周紅麗1,2,譚興和1,2*,李清明1,2,王鋒1,2,郭紅英1,2,劉楚岑1,2,姚荷1,2,王欄樹3,嚴欽武4

(1.湖南農業大學食品科技學院,湖南長沙410128;2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室,湖南長沙410128;3.湖南佳宴食品有限公司,湖南長沙410123;4.湖南插旗菜業有限公司,湖南岳陽414207)

從湖南自然發酵的酸豇豆中分離出一株疑似乳酸菌菌株L4,提取其16S rDNA,并經測序、同源性分析和系統發育樹構建等,對其屬種進行鑒定。結果表明,菌株L4為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。通過耐鹽、耐酸和降解亞硝酸鹽實驗發現,菌株L4可在10%食鹽含量條件下生長,耐受pH 2.5,對亞硝酸鹽的降解率高達99%。接種菌株L4發酵蘿卜干,以自然發酵蘿卜干為對照,對發酵蘿卜干進行感官評定初步探究該菌株發酵蘿卜干的特性。結果表明,菌株L4可以縮短蘿卜干發酵周期,提高發酵蘿卜干感官評分。關鍵詞:酸豇豆;分離鑒定;植物乳桿菌;發酵

酸菜是一種腌制方法比較簡單的蔬菜腌制品,全國各地都產酸菜。乳酸菌是酸菜制作中重要的微生物,不同乳酸菌在其發酵過程中起到不同的作用[1-2]。蔬菜經過乳酸菌的發酵作用會呈現出特殊的風味,因地域不同特色各異。我國幅員遼闊,具有地方特色的傳統發酵蔬菜眾多,這些發酵蔬菜可以作為優良乳酸菌菌株的分離源[3-6]。傳統酸菜一般是蔬菜經過自然發酵而成,其口味純正[7],但往往發酵周期長,工業化生產較困難。乳酸菌在食品發酵業上有重要的應用[8],從自然發酵酸菜中分離出相關乳酸菌并對其進行研究成為一種趨勢[9]。目前鑒定乳酸菌較為普遍的方法有傳統的表型、生理生化方法和分子鑒定方法,傳統鑒定方法中影響操作的因素較多,易造成鑒定結果不夠準確。隨著分子生物學的發展,分子鑒定的方法被越來越多的采用[10]。16S rDNA序列分析是一種分子水平上鑒定乳酸菌的常用方法,因16S rDNA序列具有高度保守性,這種方法用于菌種鑒定的結果較準確[11-12]。

本研究從湖南自然發酵酸豇豆中分離乳酸菌,并對其進行16S rDNA序列分析。測定乳酸菌的耐鹽、耐酸和降解亞硝酸鹽特性,并將其接種發酵蘿卜干,以期為乳酸菌的應用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸豇豆樣品:采集自湖南省鳳凰縣吉信鎮,樣品采集后,放入無菌取樣瓶,并置于冰箱低溫(0~4℃)儲存,用于實驗室菌種分離鑒定工作;MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基:廣東環凱微生物科技有限公司;Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA Ladder Mix maker:生工生物工程(上海)股份有限公司;A038亞硝酸鹽測試盒:南京建成生物工程研究所;蘿卜干:湖南佳宴食品有限公司;道道全純正菜籽油:道道全糧油股份有限公司;海藻碘鹽(食品級):湖南省湘澧鹽化有限責任公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-SG46-280S高溫滅菌鍋:上海博訊醫療設備廠;UV-1750紫外-可見分光光度計:上海元析儀器有限公司;DYCP-31DN DNA電泳槽、DYY-5穩壓電泳儀:北京六一儀器廠;FR980凝膠成像儀:上海復日科技儀器有限公司;SS-450離心機:湘潭離心機配件廠;SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺:蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

取酸豇豆鹵水進行10倍梯度法稀釋,選取10-2、10-3、10-4和10-54個稀釋度,向平板中加入1 mL稀釋液,再傾入冷卻至55℃左右的含有2%碳酸鈣的MRS瓊脂培養基混勻[13],在30℃倒置培養36~48 h后,挑取有較大溶鈣圈的單菌落,進行10倍梯度稀釋法純化培養3~4次,挑選乳白色的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢、觸酶實驗,選取實驗結果為革蘭氏陽性、觸酶陰性的菌株進行4℃斜面保藏和液體保藏。

1.3.2 16S rDNA序列分析

(1)菌株DNA的提取:將供試菌株接種于MRS肉湯培養基中,在30℃培養18~24 h后,離心(4 000 r/min,10 min)收集菌種,并用滅菌生理鹽水洗滌,傳代培養2~3次后,利用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌體DNA。

