襄陽大頭菜腌制液膜醭細菌群落結構研究

郭壯，沈馨，董蘊，吳競，凌霞，胡事成，趙慧君*

（1.湖北文理學院化學工程與食品科學學院鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北襄陽441053；2.襄陽市食品藥品檢驗所，湖北襄陽441021；3.襄陽孔明菜有限公司，湖北襄陽441000）

襄陽大頭菜腌制液膜醭細菌群落結構研究

郭壯1，沈馨1，董蘊1，吳競2，凌霞2，胡事成3，趙慧君1*

（1.湖北文理學院化學工程與食品科學學院鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北襄陽441053；2.襄陽市食品藥品檢驗所，湖北襄陽441021；3.襄陽孔明菜有限公司，湖北襄陽441000）

使用Miseq高通量測序技術對3個襄陽大頭菜腌制液膜醭樣品的細菌微生物群落結構進行了解析。在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）和硬壁菌門（Firmicutes）平均含量分別為62.12%和34.13%。在屬水平上，相對含量＞1.0%的細菌屬分別為鹽單胞菌（Halomonas）、色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）、海桿菌屬（Marinobacter）、鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）、四聯球菌（Tetragenococcus）和堿桿菌屬（Alkalibacillus），其相對含量為26.31%、16.49%、8.13%、24.87%、6.13%和1.16%。在操作分類單元水平（OTU）上，發現14個平均相對含量＞1.0%的核心OTU，其中OTU4083（隸屬于鹽厭氧菌屬）、OTU4400（隸屬于色鹽桿菌屬）和OTU846（隸屬于鹽單胞菌屬）的累計平均相對含量為39.50%。由此可見，襄陽大頭菜膜醭中的細菌微生物主要由隸屬于變形菌門和硬壁菌門的6個屬構成，且膜醭共有大量的核心細菌菌群。

襄陽大頭菜；膜醭；細菌；多樣性

作為我國四大腌菜之一的襄陽大頭菜，在長達18個月的腌制過程中，因腌制池表面常形成一層白色的膜醭，導致其品質會明顯下降甚至失去經濟價值，嚴重損害了種植戶和企業的經濟收益，且類似問題在泡菜[1]和葡萄酒[2]等行業中亦較為普遍。膜醭具體表現為在發酵基質的表面形成一層成片或成碎花狀的白膜，其實質是一種黏附在生物或非生物材料表面由微生物群體和包裹菌體基質組成的聚合物[3]。

近年來，國內外研究人員圍繞發酵食品中膜醭微生物群體的物種組成這一科學問題開展了多項卓有成效的研究。目前普遍認為發酵食品基質表面形成的膜醭是由高需氧的酵母引起的[4]。除真菌外，有學者指出細菌對膜醭的形成亦有貢獻，其中枯草芽孢桿菌作為模式微生物被大量研究[5]。TRISTEZZA M等[2]研究發現，分離自葡萄酒中的乳酸菌、醋酸菌在特定的條件下均能形成膜醭。蔣云露等[6]對泡菜膜醭形成過程中膜醭和鹽鹵中的細菌群落構成和動態變化進行了分析，發現膜醭形成的前、中、后期細菌種類差異較大，前期以革蘭氏陽性為主，后期以革蘭氏陰性為主。何鵬輝等[7]對泡菜膜醭中細菌進行了分離，研究發現枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、弗羅因德（氏）枸櫞酸桿菌（Citrobacter freundii）、科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus cohniisubsp.cohnii）、居幼蟲普羅威登斯菌（Providencia vermicola）、克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）和陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）等均與膜醭的形成有關。敖曉琳等[8]亦從泡菜水中分離了導致膜醭形成的微生物，其中3株細菌被鑒定為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、1株被鑒定為高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）。上述研究的開展為明確是何種微生物導致了襄陽大頭菜腌制過程中膜醭的形成提供了借鑒。但上述研究多數以純培養技術為主要研究手段，且在選擇分離培養基時存在一定的隨意性，因而在研究膜醭中微生物群體的物種組成方面顯示出較大的片面性和局限性。

本實驗以表面長膜醭的大頭菜腌制液為研究對象，采用Miseq高通量測序技術，以細菌16S rRNA為測序靶點，結合生物信息學手段對膜醭的細菌群落結構進行了揭示，以期為后續采取有效措施杜絕大頭菜腌制過程中膜醭的形成提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品（長膜醭的大頭菜腌制液和膜醭）：湖北省襄陽孔明菜有限公司。

脫氧核糖核苷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix、5×TransStartTM、FastPfu Buffer和FastPfu Fly DNA Polymerase：北京全式金生物技術有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit：德國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設備

