透明質酸添加對細菌纖維素發酵生產的影響

丁勇，張岢薇，邵明亮，羅倉學*

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安710021）

透明質酸添加對細菌纖維素發酵生產的影響

丁勇，張岢薇，邵明亮，羅倉學*

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西西安710021）

為改善干態細菌纖維素（BC）的復水率，研究在發酵過程中添加透明質酸（HA）對BC膜性質的影響，并通過傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、X-射線衍射（XRD）、熱重分析（TGA）表征HA-BC復合膜的性質。結果表明，與未添加HA的BC膜相比，發酵前添加1 g/L的HA能夠有效提高BC膜的復水性，復水率最高為23.58%，發酵過程中pH、還原糖、可溶性固形物變化趨勢與未添加HA組相似，HA的添加對BC的合成過程影響不大。FTIR結果表明，HA與BC形成了復合膜；TGA與XRD結果顯示，HA-BC復合膜的熱穩定性提高，結晶度降低，導致其復水率增加。研究結果表明，添加HA能夠生產復水率較高、熱穩定性較好的HA-BC復合物。

細菌纖維素；復水率；透明質酸；傅里葉變換紅外光譜；X-射線衍射；熱重分析

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）又稱納塔（Natta），是一類由微生物發酵合成的纖維素的總稱[1]。作為一種天然高分子納米結構材料，其具有純度高、機械性能好、可塑性強以及含水率高、生物相容性好、生物可降解等特性，因此在食品、生物醫藥、造紙工業、音響器材、化妝品、膜濾器等領域被廣泛應用，具有良好的經濟和社會效益。但BC濕膜含水率高，運輸困難，成本成倍增加，對BC膜進行干燥處理是有效的解決辦法。然而，干燥后的BC膜復水性僅占原來的12%～16%[2]，相應的納米級三維網狀結構改變，結晶度增大，楊氏模量增加，硬度提高，很大程度上破壞BC膜的優良性能，干態BC膜的復水與持水力的降低極大地限制了其在食品等行業的應用。為改善BC膜干燥后性能缺失的現狀，利用BC表面積大且含有大量羥基基團，很容易與其他生物材料產生共價鍵而形成復合物的特點[3]，對BC改性以增強其功能性成為研究熱點之一。趙梓年等[4]利用冷凍-解凍法制備了細菌纖維素/聚乙烯醇雙網絡復合水凝膠，增強了復合水凝膠的含水率、平衡溶脹比、拉伸強度和壓縮強度?；裘髅鱗5]分別采用浸泡法、生物復合法、交聯法和凝膠法制備出透明質酸-細菌纖維素復合物，發現不同方法制備的復合材料力學性能提高，結晶度隨透明質酸濃度的升高而降低。

透明質酸（hyaluronic acid，HA）是一種存在于大多數哺乳動物組織的氨基葡萄糖，屬于生物活性分子。具備保濕、預防和修復皮膚損傷，調節蛋白質，調節血管壁的通透性，水電解質擴散及運轉，潤滑關節，促進創傷愈合等功能，可結合自身400倍以上的水，是自然界中最好的保濕因子[6]。

本研究在BC發酵過程中添加HA制備HA-BC復合膜及對發酵過程的影響，以復合膜產量與復水率為評價指標，確定HA的最佳添加時間和添加量，并檢測HA的添加對BC發酵過程的影響，通過傅里葉變換紅外光譜（Fouriertransforminfraredspectroscopy，FTIR）、X-射線衍射（X-raydiffraction，XRD）、熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）表征原位改性的BC膜，以期改善干態BC膜的復水性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木醋桿菌（Acetobacter xylinus）DS398：由陜西科技大學食品與生物工程學院發酵產品實訓中心保藏；蔗糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、無水乙醇、冰乙酸、檸檬酸、氫氧化鈉（均為分析純或生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司。透明質酸（分析純）：合肥博美生物科技有限責任公司。