(2)16S rDNA基因序列聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR):PCR擴增采用細菌通用引物。正向引物為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;反向引物為1492R:5′-CTACCAGGGTATCTA ATCC-3′。PCR擴增體系(50.0μL):1.5μL正向27F引物,1.5μL反向1492R引物,1.0 μL基因組DNA,5.0 μL 10×Buffer,1.0 μLTaq聚合酶(5U/μL),1.0μL脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)(10mmol/L),39.0μL雙蒸H2O。PCR擴增反應程序:94℃預變性4 min,94℃變性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸1 min,72℃終延伸10 min,共進行30個循環。PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。

(3)同源性分析與系統發育分析:登陸NCBI(www.ncbi. nlm.gov/blast/)網站,對菌株進行同源性分析。采用MEGA 5.0軟件將測得序列與GenBank中的模式菌株16SrDNA序列進行分析,構建系統發育樹,得到目的菌株的系統發育地位。

1.3.3 乳酸菌耐鹽試驗

乳酸菌活化后,按3%接種量(以試管中10 mL MRS肉湯培養基為基準,下同)分別接種于食鹽含量為0、2%、4%、6%、8%和10%的MRS肉湯培養基中[14],在30℃培養18 h(通過測定該乳酸菌的生長曲線發現,該乳酸菌在培養18 h時進入衰亡期;培養0 h時OD值為0.26),測定培養液在波長600nm處的吸光度值,觀察其生長情況。每組兩個平行。

1.3.4 乳酸菌耐酸試驗

乳酸菌活化后,按3%接種量分別接種于用6 mol/LHCl調節pH值為2.0、2.5、3.0、3.5和4.0的MRS肉湯培養基中,在30℃培養18 h(培養0 h時OD600nm值為0.26),測定培養液在波長600 nm下的吸光度值,觀察其生長情況。每組兩個平行。

1.3.5 乳酸菌降亞硝酸鹽試驗

乳酸菌活化后,按3%接種量分別接種于亞硝酸鈉質量濃度為50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L和250 mg/L的MRS肉湯培養基中,在30℃培養18 h(培養0 h時OD600nm值為0.26),測定培養液在波長600 nm下的吸光度值,觀察菌株生長情況,并使用亞硝酸鹽測試盒測定培養液中殘留亞硝酸鹽濃度[15]。每組兩個平行。亞硝酸鹽計算公式如下:

式中:X1為試樣中亞硝酸鹽的含量,mg/kg;m2為測定用樣液中亞硝酸鈉的質量,μg;m3為試樣質量,g;V1為測定用樣液體積,mL;V0為試樣處理液總體積,mL。

1.3.6 乳酸菌發酵蘿卜干試驗

將蘿卜干漂洗切分后,加入一定量水分(包括接種菌液)和食鹽,按5%接種量(以每壇發酵蘿卜干總質量為基準)接種乳酸菌,以不接種自然發酵作為對照,使蘿卜干最終含水量為65%,食鹽含量為5%,拌勻并裝壇,壇沿使用道道全純正菜籽油密封,發酵溫度28℃,每組兩個平行。

1.3.7 感官品質評定

邀請10名有經驗的感官評定員,按照表1標準對發酵蘿卜干進行感官評分[16]。發酵0~50 d期間,每隔10 d取樣進行感官評定,滿分為100分。

表1 發酵蘿卜干感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard of fermented dried turnip

2 結果與分析

2.1 菌落及菌體特征

從酸豇豆中分離得到菌株L4,其菌落形態如圖l所示。由圖l可知,通過觀察菌株L4在MRS瓊脂培養基平板上的生長情況,發現其生長狀態良好。菌株L4菌落呈乳白色,邊緣規則,表面濕潤且光滑,菌落直徑在1.0~2.0 mm之間。

圖1 菌株L4的菌落形態Fig.1 Colony morphology of strain L4

通過革蘭氏染色和觸酶實驗,在10×100倍光學顯微鏡下,觀察菌株L4的革蘭氏染色結果如圖2所示。由圖2可知,菌株L4為短桿菌,且其菌體的排列方式有單個和鏈狀排列,菌株L4為革蘭氏陽性、觸酶陰性菌株。

圖2 菌株L4的革蘭氏染色結果Fig.2 Gram staining results of strain L4

2.2 16S rDNA基因序列PCR擴增

圖3 菌株L4的16S rDNA擴增產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of 16S rDNA amplification products of strain L4

將菌株L4的基因組DNA進行16S rDNA基因序列PCR擴增,擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果如圖3所示。由圖3可知,菌株L4的PCR產物條帶單一,在1 500 bp處有特異性亮帶,亮帶無拖尾,說明無明顯非特異性擴增,滿足測序要求。

2.3 16S rDNA序列分析與系統發育樹的構建

2.3.1 16S rDNA性同源對比

登錄NCBI網站,將所測定的菌株L4的16S rDNA序列與該網站數據庫進行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi)同源性比對,尋找與目的基因序列同源性較高的已知分類地位的菌種。將菌株L4的16S rDNA序列與Genbank中的已知基因序列對比可知,菌株L4與植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)同源性最高,且菌株的同源性達到99%以上。