Miseq高通量測序平臺：美國Illumina公司；2100芯片生物分析儀：美國Agilent公司；5810R臺式高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國NanoDrop公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；Vetiri梯度基因擴增儀：美國AB公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統：美國BIO-RAD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集

從腌制缸中采集長膜醭的大頭菜腌制液和膜醭，使用組織搗碎機將其攪拌均勻后裝入無菌采樣管中，冷鏈運送回實驗室并進行脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取。

1.3.2 DNA提取

使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒按照說明書步驟對樣品宏基因組DNA進行提取，從濃度和純度對DNA質量進行檢測，符合要求的DNA保存在-20℃條件下備用。

1.3.3 細菌16S rRNA擴增

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增體系為：4 μL 5×PCR緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs Mix，0.8μL5μmol/L正向引物，0.8μL5μmol/L反向引物，0.4μL 5 U/μL DNA聚合酶，10 ng DNA模板，體系用ddH2O補充至20μL。細菌16SrRNA正向引物為338F（5'-ACTCCTACGG GAGGCAGCA-3'），反向引物為806R（5'-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3'），在正向引物中加入7個核苷酸標簽（barcode）

擴增條件為：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸45 s，30個循環；72℃延伸10 min。

1.3.4 樣品平衡及Miseq高通量測序

經1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格的擴增產物稀釋至100 nmol/L，混合均勻后寄往上海美吉生物醫藥科技有限公司，使用Miseq平臺進行高通量測序。

1.3.5 序列的拼接及質控

首先根據成對序列之間的重疊關系，將雙端序列數據拼接成一條序列，繼而根據barcode將所有序列劃分到各個樣品并對序列方向進行校正，最后切掉序列barcode和引物。在拼接過程中，若重疊區的堿基數＜10 bp或最大錯配比率＞0.2，barcode堿基錯配或引物堿基錯配數＞2 bp，或切掉barcode和引物后堿基數＜50 bp則將序列予以剔除。

1.3.6 生物信息學分析

質控后的序列使用QIIME（v1.7.0）分析平臺[9]進行物種和多樣性分析，主要的處理流程為：

①使用PyNAST[10]校準排齊序列，在序列100%相似性下進行UCLUST[11]歸并，建立無重復的16S rRNA全長序列集；

②在序列97%相似度下進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分；

③對OTU代表性序列進行同源性比對，整合RDP（ribosomaldatabase project，Release 11.5）[12]和Greengenes（Release 13.8）[13]兩個數據庫的比對結果，確定每個OTU最終的分類學地位；

④使用FastTree軟件[14]繪制基于OTU代表性序列的系統發育進化樹，隨后計算樣品的α多樣性。

1.3.7 核酸登錄號

本研究中所有序列數據已提交至MG-RAST數據庫，ID號為mgp79756。

2 結果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

3個腌制液膜醭樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數量如表1所示。

由表1可知，通過Miseq高通量測序，本研究采集的3個樣品共產生了105 382條高質量16S rRNA序列，平均每個樣品產生35 127條。經過100%序列鑒定聚類分析后，本研究共得到48 025條代表性序列，根據序列的97%相似性進行操作分類單元劃分后，共得到6 016個OTU，每個樣品平均2 566個OTU。以測序量為自變量，以發現物種數和香農多樣性指數為因變量，使用Origin8.6軟件（OriginLab，MA，USA）進行稀疏曲線和香農多樣性指數曲線繪制，其結果如圖1所示。

表1 樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數量Table 1 16S rRNA sequencing conditions and classifications at different taxonomical levels

圖1 稀疏性曲線（A）和香農多樣性指數（B）Fig.1 Rarefaction curve(A)and Shannon diversity index(B)

由圖1（A）可知，隨著測序深度的增加，發現物種的數量繼續增加且沒有達到平衡狀態，說明隨著測序量的增加可能會有新的種系型被發現。由圖1（B）可知，隨著測序深度的增加，香農多樣性指數曲線已基本達到平衡狀態，說明在此測序水平下，樣品中細菌的多樣性已能充分展現。由此可見，本研究產出的序列已經能全面捕獲樣品中細菌微生物的多樣性，因而是滿足后續分子生物學分析的。

2.2 基于不同分類地位核心菌群相對含量的分析

本研究使用SILVA數據庫對OTU代表性序列進行了同源性比對，所有的序列鑒定為24個門，57個綱，81個目，153個科和268個屬，其中有13.25%的序列不能鑒定到屬水平。3個大頭菜膜醭樣品中平均相對含量＞1.0%的細菌門分別為變形菌門（Proteobacteria）、硬壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其相對含量分別為62.12%、34.13%和1.12%。如果某一細菌屬在3個樣品中的平均相對含量＞1.0%，則將其定義為優勢細菌屬。襄陽大頭菜腌制液膜醭中優勢細菌屬相對含量的比較分析如圖2所示。