培養基[7]：蔗糖40g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，無水硫酸鎂0.5 g/L，檸檬酸2 g/L，pH5.0，無水乙醇10 mL/L。

1.2 儀器與設備

Sartorious BSA323電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；PHS-2C酸度計：上海雷磁儀器科技有限公司；MASTER-M手持糖度儀：日本Atago公司；722E型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機：上海比朗儀器制造有限公司；VECTOR-22傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）：德國Bruker公司；D/max2200PC型X射線衍射儀：日本理學科技有限公司；TGA Q500熱重分析儀：美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 BC的發酵生產與純化

采取普通培養基發酵生產BC，裝液量100 mL/250 mL，接種量5%，29℃條件下靜置培養5 d。發酵結束后取出BC膜用蒸餾水多次沖洗，去除表面雜質后，再浸入0.1 mol/L的NaOH溶液中，煮沸2 h，除去殘存的菌體和培養基，直至膜呈乳白色半透明狀。后用質量分數為1%醋酸和蒸餾水反復沖洗至中性，浸入蒸餾水中冷藏（溫度4℃）保存待用。

1.3.2 HA-BC膜的制備

（1）HA添加時間對BC膜產量和復水性的影響

分別在發酵時間0、1 d、2 d、3 d、4 d加入0.5 g/L HA。發酵5 d后取出HA-BC復合膜，進行純化處理，采用真空冷凍干燥至恒質量，并對HA-BC復合膜產量、和復水率進行比較。

（2）HA添加量對BC膜產量和復水率的影響

接種前在無菌環境中加入不同添加量HA（0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L），發酵5 d結束取出HA-BC復合膜，進行純化處后，采用真空冷凍干燥至恒質量，并對BC-HA復合膜產量、復水率進行比較。

1.3.3 BC膜產量與復水率測定

a.取出純化處理后的BC膜，用濾紙吸干表面水分，直至無水滴滴下，稱質量3次，取平均值即為濕質量M濕。

b.取出純化處理后BC膜，將膜放置在聚四氟乙烯托盤上，經真空冷凍干燥至恒質量，取出稱質量3次，取平均值即為BC膜干質量M干。

c.將BC干膜浸泡于蒸餾水中，每隔一段時間取出，用濾紙吸去表面殘余水分，稱質量直至質量不再增加，稱質量3次，取平均值即為復水質量M復[8]。BC膜產量及復水率計算公式如下：

式中：M為細菌纖維素產量，g/L；V為培養基體積，L。

1.3.4 發酵過程中指標的測定

在添加HA發酵BC的過程中每天取樣進行測定。pH值的測定：采用酸度計；可溶性固形物的測定：手持糖度儀；還原糖的測定：3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid colorimetry，DNS）比色法[9]。

1.3.5 HA-BC復合膜的表征

（1）傅里葉變換紅外光譜

將干燥的HA-BC復合膜樣品剪碎研磨，與溴化鉀（KBr）混合壓片，質量比1∶200，采用FTIR測試樣品在波數450～4 000 cm-1范圍內的紅外吸收光譜，掃描次數32次，分辨率4 cm-1，測定樣品圖譜[10]。

3.加強對選拔任用干部工作情況的監督檢查。以解決選拔任用干部中的突出問題、提高選人用人的公信度為切入點，重點監督檢查被巡視單位違規違紀用人、拉票、跑官要官、買官賣官等問題，促進被巡視單位防止和克服選人用人上的不正之風。檢查的情況要如實向黨委和組織部門匯報和通報，對重要情況，要及時請示報告。對“跑官要官”的，要嚴肅批評，記錄在案，并取消其被推薦、考察和作為候選人的資格，情節嚴重的要進行組織處理；對行賄“買官”的，一律先免去職務，再按有關規定處理；對受賄“賣官”的，要依紀依法嚴懲；對在民主推薦和選舉中搞拉幫結派、拉票賄選的，要堅決查處，已經提拔的要從領導崗位上撤下來，堅決糾正用人上的不正之風。

