葛根素聯合國產多孔鉭對人成骨細胞COL-I、OC、OPN表達和細胞增殖的影響

劉永慶 李琪佳 甘洪全 王茜 張大鵬 王志強*

1.華北理工大學，河北 唐山 063000 2.華北理工大學醫學中心實驗室，河北 唐山 063000 3.華北理工大學附屬醫院骨科，河北 唐山 063000 4.華北理工大學基礎醫學院，河北 唐山 63000

葛根素是從中藥葛根中提取的主要藥用成分，屬于植物雌激素[1]。近年研究發現，葛根素能劑量依賴性促進大鼠原代成骨細胞分化，對老年骨質疏松癥和骨折愈合具有良好的治療作用[2]。葛根素可能通過雌激素受體介導促進成骨細胞增殖及骨形成作用，當葛根素在1×10-10mol/L至1×10-7mol/L濃度范圍內時，其對成骨細胞促增殖作用最強[3]。多孔鉭材料呈三維連通多孔網狀結構，表面均勻分布的蜂窩狀孔隙，內部包含大量微孔結構，可增加細胞對纖維素的捕獲能力并且能夠促進成骨細胞黏附與聚集，加快骨整合及整合強度，促進骨長入，加快骨形成[4]。本研究試圖探討植物類雌激素葛根素和國產多孔鉭材料對成骨細胞增殖和分化的作用機制以及為臨床應用植物雌激素和國產多孔鉭支架材料治療骨愈合和再生提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

MG-63人成骨細胞株購自北京協和醫學院細胞庫；國產多孔鉭支架材料由重慶潤澤醫療器械有限公司提供；葛根素購置陜西安康制藥；JSM-6030LV掃描電子顯微鏡購置日本電子株式會；CCK-8法細胞增殖檢測試劑盒購置北京天恩澤基因有限公司；RT-PCR試劑盒購置美國Invitrigen公司；兔抗人COL-I抗體、兔抗人OC抗體、小鼠抗人OPN抗體和兔抗人GAPDH均購置于美國ABGENT公司。

1.2 方法

1.2.1MG-63人成骨細胞的培養：MG-63人成骨細胞用含10% FBS、1% NEAA、1%雙抗的α-MEM完全培養基培養，并置于37℃、5% CO2培養箱中，約2～3d即可鋪滿瓶底，細胞生長匯合至80%時可進行傳代。

1.2.2掃描電鏡觀察：利用掃描電鏡觀察多孔鉭支架材料表面結構、孔隙形態；觀察培養第5天的多孔鉭-成骨細胞和葛根素多孔鉭-成骨細胞復合培養的多孔鉭支架材料表面形態。

1.2.3藥物處理細胞：取對數生長期的MG-63細胞，培養24 h待細胞貼壁后，更換含有1% FBS的α-MEM培養基培養24 h，使細胞同步化。然后加入不同終濃度的葛根素(0.01、0.1、1 μmol/L)，各濃度組設置3個復孔。

1.2.4成骨細胞與葛根素和多孔鉭支架材料共培養：國產多孔鉭支架材料先用超聲波清洗器清洗15 min，高壓蒸汽滅菌30 min。放入無菌6孔板，α-MEM培養液預濕，24 h后棄去多余液體，備用。取300 μL密度為2×104個/mL的不同終濃度的葛根素(0.01、0.1、1μmol/L)藥物處理細胞懸液，接種在多孔粗支架材料表面，置于37℃，5% CO2的培養箱內培養2 h，將多孔鉭材料上下翻轉，并按上述接種方法滴加材料另一面，并置于37℃，5% CO2的培養箱內培養2 h，各孔加入2 mL的α-MEM培養液，繼續培養。

1.2.5實驗分組：葛根素組：不同終濃度葛根素(0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L)與MG-63人成骨細胞共培養。并篩選出葛根素作用最佳劑量濃度組，行進一步實驗；多孔鉭組：國產多孔鉭支架與MG-63人成骨細胞共培養；葛根素多孔鉭組：葛根素、國產多孔鉭與MG-63人成骨細胞共培養；空白組：單純MG-63人成骨細胞培養。

