QuEChERS/UPLC-MS/MS法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝物

宮小明，華萌萌，王洪濤，王炳軍，馬榮檜

(濰坊出入境檢驗檢疫局，山東 濰坊 261041)

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QuEChERS/UPLC-MS/MS法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝物

宮小明*，華萌萌，王洪濤，王炳軍，馬榮檜

(濰坊出入境檢驗檢疫局，山東 濰坊 261041)

建立了水產(chǎn)品中孔雀石綠(MG)和結(jié)晶紫(CV)及其代謝物隱色孔雀石綠(LMG)和隱色結(jié)晶紫(LCV)殘留的QuEChERS/UPLC-MS/MS分析方法。樣品采用乙腈提取，改進的QuEChERS(EMR-Lipid)分散固相萃取凈化，經(jīng)Agilent Eclipse Plus C18(1.8 μm,3.0 mm×100 mm)色譜柱分離，電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測正離子方式測定。4種分析物在0.2～10.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.997。魚肉中4種分析物在0.5，1.0，5.0 μg/kg加標濃度水平下，回收率為77.1%～106.6%，相對標準偏差(RSD)為1.3%～4.3%。該方法簡單、穩(wěn)定、可靠，能有效去除樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪等大分子雜質(zhì)，可滿足水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫以及隱色代謝物殘留檢測與確證的需要。

QuEChERS；EMR-Lipid；UPLC-MS/MS；孔雀石綠；隱色孔雀石綠；結(jié)晶紫；隱色結(jié)晶紫

孔雀石綠(Malachite green，MG)、結(jié)晶紫(Crystal violet，CV)同屬于堿性三苯甲烷類染料，因具有消毒殺菌作用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常作為殺菌劑和抗寄生蟲藥用于防治各種魚病。MG和CV在生物體內(nèi)分別代謝降解為隱性孔雀石綠(Leucomalachite green，LMG)和隱性結(jié)晶紫(Leucocrystal violet，LCV)。三苯甲烷類及其代謝物具有較高毒性、致癌、致畸、致突變等特性，在生物體內(nèi)具有較高殘留，對人體危害較大，近年成為水體污染和水產(chǎn)品安全的重點監(jiān)控污染物[1-8]。美國、加拿大和歐盟等國已將MG和CV列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥，許多國家也制定了相關(guān)的法律法規(guī)及檢測措施[9]。中國于2002年5月將MG列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》，禁止用于所有食品動物中；農(nóng)業(yè)行業(yè)標準使用準則《無公害食品漁用藥物使用準則》(NY 5071-2002)中也將MG列為禁用藥物，同時嚴禁在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用MG和CV，并規(guī)定MG(含LMG)和CV(含LCV)不得檢出[10]。但由于MG抗菌效果好、價格低、替代品少等原因，仍有少部分養(yǎng)殖用戶違法使用。

目前，三苯甲烷類物質(zhì)的測定多采用液相色譜法(紫外檢測[11]、熒光檢測[12])或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[3-7]。由于LMG和LCV在紫外可見區(qū)無吸收峰，而MG和CV無熒光響應(yīng)，故采用高效液相色譜法同時測定這幾類物質(zhì)時常需借助一定的前處理手段，造成過程繁瑣且方法檢出限較高，無法滿足實際檢測要求。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法國內(nèi)外屢見報道[13-14]，該方法靈敏度高，對凈化要求高，并且可同時進行定量檢測和定性確證。本研究采用新型的QuEChERS-EMR技術(shù)進行前處理，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進行檢測，建立了水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫以及隱色代謝物殘留同時檢測的方法。本方法簡單、快速、可靠，克服了傳統(tǒng)QuEChERS[15-19]吸附粉末去除蛋白質(zhì)、脂肪等大分子效果差的缺點，通過采用新型吸附劑EMR，不僅能夠有效去除動物樣品中的大分子雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)，提高方法的準確度和精密度，還能夠降低檢測過程中對質(zhì)譜源和液相色譜柱的污染。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260-6430液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent1200-6430)；萬分之一天平(Mettler AE163)；均質(zhì)器(IKA T25)；振蕩器(IKA MS1)；離心機(Eppendorf 5810R)；氮吹儀(Organomation N-EVAP-111)。