（2）結晶度

X-射線衍射儀檢測HA-BC復合膜的結晶度。X衍射測試條件：用銅鎳發射靶，波長λ=0.154 06 nm，加速電場36 kV，電流20 mA，將干燥樣品固定在旋轉靶上，掃描步長0.01°，掃描5～60 s，結晶度掃描速度0.075°/s。結晶度[11]計算公式如下：

CrI=（I200－Iam）/I200

式中：CrI為結晶度，%；I200是主結晶峰200的最大衍射強度，cps；Iam指無定型區對應峰的強度，cps；（一般指2θ=18～20之間的最低衍射強度）。

（3）熱重分析

熱重分析儀測試HA-BC復合膜的熱穩定性能，氮氣（N2）保護，氮氣流速為20 mL/min，升溫速率為10℃/min，溫度范圍為0～600℃[12]。

2 結果與分析

2.1 HA添加時間對BC膜產量和復水性影響

分別在不同發酵時間（0、1 d、2 d、3 d、4 d）加入0.5 g/L HA，BC膜產量（濕質量）與復水率變化結果見圖1。由圖1可知，發酵時間在0～4 d范圍內，隨著HA的添加時間不同，BC膜產量逐漸增大后降低，復水率呈逐漸下降后趨于平緩的趨勢。發酵第3天加入HA形成的復合膜產量最高，達到224.25g/L，原因可能是由于HA的加入增大了培養基黏度，在發酵3 d后加入使得大分子HA黏附在BC表面增加BC膜產量，后期產量降低可能與黏度過大影響BC合成有關。發酵前期加入HA能夠增加BC膜復水率，后期加入復水率較低，可能是因為在發酵后期加入的HA是依靠氫鍵作用結合在BC表面，在后序純化及干燥處理中極可能遭到破壞，HA取代率低；發酵前期加入HA占據了纖維合成空間，使合成的BC分子間隙變大，復水時水分子較易進入[13]。由于發酵前加入的HA會影響BC膜的合成，可能會改變生成的BC結構，發酵初始添加HA復水率高，但是產量較低，在發酵3 d添加HA，獲得的BC膜產量較高，復水率較低。

圖1HA添加時間對BC膜產量與復水率的影響Fig.1 Effect of adding HA time on yield and rehydration rate of BC membrane

2.2 HA添加量對BC膜產量和復水性的影響

在發酵前加入HA，不同HA添加量對BC膜的產量（濕質量）與復水率變化結果見圖2。由圖2可知，HA添加量在0～2.0 g/L，HA-BC復合膜產量與復水率均呈先增大后減少的趨勢。當HC添加量為1.0 g/L時，HA-BC復合膜產量最大，為247.47 g/L；當HA添加量＞1.0 g/L時，HA-BC復合膜產量下降，其原因可能是HA添加量過量，導致培養基黏度過大，影響菌種生長代謝，阻礙纖維聚集[14]，產量下降。與BC膜復合，HA特殊的保水作用能夠增大HA-BC復合膜的復水率，并在HA添加量為1.0 g/L，HA-BC復合膜復水率最高為23.58%；但HA添加量＞1.5 g/L時，HA-BC復合膜復水率下降。綜合考慮，確定HA添加量為1.0 g/L。

圖2HA添加量對BC膜產量與復水率的影響Fig.2 Effect of HA addition on yield and rehydration rate of BC membrane

2.3 添加HA發酵BC過程中培養基成分的測定

2.3.1 發酵過程中培養基pH值的測定

以不添加HA為對照組，發酵前添加1 g/L透明質酸，檢測發酵5 d內BC培養基pH值的變化，結果見圖3。由圖3可知，發酵前控制培養基的pH值為5，發酵3 d pH急劇下降，隨后趨于平緩。原因可能是在BC發酵過程中木醋桿菌不斷增殖，產生葡萄糖酸與醋酸等導致[15]。發酵后期，由于培養基酸度過高，阻礙了木醋桿菌的生長，pH不再下降。對照組與添加HA組的BC培養基pH值變化趨勢相同，說明HA的加入不會對木醋桿菌發酵細菌纖維素產酸造成影響。