2.3.2 構建系統發育樹

用MEGA5.0軟件構建系統發育樹,進行聚類性分析[17],得到系統發育樹如圖4所示。由系統發育樹可知,送檢菌株L4與已報道的Lactobacillus plantarumAB362768.1模式植物乳桿菌親緣關系最為接近,在NCBI上比對其相似度100%。菌株L4菌落和菌體特征符合植物乳桿菌的基本特征,結合分子生物學鑒定結果,可以將菌株L4確定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。

圖4 菌株L4的16S rDNA序列系統發育樹Fig.4 Phylogenic tree of strain L4 based on 16S rDNA sequence

2.4 菌株L4耐鹽性測定

食鹽含量是影響乳酸菌活性的重要因素,當食鹽含量較低時(<2%),乳酸菌生長較快,當食鹽含量較高時(>3%),乳酸菌的生長會受到抑制[18]。根據乳酸菌對不同鹽含量的適應能力拓展其應用范圍,可滿足不同地區對發酵不同食鹽用量的需求。由圖5可知,培養18h后,菌株L4的培養液的OD600nm值隨著食鹽含量的增加而明顯減小(P<0.05),說明食鹽含量對菌株L4的生長有較大的影響。當食鹽含量為0時,菌株L4培養液的的OD600nm值可達7.59±0.02;當食鹽含量為2%時,菌株L4的OD600nm值為6.57±0.18,兩者差異顯著(P<0.05),說明2%食鹽含量在一定程度上抑制了菌株L4的生長。曲線在食鹽含量4%~8%變化趨勢比0~4%變化明顯,說明高濃度食鹽能明顯抑制菌株L4的生長。但當食鹽含量為10%時,菌株L4的OD600nm值可達0.72±0.05,明顯大于培養0 h時的OD600nm值0.26±0.00(P<0.05),說明菌株L4可以在食鹽含量10%條件下進行一定程度的增殖,這可能和用于分離的酸豇豆含鹽量較高有關,同時也表明菌株L4可以用于發酵食鹽含量較高的蔬菜。有研究發現,植物乳桿菌可耐受較高的食鹽含量,但當食鹽含量在5%~10%時,其活性有利于產品的發酵及保藏[19]。

圖5 不同食鹽含量對菌株L4生長的影響Fig.5 Effect of different NaCl concentrations on the growth of strain L4

2.5 菌株L4耐酸性測定

圖6 不同pH對菌株L4生長的影響Fig.6 Effect of different pH on the growth of strain L4

將菌株L4分別接種于pH值為2.0、2.5、3.0、3.5和4.0的MRS肉湯培養基中培養,觀察其生長情況,初步判定菌株L4是否具有耐酸性。由圖6可知,MRS肉湯培養基的pH越高,菌株L4經培養18 h時的OD600nm值越大。當菌株L4在pH值為2.5的MRS液體培養基中培養18 h時,其OD600nm值為0.34±0.15,略大于pH值為2.0時的OD600nm值0.28±0.01(P>0.05),但明顯大于培養0 h的OD600nm值0.26±0.00(P<0.05)。說明菌株L4在pH值為2.5時仍能進行一定程度的增殖,具有潛在的益生特性[20]。MRS肉湯培養基pH值在2.5~4.0之間時,菌株L4經培養18h時的OD600nm值隨pH值的增大而顯著增加(P<0.05);當pH值為4.0時,其OD600nm值增至6.47±0.06。故菌株L4可以耐受pH 2.5的酸性環境。

2.6 菌株L4降解亞硝酸鹽性能測定

亞硝酸鹽質量濃度對菌株L4生長的影響如圖7所示。由圖7可知,隨著MRS肉湯培養基中亞硝酸鹽質量濃度的增加,菌株L4經培養18h時的OD600nm值明顯下降(P<0.05),說明菌株L4的數量隨著亞硝酸鹽質量濃度的增加而減少。培養液中亞硝酸鹽質量濃度越大,對菌株L4生長的抑制作用越明顯。但當亞硝酸鹽質量濃度為250 mg/L時,菌株L4的OD600nm值為5.51±0.04,明顯大于培養0 h的OD600nm值0.26±0.00(P<0.05),說明菌株L4在亞硝酸鹽質量濃度為250 mg/kg時仍生長較好。

圖7 不同亞硝酸鹽質量濃度對菌株L4生長及對其降解亞硝酸鹽的影響Fig.7 Effect of different nitrite concentrations on the growth of strain L4 and nitrite degradation