圖2 襄陽大頭菜腌制液膜醭中優勢細菌屬相對含量的比較分析Fig.2 Comparative analysis on the relative content of the dominant bacterial genera in biomembrane of Xiangyang mustard root brine

由圖2可知，3個大頭菜腌制液膜醭樣品中優勢細菌屬分別為隸屬于變形菌門（Proteobacteria）的鹽單胞菌屬（Halomonas）、色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）和海桿菌屬（Marinobacter），其相對含量為26.31%、16.49%和8.13%；隸屬于硬壁菌門（Firmicutes）的鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）、四聯球菌屬（Tetragenococcus）和堿桿菌屬（Alkalibacillus），其相對含量為24.87%、6.13%和1.16%。由此可見，襄陽大頭菜腌制液膜醭中的細菌主要由隸屬于變形菌門和硬壁菌門的6個屬構成，其累計相對含量為83.10%。張奶英等[15]指出鹽單胞菌屬（Halomonas）為葉用芥菜腌制過程中的主要優勢菌，且色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）在整個腌制過程中均有檢出；尹禮國等[16]指出海桿菌屬（Marinobacter）為鹽漬青菜發酵初期的優勢菌；有學者指出鹽單胞菌屬（Halomonas）、色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）和海桿菌屬（Marinobacter）為四川泡菜中的優勢菌[17]，上述研究結論與本研究相同。除此之外，鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）具有嗜鹽和產氫的特性[18]，常用于含鹽廢水的厭氧處理[19]。四聯球菌屬（Tetragenococcus）隸屬于腸球菌科（Enterococcaceae），是一種中度嗜鹽的乳酸菌，多分布于醬類制品中[20]。作為一種中度嗜鹽嗜堿菌，堿桿菌屬（Alkalibacillus）常分布于高鹽度的土壤中[21]。

如果某一個菌屬在3個樣品中均存在，則本研究將其定義為核心菌屬。本研究共發現87個核心細菌屬，且上述6個相對含量＞1.0%的細菌屬均為核心屬，襄陽大頭菜腌制液膜醭中相對含量＞1.0%的核心細菌屬相關性如圖3所示。

圖3 平均相對含量＞1.0%的核心細菌屬相關性Fig.3 Correlation among the core bacterial genera with relative abundance of more than 1.0%

由圖3可知，6個相對含量＞1.0%的細菌屬之間相關性均不顯著（P＞0.05）。進一步統計了OTU在3個樣品中出現的次數，其結果如圖4所示。

圖4OTU在襄陽大頭菜腌制液膜醭樣品中出現次數統計Fig.4 Occurrence frequency of OTU as a function of their prevalence in biomembrane of Xiangyang mustard root brine

由圖4可知，3個襄陽大頭菜腌制液膜醭樣品共產生6 016個細菌OTU，其中在3個樣品中僅出現1次和2次的OUT為4794和761個，占OTU總數的79.69%和12.65%，所包含序列數為6280條和5903條，占所有質控后合格序列數的5.96%和5.60%。采用VENNY2.1在線軟件（http：//bioinfogp. cnb.csic.es/tools/venny/index.html），基于OTU水平進行Venn圖繪制，其結果如圖5所示。

由圖5可知，3個襄陽大頭菜膜醭樣品中共發現461個細菌的核心OTU，僅占OTU總數的7.66%，但其包含93 199條序列，占所有質控后合格序列數的88.44%。此外，由上述分析可知，4 794個僅出現1次的OTU，其包含6 280條序列，平均每個OTU僅有1.31條序列，本研究共產生105 382條高質量16S rRNA序列，則每個僅出現1次的OTU其包含序列數占總序列數的0.001 2%，由此可見，雖然有的樣品中含有一些較為獨特的OTU，但其相對含量較低，因而大頭菜腌制液膜醭樣品共有大量的核心細菌菌群。本研究發現的461個核心OTU中相對含量＞1.0%的OTU在3個樣品中相對含量如圖6所示。

圖5 基于OTU水平的Venn圖Fig.5 Venn diagram based on OTU level

圖6 相對含量＞1.0%的核心OTU在各襄陽大頭菜腌制液膜醭樣品中相對含量Fig.6 The relative contents of core OTU with relative abundance of more than 1.0%in biomembrane of Xiangyang mustard root brine