圖3 發酵過程中pH值的變化Fig.3 Changes of pH during fermentation

2.3.2 發酵過程中可溶性固形物的測定

以不添加HA為對照組，發酵前添加1 g/L透明質酸，發酵液中可溶性固形物的變化，結果見圖4。由圖4可知，兩條曲線均呈逐漸降低后趨于平緩的趨勢。在發酵的5 d內，木醋桿菌不斷生長，利用碳源合成纖維素，培養基中可溶性固形物的含量逐漸降低，在發酵第3天時，添加HA組的可溶性固形物含量急劇降低，可能與此時為細菌的對數增長期有關。由于木醋桿菌可利用包括單糖、二糖和多糖在內的多種碳源和能源物質來合成纖維素[16]，因此，HA的加入可能會導致培養基固形物含量的增加，促進細菌的生長。

圖4 發酵過程中可溶性固形物的變化Fig.4 Changes of soluble solids during fermentation

2.3.3 發酵過程中還原糖的測定

以不添加HA為對照組，發酵前添加1g/L透明質酸，發酵液中還原糖含量的變化，結果見圖5。由圖5可知，還原糖在BC發酵5 d內總體呈現下降的趨勢，前2 d內，加入HA后還原糖含量略增加，可能與高分子HA的降解有關。添加HA組與對照組還原糖變化趨勢相同，說明HA的加入不影響BC的形成過程。HA組初始還原糖含量較高，發酵結束時與對照組接近，推測木醋桿菌可能利用了部分降解為低分子的HA。

圖5 發酵過程中還原糖含量的變化Fig.5 Changes of reducing sugar contents during fermentation

2.4 HA-BC復合膜的傅里葉變換紅外光譜分析

圖6BC膜(a)及HA-BC復合膜(b)的紅外圖譜Fig.6 Infrared spectrogram of BC membrane(a)and HA-BC composite membrane(b)

紅外光譜常用來確定物質中的特殊官能團或化學鍵[17]。BC膜及HA-BC復合膜的紅外光譜圖見圖6。由圖6a可知，在波數3 234 cm-1和3 257 cm-1之間出現的吸收譜帶是OH鍵與NH鍵的伸縮振動作用；波數2896cm-1處的吸收峰是C=C伸縮振動；波數1 411 cm-1、1 616 cm-1處的吸收峰是對稱與不對稱的C=C伸縮振動作用；而波數1 153 cm-1、1 313 cm-1、1 037 cm-1處的吸收峰分別是氨基酸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用。波數3 600～3 000 cm-1之間的吸收峰是OH鍵的作用。由圖6b可知，波數3 000～2 800 cm-1之間的吸收峰是CH、CH2鍵的作用，波數1 200～900 cm-1之間的吸收是由C=O、C=O鍵的伸縮振動引起，其中波數1160cm-1處的吸收峰是羧酸基C-O-C伸縮振動引起，而在波數750 cm-1、710 cm-1處的吸收峰是纖維素典型的Iα、Iβ結晶形態峰。特別發現在波數1 745 cm-1附近加入HA的BC存在特殊吸收峰，如圖6b中虛線框所示，而未添加的樣品則未出現，說明添加HA使產物的化學結構發生了改變。

2.5 HA-BC復合膜的XRD分析

BC膜及HA-BC復合膜的XRD測試結果見圖7。由圖7可知，BC曲線上的三個衍射峰14.8、16.5和22.8分別代表了BC結構的（101）、（10）和（002）三個晶面[18]，添加HA后，復合膜不僅出現了這三個峰，且在衍射峰2θ為14附近峰強增大，表明HA的加入未改變細菌纖維素的晶型。