MRS肉湯培養基中亞硝酸鹽質量濃度不同,菌株L4降解亞硝酸鹽的程度不同。隨著亞硝酸鹽質量濃度的增加,菌株L4對亞硝酸鹽的降解率逐漸下降,可能由于培養液中菌株L4的數量隨亞硝酸鹽質量濃度的增加而減少有關。但隨著亞硝酸鹽質量濃度的增加,菌株L4降解亞硝酸鹽率下降幅度較小,都在99%左右。當亞硝酸鹽質量濃度為50 mg/L時,MRS肉湯培養基中亞硝酸鹽降解率高達(99.14±0.15)%,可能原因有以下幾種:菌株L4產酸能力較強,在培養18 h時各組培養液的pH值降低到3.72左右,相差不顯著(P>0.05),大量的H+會促進亞硝酸鹽的酸降解;菌株L4在生長代謝過程中會產生一定數量的胞外酶,促進亞硝酸鹽的酶降解;菌株L4在生長代謝時,會攝入培養液中的亞硝酸鹽并將其代謝掉。但菌株L4降低培養液中亞硝酸鹽含量的具體原理尚不清楚,有待進一步研究。

2.7 發酵蘿卜干感官評定

食品感官品質是影響消費者購買食品的重要因素。食品感官分析實用性強,可以解決一些理化分析不能解決的問題[21]。接種發酵和自然發酵蘿卜干感官評分見圖8。由圖8可知,接種發酵和自然發酵蘿卜干感官評分隨發酵時間的延長呈上升趨勢,且發酵0~50 d期間,接種發酵蘿卜干評分一直大于自然發酵的;發酵1~20d期間,蘿卜干土腥味較重,軟黏、澀口、偏咸;發酵30d時,蘿卜干土腥味基本消失,接種發酵和自然發酵蘿卜干感官評分分別為(84.7±1.2)分和(74.5±1.0)分,兩者差異顯著(P<0.05),說明接種發酵能加速蘿卜干的發酵速度;發酵30~50 d期間,隨著鹽分繼續滲透到蘿卜干內部和微生物的發酵作用[22-23],蘿卜干逐漸變脆,且咸度適口,發酵蘿卜香味明顯。發酵40d時,接種發酵的蘿卜干感官評分最高,為(90.2±1.2)分;發酵50 d時,接種發酵蘿卜干感官評分下降為(87.2±1.0)分,但還是顯著(P<0.05)高于自然發酵蘿卜干感官評分(84.6±1.1)分。說明菌株L4發酵雖能加快蘿卜干的發酵速度,但發酵時間過長,蘿卜干的感官品質反而會下降。

圖8 發酵蘿卜干感官評分結果Fig.8 Results of sensory evaluation of fermented dried turnip

3 結論

本實驗從湖南自然發酵的酸豇豆中分離出一株乳酸菌L4,采用16S rDNA序列分析法鑒定其為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。菌株L4能耐受10%的食鹽含量和pH 2.5的酸度,且對亞硝酸鹽的降解率高達99%。將菌株L4接種到蘿卜干中進行發酵,發現其可以加快蘿卜干的發酵速度,提高發酵蘿卜干的感官評分。本研究結果為植物乳桿菌L4的后期應用提供了一定的理論依據,但對其代謝產物及其對發酵蔬菜風味的影響等還有待進一步的研究。

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Isolation,identification and application of aLactobacillus plantarumstrain

LIU Zongmin1,2,ZHOU Hongli1,2,TAN Xinghe1,2*,LI Qingming1,2,WANG Feng1,2,GUO Hongying1,2,LIU Chucen1,2, YAO He1,2,WANG Lanshu3,YAN Qinwu4
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China;3.Hunan Jiayan Food Company Limited,Changsha 410123,China; 4.Hunan Cha Qi Vegetables Industry Company Limited,Yueyang 414207,China)

One strain of suspected lactic acid bacteria L4 was isolated from natural fermented acid cowpea in Hunan province.The 16S rDNA was extracted from strain L4 and the strain was identified by DNA sequencing,homology analysis and phylogenetic tree.The results indicated that strain L4 belonged toLactobacillus plantarum.After salt resistance,acid resistance and nitrite degradation experiments,results showed that strain L4 could grow under 10%NaCl concentration,tolerate pH 2.5 and the degradation rate of nitrite reached up to 99%.Using natural fermented dried turnip as control,dried turnip inoculated with strain L4 as experimental sample,the characteristics of fermented dried turnip was investigated by sensory evaluation.The results showed that strain L4 could shorten the fermentation period and improve the sensory evaluation score of fermented dried turnip.

acid cowpea;isolation and identification;Lactobacillus plantarum;fermentation

TS255.53

0254-5071(2017)07-0095-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.021

2017-03-09

湖南省重點研發計劃(2016NK2113)

劉宗敏(1992-),女,碩士研究生,研究方向為蔬菜加工。

*通訊作者:譚興和(1959-),男,教授,博士,研究方向為農產品加工及貯藏。

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