由圖6可知，14個核心OTU中，6個隸屬于鹽單胞菌屬（Halomonas）、3個隸屬于鹽單胞菌屬（Halanaerobium）、2個隸屬于四聯球菌屬（Tetragenococcus）、各有1個隸屬于海桿菌屬（Marinobacter）和色鹽桿菌屬（Chromohalobacter），1個OTU僅能鑒定到鹽單胞菌科（Halomonadaceae）。值得一提的是，在3個樣品中平均含量最高的3個核心OTU分別為OTU4083（隸屬于鹽單胞菌屬）、OTU4400（隸屬于色鹽桿菌屬）和OTU846（隸屬于鹽單胞菌屬），其平均含量分別為15.61%、14.58%和9.31%。值得一提的是，核心OTU4083、OTU4400和OTU846在樣品MBX1、MBX2和MBX3中的累計相對含量分別為33.13%、45.60%和39.76%，這也進一步證實了襄陽大頭菜腌制液膜醭樣品共有大量的核心細菌菌群，3個核心OTU的相對含量就占到了細菌類群的1/3左右。本研究進一步對平均相對含量＞1.0%的核心OTU之間的相關性進行了分析，其結果如圖7所示。

圖7 平均相對含量＞1.0%的核心OTU相關性Fig.7 Correlation among the core OTU with relative abundance more than 1.0%

由圖7可知，OTU846（隸屬于鹽單胞菌屬）與OTU5759（隸屬于鹽單胞菌屬）和OTU4273（隸屬于鹽單胞菌屬）均呈顯著正相關（P＜0.05），相關系數分別為0.997和0.998，而與OTU642（Halomonas）呈顯著負相關（P＜0.05），相關系數為-0.999；OTU5759（隸屬于鹽單胞菌屬）與OTU4273（隸屬于鹽單胞菌屬）、OTU694（隸屬于四聯球菌屬）與OTU1349（隸屬于四聯球菌屬）、OTU5914（隸屬于鹽單胞菌屬）與OTU1455（隸屬于鹽單胞菌屬）均呈現顯著正相關（P＜0.05），相關系數分別為1.000、0.999和1.000。

3 結論

本研究采用宏基因組學策略，使用Miseq高通量測序技術，以細菌16S rRNA為測序靶點，對表面長膜醭的襄陽大頭菜腌制液中細菌微生物的多樣性進行了揭示。結果發現，襄陽大頭菜膜醭中的細菌微生物主要由隸屬于變形菌門和硬壁菌門的鹽單胞菌屬、色鹽桿菌屬、海桿菌屬、鹽厭氧菌屬、四聯球菌屬和堿桿菌屬的6個細菌屬組成，且大頭菜腌制液膜醭共有大量的核心細菌菌群。通過本研究的開展，可為因形成膜醭而導致襄陽大頭菜產品品質下降這一產業化問題的解決提供理論依據，同時亦可為泡菜和葡萄酒等發酵食品發酵過程中膜醭形成的研究提供參考。

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Diversity of bacterial microflora of biomembrane in Xiangyang mustard root brine

GUO Zhuang1,SHEN Xin1,DONG Yun1,WU Jing2,LING Xia2,HU Shicheng3,ZHAO Huijun1*
(1.Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food,College of Chemical Engineering and Food Science,Hubei University of Arts and Science,Xiangyang 441053,China;2.Xiangyang Institute of Food and Drug Supervision,Xiangyang 441053,China; 3.Xiangyang Kongming Mustard Root Co.,Ltd.,Xiangyang 441000,China)

Three biomembrane samples of Xiangyang mustard root brine were collected and the bacterial microbiota community structure was studied by Miseq high throughput sequencing technology.Results showed that at phyla level,Proteobacteria and Firmicutes were the most dominant,with the relative abundance of 62.12%and 34.13%,respectively.At Genus level,the genus with relative content more than 1.0%wereHalomonas,Chromohalobacter,Marinobacter,Halanaerobium,Tetragenococcus,andAlkalibacillus,with the relative abundance of 26.31%,16.49%,8.13%,24.87%, 6.13%,and 1.16%,respectively.At the operational taxonomic unit(OTU)level,results showed that 14 OTUs were with the relative abundance of more than 1.0%,and the cumulative average relative contents of OTU4083(member ofHalanaerobium),OTU4400(member ofChromohalobacter),and OTU846(member ofHalomonas)was39.50%.The results indicated that the bacterial microbiota of biomembrane in Xiangyang mustard root brine was mainlyconsisted by6 genera,includingProteobacteria and Firmicutes,and biomembrane samplesshared a large number ofcore bacterialmicrobiome. Key words：Xiangyang mustard root;biomembrane;bacterium;diversity

TS264.2

0254-5071（2017）07-0143-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.031

2017-04-03

湖北省食品藥品監督管理局科研項目（201601025）；襄陽市科技計劃研究與開發項目（2016）；湖北文理學院食品新型工業化學科群建設項目（2017）

郭壯（1984-），男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。

*通訊作者：趙慧君（1979-），女，講師，博士，研究方向為食品生物技術。