子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜HIF-1α、CD34、CD54的表達及相互關(guān)系※

賈云波 杜惠蘭 姚穎玉 宮學華

(河北省廊坊衛(wèi)生職業(yè)學院中醫(yī)教研室，河北 廊坊 065001)

子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜HIF-1α、CD34、CD54的表達及相互關(guān)系※

賈云波 杜惠蘭△姚穎玉1宮學華2

(河北省廊坊衛(wèi)生職業(yè)學院中醫(yī)教研室，河北 廊坊 065001)

目的 觀察缺氧誘導因子1α(HIF-1α)、CD34、CD54與子宮內(nèi)膜異位癥(EMS)發(fā)生的關(guān)系，以期探討EMS的發(fā)病機制。方法 選取26例EMS手術(shù)患者，所有病例均經(jīng)腹腔鏡或開腹手術(shù)確診，經(jīng)病理證實為腹膜型EMS 8例，卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫9例，子宮腺肌癥9例，同期選取子宮肌瘤手術(shù)患者6例為對照組，應(yīng)用免疫組織化學法(SP)測定2組子宮內(nèi)膜組織中HIF-1α、CD34、CD54的表達。結(jié)果 HIF-1α、CD34、CD54在腹膜型EMS組、卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組、子宮腺肌癥組的表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HIF-1α與CD34、CD54的表達呈正相關(guān)。結(jié)論 HIF-1α可能在EMS異位病灶形成中起重要作用，推測內(nèi)異癥的發(fā)生與局部病灶缺氧有關(guān)。且HIF-1α與CD34的表達呈正相關(guān)，提示HIF-1α可以促進內(nèi)異癥組織血管生成；HIF-1α與CD54的表達呈正相關(guān)，推測HIF-1α可加強異位內(nèi)膜細胞的黏附作用，從而有利于形成異位灶。

子宮內(nèi)膜異位癥；缺氧誘導因子1,α亞基；抗原,CD34；胞間黏附分子1

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)是育齡期婦女常見病，臨床表現(xiàn)為不孕、性交痛、慢性盆腔痛、痛經(jīng)等，嚴重影響患者的身心健康[1]。該病的發(fā)病機制至今尚未完全闡明。EMS有3種病變形式：腹膜型EMS、卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫、子宮腺肌癥。EMS雖是良性病變，但有惡性生物學行為，乏氧是惡性腫瘤發(fā)展過程中的普遍現(xiàn)象。缺氧誘導因子1α(HIF-1α)是乏氧的重要代表因子[2]，在EMS中異位的子宮內(nèi)膜碎片由于缺乏相應(yīng)的血管供應(yīng)，面臨缺血、缺氧環(huán)境[3]，本研究通過研究乏氧與EMS血管生成、黏附機制的關(guān)系，為EMS的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

1.1.1 診斷標準 符合中華醫(yī)學會婦產(chǎn)科學分會子宮內(nèi)膜異位癥協(xié)作組制訂的《子宮內(nèi)膜異位癥的診治指南》[4]。

1.1.2 納入標準 ①符合上述診斷標準；②B超檢查結(jié)果支持，伴有周期性疼痛性交痛以及不孕等臨床癥狀；③經(jīng)醫(yī)學倫理會審核通過，獲知情同意，自愿參與研究。

1.1.3 排除標準 ①合并盆腔、子宮及其附件慢性炎性疾病；②子宮發(fā)育不良或存在惡性病變，如子宮肌瘤、子宮腺肌瘤等。

1.2 一般資料 全部32例均為河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院(11例)、石家莊市第六醫(yī)院(11例)、河北省中醫(yī)院(10例)2012-10—2015-12行婦科手術(shù)的住院患者，研究組26例為婦科手術(shù)治療的EMS患者，術(shù)后經(jīng)病理證實為腹膜型EMS 8例，卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫9例，子宮腺肌癥9例；年齡27～48歲，平均(38.83±5.16)歲。對照組選擇同期住院的子宮肌瘤患者6例，術(shù)后經(jīng)病理證實為正常子宮內(nèi)膜，年齡35～47歲，平均(40.63±3.23)歲。全部患者均知情同意，2組年齡分布均衡，比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.3 觀察指標及方法

1.3.1 儀器與試劑 HIF-1α兔抗人多克隆抗體為濃縮型工作液(工作濃度1∶100)；CD34鼠抗IgG多克隆抗體、CD54鼠抗IgG多克隆抗體，均購自武漢博士德生物工程有限公司；Nikon尼康光鏡顯微照相機；LEICA RM2125石蠟切片機。

1.3.2 取材方法 組織取材：手術(shù)取分泌期內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織、卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫囊壁、子宮腺肌癥組織5～6 mm大小；對照組取分泌期行手術(shù)子宮肌瘤患者的正常子宮內(nèi)膜組織5 mm大小，立即浸入4%的多聚甲醛固定液中，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片做蘇木精-伊紅(HE)染色。