乙腈、甲醇、甲酸(色譜純)；實驗用水為Milli-Q超純水，使用前過0.45 μm濾膜；QuEChERS dSPE EMR-lipid，F(xiàn)inal Polish EMR-lipid(Agilent公司);中性Al2O3(分析純)、N-丙基乙二胺粉(PSA)、二甲基十八碳硅烷粉(ODS)、氨丙基粉(NH2)均購自Agela 公司。孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫標準品(純度≥99%)，均購自Sigma公司；同位素內(nèi)標孔雀石綠-D5購自Witega公司，隱色孔雀石綠-D6、結(jié)晶紫-D6、隱色結(jié)晶紫-D6同位素內(nèi)標均購自Sigma公司，用乙腈溶解定容至100 mL，得濃度為100 mg/L的標準儲備液，避光于4 ℃下保存。

1.2 樣品處理

1.2.1 提 取 稱取4.0 g(精確至0.1 g)樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，均質(zhì)3 min，4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，上清液過濾備用。

1.2.2 凈 化 QuEChERS dSPE EMR-lipid(除脂分散凈化包)預先用5 mL水浸潤活化(需渦混)，加入5 mL上清液(“1.2.1”提取液)至 EMR-lipid管中，渦混5 min，以盡量去除樣品中的脂類等雜質(zhì)。4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min。 取上清液5 mL移入Final Polish EMR-lipid(除脂萃取鹽包)中，渦混5 min，確保最后一步去除雜質(zhì)的效果最佳。然后在4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min。上清液分為有機層(上層)和水層(下層)，取有機層2 mL至10 mL玻璃管中，在45 ℃用氮氣濃縮儀吹干。準確加入1.0 mL初始流動相溶解殘渣，過0.2 μm濾膜，進行質(zhì)譜檢測。

1.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(1.8 μm,3.0 mm×100 mm);柱溫：40 ℃，流速：0.3 mL/min,進樣量：10 μL；流動相：A為 5 mmol/L乙酸銨-0.02%甲酸水，B為乙腈，梯度洗脫程序：0～3 min，20%B ；3～5 min，20%～90%B；5～5.5 min，90%～20%B；5.5～7.5 min，20%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電離源：電噴霧離子源(ESI+)；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；離子源溫度：350 ℃；干燥氣流速：9 L/min；噴霧針壓力：40 psi；電子倍增器電壓：4 000 V；碰撞氣：高純氮(純度為99.999%)。4種待測物及內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

水產(chǎn)品基質(zhì)的化學成分復雜，且其脂肪含量較高，而孔雀石綠和結(jié)晶紫在水產(chǎn)品中主要以其隱色代謝物形式存在，這些隱色代謝物具有很好的親脂性。本文分別考察了甲醇、乙腈作為提取溶劑的效果，發(fā)現(xiàn)兩者均可得到良好的提取效果，但乙腈能更有效地沉淀蛋白，減少雜質(zhì)干擾，同時也利于下一步QuEChERS凈化，因此實驗選擇乙腈作為提取溶劑。

表1 4種待測物及內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 4 analytes and their isotope labeled standards

*quantitation ion

2.2 吸附劑粉對目標物回收率的影響

將2 mL用初始流動相溶解的一定濃度的4種待測物混標溶液分別加入150 mg ODS，PSA，NH2以及中性Al2O3中；將5 mL相同濃度的混標溶液加入 1.0 g EMR-Lipid中處理，經(jīng)渦混、離心后，取1 mL上清液，氮吹，流動相定容，過0.2 μm濾膜，上機檢測，計算平均回收率及相對標準偏差，以考察不同吸附劑粉對回收率的影響(數(shù)據(jù)見表2)。從表2可以看出，PSA和ODS對孔雀石綠和隱色孔雀石綠有基質(zhì)增強作用，NH2對結(jié)晶紫的吸附作用較強，而中性Al2O3和EMR-Lipid對4種待測物無明顯吸附作用。

