Autotaxin蛋白修飾性位點的生物信息學預測*

曹 睿 趙 邑 潘薇薇 曹鵬程 梁雅麗 謝海軍

（山西省生物研究所 山西太原 030000）

0 引言

Autotaxin（ATX）蛋白1992年首次在人的黑色素瘤細胞系A2058中發現［1］，是一種自分泌活性因子，是分子量為126-kDa的糖蛋白。能夠以溶血磷脂酰膽堿（1ysophosphatidyIcholine，LPC）為底物催化生成溶血磷脂酸（1ysophosphatidic acid，LPA），表現出磷酸二酯酶活性，被歸為磷酸二酯酶家族（ENPP2 家族）［2］。除了磷酸二酯酶活性外，Autotaxin蛋白還同時具有焦磷酸酶和 ATP酶活性［3］。Autotaxin在腫瘤細胞中對腫瘤的發生和發展，特別是腫瘤的遷移起著重要作用，其抑制劑的開發并被認為可能為治療腫瘤提供方法［4］。在Autotaxin蛋白的催化結構域中一些氨基酸的糖基化至關重要，已有研究表明Asn524的糖基化對于Autotaxin蛋白發揮活性是必需的。例如：在脂肪細胞中，Asn53和Asn410的N端糖基化對于Autotaxin的分泌和活性很重要［4-5］。因此研究Autotaxin蛋白的磷酸化、糖基化等催化位點非常重要，可以采取生物信息學手段完成預測工作，為進一步挖掘其生物學意義提供理論基礎和研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人Autotaxin蛋白fasta格式數據來自NCBI蛋白數據庫，全長 915 aa，GenBank號為：AAA64785.1。

1.2 方法 Autotaxin蛋白的磷酸化位點分析分別利用軟件 DISPHOS 1.3［6］、PhosphoSitePlus［7］、KinasePhos［8］、Scansite［9］、NetPhosk［10］、Musite［11］進 行預測，這些軟件是現今比較常用的磷酸化位點預測軟件。

Autotaxin（ATX）蛋白的糖基化位點（N-型、O-型）分別用 NetNGlyc1.0［12］、Uniprot數據庫、NetOGlyc4.0［13］、YinOYang［14］1.2 軟件進行預測。 各數據庫軟件參數如無特別說明均取默認值（表1）。

表1 預測工具軟件簡介

2 結果與分析

2.1 磷酸化位點分析結果 6款軟件預測的所有磷酸化位點中，有4款軟件同時預測到的位點有 2個，分別是：S-330，T-328；有 3款軟件同時預測到的位點有3個，分別是：S-860，S-861，T-333；有2款軟件同時預測到的位點有12個，分別是：S-58，S-302，S-308，S-326，S-327，S-729，S-741，S-865，T-210，T-288，T-83，T-368（表 2）。

6款預測軟件中，DISPHOS 1.3預測的全部結果均與其他軟件預測結果重合，其次，預測重復率較 高 的 軟 件 有 ：Scansite、Musite、PhosphoSitePlus。預測結果最多的為NetPhosk，KinasePhos預測結果中重復預測率較低。NetPhosk是這6款軟件中預測位點最多的，共有Ser修飾位點26個，Thr修飾位點13個，Tyr修飾位點10個。Musite軟件預測的位點最少，Ser修飾位點 3個，Thr修飾位點 1個，Tyr修飾位點1個。

表2 Autotaxin蛋白磷酸化位點預測

通過對預測結果分析可知，絲氨酸（Ser）修飾位點較多，被重復預測到的有11個位點；其次是蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr），被重復預測到的位點均為3個。此外，Scansite還預測到脯氨酸（Pro354、Pro735）及亮氨酸（Leu498）修飾位點。

2.2 糖基化位點分析結果 N型糖基化位點的預測通過Uniprot數據庫查詢及NetNGlyc1.0軟件預測，重復被預測到的位點為N-54。

O型糖基化位點的預測通過NetOGlyc4.0、YinOYang1.2軟件進行，重復被預測到的位點為O-695、O-696、O-712。

3 討論

蛋白質翻譯后修飾對細胞的調控機制起重要作用，它能影響蛋白的多種屬性，包括蛋白質折疊、活性及最終功能［15］。蛋白質的磷酸化和糖基化的過程為：蛋白質在蛋白激酶催化下將磷酸集團由ATP轉移到目標蛋白質上，將低聚糖轉移到蛋白質骨架上，主要的生物學功能有：信號轉導、酶活性調節、新陳代謝、蛋白質穩定性與溶解度，抗原性、蛋白質靶標、細胞-細胞相互作用等［16］。真核生物磷酸化位點一般有絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。其中，絲氨酸和蘇氨酸是最常見的磷酸化位點［17］，因為其結構末端含有羥基，羥基很活潑，可以與磷酸基團結合。所以說，蛋白質中如果某個絲氨酸很保守的話，很大程度上就是磷酸化位點。

本研究利用生物信息學軟件對Autotaxin蛋白進行磷酸化和糖基化位點預測。大部分生物信息學軟件的設計思路是基于已有數據的匯集，結合數學模型的設計和計算機技術的集成開發而成。已有實驗或文獻數據的提供可使預測結果具有可靠性高、可重復性強、可驗證性高的優勢，缺點是較少提供新的數據集，科學合理的數學模型和訓練集可彌補此缺陷。

本研究磷酸化位點預測中使用到的軟件，大部分利用的是隱馬爾科夫模型（DISPHOS 1.3、KinasePhos）［18-19］，NetPhosk 則采用人工神經網絡算法［20］，Musite采用機器學習方法。從軟件本身預測結果及被其他軟件重復預測到的比例看，預測準確 率 排 序 為 ：DISPHOS 1.3、Scansite、Musite、Net-Phosk、PhosphoSitePlus、KinasePhos。 從重復被預測到的結果看，12個位點中有 5個位點（Y-83、T-210、T-288、S-302、S-308）是文獻中有明確報道為磷酸化位點的。不同的數學模型、算法對于預測結果的影響是較為顯著的。因此，在初步篩選數據集階段，應該嘗試多軟件、換參數等方式，達到數據集盡可能精確、可驗證的目的。為實驗驗證提供重要的依據和基礎。

4 結論

識別蛋白質修飾的傳統方法中質譜、磷酸鹽標記等實驗手段能檢測的修飾活性位點十分有限，費時費財，產出較慢。本項目采用高效、可靠的生物信息學手段，對Autotaxin蛋白質修飾活性位點預測，為其抑制劑的開發提供潛在靶點。