1.3.3 HIF-1α、CD34、CD54表達 采用免疫組織化學法(SP)測定，免疫組化主要步驟如下：切片常規(guī)脫蠟至水；0.01 M磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次5 min；0.3%甲醇-過氧化氫室溫下孵育20 min；蒸餾水清洗3次，每次5 min；0.1 M枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)微波爐內(nèi)修復，98 ℃維持20 min；冷卻至室溫；10%山羊血清，37 ℃溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min；濾紙吸去多余血清，加入一抗(稀釋1∶100)；0.01 M PBS清洗3次，每次5 min；滴加生物素化二抗(山羊抗兔)工作液，37 ℃溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min；0.01 M PBS清洗3次，每次5 min；滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃溫箱濕盒內(nèi)孵育30 min；0.01 M PBS清洗3次，每次5 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色2～5 min；自來水充分沖洗，終止顯色；梯度酒精脫水：70%、80%、90%酒精5 min，95%酒精10 min，100%酒精Ⅰ、Ⅱ各15 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各15 min透明；中性樹膠封固，陰性對照用PBS替代一抗；HIF-1α、CD34、CD54均以胞漿、胞核內(nèi)黃色細顆粒為陽性結(jié)果。

1.3.4 陽性細胞圖像分析 所有標本均在Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)內(nèi)，在相同的放大倍數(shù)下，每個切片計數(shù)10個視野，分析各指標的表達情況，以指征陽性信號的表達強度。HIF-1α、CD54結(jié)果的測定是以灰度值表示,值越低,表達含量越高；CD34的表達以平均光密度值(入射光/出射光，取對數(shù))表示，值越高，含量越高。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，采用成組資料的方差分析；兩變量相關(guān)關(guān)系用直線相關(guān)分析，以Spearman相關(guān)系數(shù)表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組子宮內(nèi)膜HIF-1α、CD34、CD54表達情況 見表1。

由表1可見，HIF-1α、CD34、CD54在腹膜型EMS組、卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組、子宮腺肌癥組的表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 HIF-1α在各組內(nèi)膜組織中的表達 HIF-1α陽性表達呈棕黃色顆粒，主要定位于腺體胞漿或胞核中，HIF-1α在腹膜型EMS組、卵巢巧克力囊腫組及子宮腺肌癥組異位內(nèi)膜及間質(zhì)中均有表達，HIF-1α在以上3組的表達均高于對照組。見圖1。

表1 各組子宮內(nèi)膜HIF-1α、CD34、CD54表達情況

與對照組比較，*P<0.05

對照組 卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組 子宮腺肌癥組 腹膜型EMS組
圖1 HIF-1α在各組的表達(×400)

2.2 CD34在各組內(nèi)膜組織中的表達 CD34的陽性表達在新生血管內(nèi)皮細胞的胞漿中，對照組新生血管少，在卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組、子宮腺肌癥組、腹膜型EMS組新生血管多，CD34在以上3組的表達均高于對照組。見圖2。

對照組 卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組 子宮腺肌癥組 腹膜型EMS組
圖2 CD34在各組的表達(×200)

2.3 CD54在各組內(nèi)膜組織中的表達 CD54陽性表達在腺體細胞胞漿中,對照組陰性表達。子宮腺肌癥組表達呈弱陽性，卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組及腹膜型EMS組除在腺體表達外,在血管內(nèi)皮細胞中也有表達,CD54在以上3組的表達均高于對照組。見圖3。

對照組 卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組 子宮腺肌癥組 腹膜型EMS組
圖3 CD54在各組的表達(×400)

2.4 兩變量相關(guān) 用直線相關(guān)分析，以Spearman相關(guān)系數(shù)表示,結(jié)果示:HIF-1α與CD34的表達呈正相關(guān)(r=0.873)、P=0.01(雙側(cè))；HIF-1α與CD54的表達呈正相關(guān)(r=0.857)、P=0.01(雙側(cè))。

3 討 論

EMS為育齡期婦女常見病，其病因尚不完全清楚。EMS雖是一種良性病變，但有惡性腫瘤的生物學特征，其發(fā)病機制至今仍存在爭議。異位灶形成有3個步驟：黏附、侵襲、血管生成[5]，異位內(nèi)膜必須持續(xù)存活足夠長的時間才能完成該過程，在此過程的早期，細胞必然處于一個缺血、缺氧的環(huán)境。Sharkey等[6]體外研究證實低氧可作為獨立的因素調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生。Smith SK[7]也認為月經(jīng)期脫落的子宮內(nèi)膜本身處于缺氧狀態(tài)。