表2 4種待測物分別經(jīng)不同吸附劑處理后的平均回收率和相對標準偏差 (%)Table 2 Average recoveries and relative standard deviations(RSDs) of 4 analytes after adsorbed by different adsorbents(%)

2.3 EMR凈化效果的研究

傳統(tǒng)QuEChERS法的原理是通過吸附粉末的吸附作用達到凈化效果，此種凈化方法主要用于農(nóng)殘檢測中中小分子雜質(zhì)的去除。本方法進一步引入新型的吸附劑(EMR)，通過疏水選擇性結(jié)合吸附作用，可有效去除含有直鏈烴類結(jié)構(gòu)官能團的脂類等大分子物質(zhì)，顯著降低基質(zhì)效應(yīng)，提高方法的準確度和靈敏度。

2.3.1 對凈化效果的考察 將未凈化的魚肉基質(zhì)提取液(“1.2.1”提取液)和經(jīng)NH2，ODS，PSA，Al2O3，EMR-Lipid凈化后的樣品液(“2.2”樣品液)分別在不接色譜柱的方式下，利用質(zhì)譜在全掃描方式下進行考察。結(jié)果顯示，雜質(zhì)離子峰m/z132.1，441.2，606.2經(jīng)NH2，ODS，PSA，Al2O3凈化后的效果不明顯，而經(jīng)EMR-Lipid凈化后明顯降低，說明該方法對大分子和小分子雜質(zhì)均有明顯的吸附作用。

圖1 4種目標物的定量離子色譜圖(0.4 μg/L)Fig.1 Quantitative ion overlap chromatograms of four analytes (0.4 μg/L)

2.3.2 對目標物出峰時間段雜質(zhì)干擾凈化效果的研究 4種目標物混合標準溶液經(jīng)液相色譜分離后，其定量離子色譜峰的出峰時間為4.2～5.2 min(如圖1)。分別將未凈化魚肉基質(zhì)提取液(“1.2.1”提取液)和經(jīng)NH2，ODS，PSA，Al2O3，EMR-Lipid凈化后的樣品液(“2.2”樣品液)經(jīng)色譜分離，在目標物4.2～5.2 min出峰時間段內(nèi)通過質(zhì)譜在全掃方式下進行分析。實驗結(jié)果顯示，主要雜質(zhì)峰m/z494.3和520.3經(jīng)EMR-Lipid凈化后含量大大降低，有效降低了共流出基質(zhì)干擾帶來的基質(zhì)效應(yīng)，提高了方法的準確度和靈敏度。

2.3.3 EMR-Lipid凈化后的基質(zhì)效應(yīng)研究 通過比較空白魚肉樣品提取液(添加4種目標物0.5 μg/kg)經(jīng)EMR-Lipid凈化前后的MRM色譜圖發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)EMR-Lipid凈化的樣品中MG和LMG受基質(zhì)干擾效應(yīng)明顯，響應(yīng)值低，峰形差，且有明顯的雜質(zhì)干擾峰；而經(jīng)EMR-Lipid凈化后準確度和靈敏度顯著提高，能夠進行定量定性分析。

2.4 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的極性較強，在反相色譜柱上的保留較弱，因此在初始流動相中乙腈的比例較低。本研究比較了0.1%甲酸-乙腈、5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸-乙腈和5 mmol/L乙酸銨-0.02%甲酸-乙腈3種不同流動相對4種目標物的分離效果。實驗表明，在乙腈中加入0.1%甲酸作為流動相時，LCV的響應(yīng)值低，加入5 mmol/L乙酸銨后，LCV的峰形變差，而在加入0.02%甲酸和5 mmol/L乙酸銨的流動相中，LCV的峰形得到改善，且響應(yīng)值明顯提高，因此實驗選擇5 mmol/L乙酸銨-0.02%甲酸-乙腈作為流動相。