圖7BC膜(a)及HA-BC復合膜(b)的X衍射圖Fig.7 X-ray diffraction graph of BC membrane(a)and HA-BC composite membrane(b)

通過擬合分峰計算出BC膜的結晶度為44.57%，發現添加HA后復合膜的結晶度有所下降，為40.92%，這可能是因為在纖維素形成之前，培養體系中就已有HA存在，HA的“占位”導致纖維三維網絡間隙變大，結晶度變低[19]，而結晶度的大小對BC膜吸水性有影響，結晶度減小，復水率增加，這一結果與BC膜的復水率變化保持了一致性。

2.6 HA-BC復合膜的熱穩定性分析

圖8BC膜(a)及HA-BC復合膜(b)的熱重分析曲線Fig.8 TGA curves of BC membrane(a)and HA-BC composite membrane(b)

熱重分析（TGA）是在程序控制溫度下，測量物質的質量變化與溫度或者時間的關系技術[20]。BC膜及HA-BC復合膜的熱重分析曲線，由圖8可知，BC膜在19.41℃開始分解，200.57～449.38℃為主要失重階段，此階段失重約43.99%，最大失重溫度為278.67℃。HA-BC復合膜的起始分解溫度為18.88℃，主要失重溫度在210.69～450.45℃范圍內，約失重52.56%，最大失重溫度為297.21℃。HA-BC復合物與BC有類似的分解曲線，其在前100℃范圍內失重較慢，100～200℃失重開始加快，發現加入HA后，最大失重溫度提高，說明HA-BC復合膜的熱穩定性較好，但其在主要分解溫度范圍內失重較多，可能與HA較易受熱分解有關。

3 結論

本試驗研究了添加透明質酸對BC膜的影響。發現發酵前添加1 g/L的HA能夠提高BC膜的復水性，較未改性的BC復水率增加了16%。且發酵過程中pH、還原糖、可溶性固形物變化趨勢與未添加HA組相似，說明HA的加入對BC的合成影響不大。對改性的復合膜進行表征，發現加入HA后，復合膜熱穩定性提高，結晶度降低，導致其復水率增加，紅外光譜顯示HA-BC復合膜在波數1 745 cm-1附近出現特殊吸收峰，可能添加HA會改變產物的化學結構。研究結果為改善干態的BC膜復水性質與BC在各行業的推廣應用提供了理論依據與技術參考。

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Effect of hyaluronic acid addition on fermentation process of bacterial cellulose

DING Yong,ZHANG Kewei,SHAO Mingliang,LUO Cangxue*
(School of Food and Bioengineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an 710021,China)

In order to improve the rehydration rate of dried bacterial cellulose(BC),the effect of hyaluronic acid(HA)addition on BC membrane was researched,and the properties of the HA-BC composite membrane were analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR),X-ray diffractions (XRD)and thermogravimetric analysis(TGA).The results showed that compared with the BC membrane without HA,the BC membrane added 1 g/L HA before fermentation could improve effectively the rehydration rate of BC membrane,the maximum rehydration rate was 23.58%,and the variation trends of pH,reducing sugar and soluble solids were similar to that of the unadded HA group during fermentation,and the addition of HA had little effect on the synthesis of BC.FTIR results indicated that HA and BC form a composite membrane;TGA and XRD results indicated that the thermostability of HA-BC composite membrane increased and the degree of crystallinity decreased which resulted in the increase of rehydration rate.As a result,the addition of HA could produce the HA-BC composite membrane with higher rehydration rate and better thermostability.

bacterial cellulose;rehydration rate;hyaluronic acid;FTIR;XRD;TGA

TS201.3

0254-5071（2017）07-0100-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.022

2017-04-08

陜西省教育廳專項科研計劃項目（14JK1089）

丁勇（1974-），男，講師，碩士，研究方向為發酵工程。

*通訊作者：羅倉學（1959-），男，教授，碩士，研究方向為食品加工及資源綜合開發利用。