研究證實HIF-1α在維持腫瘤細胞的能量代謝、新生血管形成、細胞增殖等方面起重要作用[8]。在腫瘤發(fā)生早期可發(fā)生HIF-1α的過度表達，且與腫瘤血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]。HIF-1α在EMS的形成和發(fā)展中是否起到一定作用，值得我們探索。HIF-1α是機體處于缺氧狀態(tài)的惟一調(diào)控因子，調(diào)控參與血管生成的各種因子，可促進EMS異位內(nèi)膜的生長[10]。缺氧使HIF-1α表達增強，激活一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，使細胞獲得對組織低氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)減少的適應(yīng)能力，維持細胞的生存與增殖[11]。Sharkey等[6]提出缺氧條件下促進大量新生血管的形成可能是EMS的發(fā)病機制之一。有研究發(fā)現(xiàn)，在EMS患者在位子宮內(nèi)膜組織中，HIF-1α的表達較正常子宮內(nèi)膜升高，在微觀上已具有與正常內(nèi)膜不同的生物學特性，此結(jié)果符合“在位內(nèi)膜決定論”[12]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)EMS與血管生成關(guān)系密切[13]，從而提出一個新的病因?qū)W說：血管形成學說。

CD34抗體最常用來標記腫瘤血管內(nèi)皮細胞，新近國內(nèi)外報道顯示，以CD34標記血管內(nèi)皮細胞的特異性最強[14]。Donnez等[15]認為EMS紅色病變中血管生成及有絲分裂活性最高，表明在異位灶形成早期組織內(nèi)新生血管更豐富，有利于病灶浸潤、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，CD34在腹膜型EMS組、卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組及子宮腺肌癥組的表達均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

CD54參與細胞的生長移行、腫瘤的轉(zhuǎn)移浸潤、血管生成等一系列的生理、病理過程[16]，可作為EMS黏附機制的代表因子。黏附分子的高表達均有助于異位組織逃避機體免疫系統(tǒng)和自然殺傷細胞的殺傷，對異位組織侵入腹膜、卵巢等起促進作用[17]。本研究結(jié)果顯示，CD54在腹膜型EMS組、卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫組及子宮腺肌癥組的表達均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

綜上所述，本研究EMS患者子宮內(nèi)膜組織HIF-1α高于正常子宮內(nèi)膜組，提示EMS的形成可能與乏氧關(guān)系密切。HIF-1α與CD34的表達呈正相關(guān)，提示HIF-1α可以促進EMS組織血管生成；HIF-1α與CD54的表達呈正相關(guān)，推測HIF-1α可加強異位內(nèi)膜細胞的黏附作用，從而有利于形成異位灶。

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(本文編輯：李珊珊)

The expression and correlation of HIF-1α, CD34 and CD54 in endometrium of patients with endometriosis

JIAYunbo*,DUHuilan,YAOYingyu,etal.

*DepartmentofTeachingandResearchofTraditionalChineseMedicine,LangfangHealthVocationalCollegeinHebeiProvince,Hebei,Langfang065001

Objective To observe the relationship between hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1α), CD34, CD54 and endometriosis (EMS), in order to explore the pathogenesis of EMS.Methods 26 EMS surgery patients were selected, all cases were diagnosed by laparoscopy or laparotomy. Confirmed by pathology, 8 cases were peritoneal EMS, 9 cases were ovarian endometriosis cyst and 9 cases were adenomyosis. Six patients with uterine fibroids surgery were selected as control group at the same time. The expression of HIF-1α, CD34, CD54 in endometrial tissues were detected by streptavidin-perosidase (SP) in two groups. Results The expression of HIF-1α, CD34, CD54 in peritoneal EMS group, ovarian endometriosis cyst group and adenomyosis group was higher than that in control group, with statistical difference (P<0.05). HIF-1α was positively correlated with the expression of CD34 and CD54. Conclusion HIF-1α may play an important role in the formation of EMS ectopic lesions,speculating that the occurrence of endometriosis related to hypoxia in local lesions. Moreover, HIF-1α was positively correlated with the expression of CD34 suggesting that HIF-1α can promote angiogenesis in EMS tissue. HIF-1α was positively correlated with the expression of CD54 suggesting that HIF-1α can enhance the adhesion of ectopic endometrial cells, thus which is conducive to the formation of ectopic lesions.

Endometriosis; Hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit; Antigen, CD34; Intercellular adhesion molecule 1

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.07.008

※ 項目來源：河北省科學技術(shù)廳科技計劃項目(編號：132777155)；河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目(編號：2014027)

△ 通訊作者：河北中醫(yī)學院婦科教研室，河北 石家莊 050091

1 中國石油天然氣集團公司中心醫(yī)院中醫(yī)科，河北 廊坊 065000

2 中國石油天然氣集團公司中心醫(yī)院門診部，河北 廊坊 065000

賈云波(1982—)，女，主治醫(yī)師，博士。研究方向：生殖與內(nèi)分泌專業(yè)。

R711.71

A

1002-2619(2017)07-0992-05

2017-01-17)