2.5 線性范圍、定量下限、回收率與相對標準偏差

采用內(nèi)標法定量(內(nèi)標物為孔雀石綠-D5、隱色孔雀石綠-D6、結(jié)晶紫-D6、隱色結(jié)晶紫-D6)，用初始流動相配制一系列不同濃度的孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物混合標準溶液作標準曲線進行分析，以峰面積響應(yīng)強度為縱坐標(Y)，待測物濃度為橫坐標(X,μg/L)，其回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。結(jié)果顯示，4種分析物在0.2～10.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.997。以3倍信噪比(S/N)對應(yīng)的加標水平為檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)對應(yīng)的加標水平為定量下限(LOQ)，測得4種目標物的檢出限均為0.2 μg/kg，定量下限均為0.5 μg/kg。

用空白樣品加標方法進行回收率和精密度實驗。分別對魚肉進行0.5，1.0，5.0 μg/kg 3個不同濃度水平的加標回收實驗，每個水平平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表3。4種化合物的回收率為77.1%～106.6%，相對標準偏差(RSD)為1.3%～4.3%。

表3 4種待測物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率及相對標準偏差Table 3 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients(r)，recoveries and relative standard deviations(RSDs) of 4 analytes

2.6 實際樣品檢測

采用本方法對本地市場上銷售的多寶魚進行4種目標物含量的檢測，結(jié)果測得孔雀石綠為1.48 μg/kg，隱色孔雀石綠為1.34 μg/kg，如圖2所示。

3 結(jié) 論

本文采用EMR凈化方法的原理通過疏水選擇性結(jié)合吸附作用，有效去除了含有直鏈烴類結(jié)構(gòu)官能團的脂類等大分子物質(zhì)，顯著降低了基質(zhì)效應(yīng)，提高了方法的準確性和靈敏度。進一步引入新型的吸附劑(EMR)，利用改良的QuEChERS(EMR-lipid)法進行樣品前處理，不僅能夠去除中小分子雜質(zhì)，還能夠有效去除動物組織中的蛋白、脂肪等大分子雜質(zhì)，再利用高效液相色譜法-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進行檢測，建立了同時測定水產(chǎn)品中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的方法。該方法具有適用性強、簡單快速、經(jīng)濟等特點，可用于實際樣品的日常檢測。本方法參加了國家認監(jiān)委組織的“魚肉中孔雀石綠測定”能力驗證項目(合格證書編號：CNCA-16-B11-26)，取得了滿意結(jié)果。

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Determination of Malachite Green，Crystal Violet and Their Metabolites Residues in Aquatic Product by QuEChERS Combined with UPLC-MS/MS

GONG Xiao-ming*，HUA Meng-meng，WANG Hong-tao,WANG Bing-jun,MA Rong-hui

(Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Weifang 261041,China)

A method for the determination of malachite green(MG)，crystal violet(CV) and their metabolites residues leucomalachite green(LMG) and leucocrystal violet(LCV) in aquatic product was developed using QuEChERS combined with UPLC-MS-MS.The sample was extracted with acetonitrile and purified by EMR-Lipid.The target compounds were separated on an Agilent Eclipse Plus C18(1.8 μm,3.0 mm×100 mm) column,and detected by tandem mass spectrometry with electrospray ionization in positive mode.The linear ranges were in the range of 0.2-10.0 μg/L and the correlation coefficients were all above 0.997．The average recoveries of 4 analytes in fish matrix at three spiked concentrations of 0.5，1.0，5.0 μg/kg ranged from 77.1% to 106.6%,with relative standard deviations of 1.3%-4.3%．This method was simple and reliable，and could effectively remove the protein and fat in sample.Therefore,it is suitable for the determination of MG,CV and their leuco metabolites residues in aquatic product.

QuEChERS;EMR-Lipid；UPLC-MS-MS;malachite green(MG)；leucomalachite green(LMG)；crystal violet(CV)；leucocrystal violet(LCV)

2017-02-14；

2017-03-06

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.010

O657.63;F767.4

A

1004-4957(2017)07-0897-05

*通訊作者：宮小明，碩士，高級工程師，研究方向：農(nóng)獸藥殘留及添加劑分析，Tel：0536-8582599， E-mail:9647125@qq.com