1.2.6CCK-8法檢測各組對成骨細胞增殖的影響：取生長狀態良好的MG-63細胞，制成單細胞懸液，6組均以每孔2×104個/mL的細胞密度接種于無菌24孔板中，將其置于37℃、5% CO2培養箱中培養，每隔48h更換1次培養基；連續培養至7d，每隔2天每組各取12孔，每孔均更換500μL新的培養基，并加入50 μL CCK-8溶液，將24孔板置于37℃、5% CO2培養箱中繼續培養2 h；在24孔板各孔中吸取100 μL上清并依次加至96孔板各孔中；在波長490 nm處用酶標儀檢測96孔板各孔吸光度(OD值)。

1.2.7RT-PCR法檢測各組細胞COL-Ⅰ、OC、OPN mRNA的表達水平：按照Trizol一步法提取培養5d的各組成骨細胞總RNA。并根據公式計算出總RNA濃度和純度，RNA濃度統調整為500 ng/μL，利用M-MuLV逆轉錄酶合成cDNA，利用Primer5.0軟件設計引物，合成的各基因PCR引物序列(如表1)。利用SYBR qPCR Mix 進行PCR擴增體系反應，設定反5 s，56℃退火25 s，72℃延伸20 s，總共40個循環，72℃延伸5 min。通過相對定量方法Comparative Delta-delta Ct 分析PCR結果。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primers sequences

1.2.8免疫細胞化學染色法檢測各組細胞COL-I、OC、OPN蛋白的表達情況：將各組制成單細胞懸液，以1×106個/mL密度接種于預先置有無菌蓋玻片的6孔板中。待細胞生長至半匯合后，取出無菌蓋玻片，PBS洗蓋玻片3次，4%多聚甲醛固定30 min，棄去多聚甲醛溶液，PBS洗3次；滴加適量0.5% Triton-100至蓋玻片上，室溫條件下裂解20 min，PBS洗3次，2 min/次；滴加適量3% H2O2至蓋玻片上，室溫孵育15 min，達到阻斷內源性過氧化物酶的作用，PBS洗3次；滴加各適量一抗(1∶150)；4℃過夜，PBS洗3次，2 min/次；滴加適量二抗，37℃培養箱中孵育30 min，PBS洗3次，每次2 min；進行DAB顯色，將蓋玻片浸入梯度酒精內進行逐級脫水，二甲苯透明，中性樹膠進行常規封片，采用Image Pro-Plus圖像分析軟件半定量分析染色指數結果。

1.3 統計學分析

運用SPSS17.0統計軟件對實驗數據進行統計處理。統計分析采用單因素方差分析，進行各組間兩兩比較時，采用LSD-t檢驗方法，進行兩個實驗因素的各水平組合的實驗時，采用兩因素析因設計資料的方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 掃描電鏡下觀察多孔粗支架材料及復合物

國產多孔鉭大體觀察呈蜂窩狀，光潔，質硬，表面粗糙不平，分布均勻的空隙，針尖樣大小(圖1A)。掃描電鏡觀察，國產多孔鉭支架材料具有大量均勻分散的微孔結構，直徑約400～600 μm，內部孔隙之間相互連通，孔隙間小梁支柱呈微孔樣結構(圖1B)。掃描電鏡下觀察成骨細胞在多孔鉭表面和微孔內成疊層黏附生長，伸出細胞偽足，細胞間相互連接并融合成片狀，分泌的基質覆蓋于多孔鉭支架表面及微孔內(圖1C、D)。表明人成骨細胞在國產多孔鉭支架上伸展性良好，可連接成片狀，細胞基質分泌正常，細胞及細胞基質可覆蓋多孔鉭表面。

2.2 各組成骨細胞增殖情況

通過酶標儀測得各組OD值(見表2)。隨著培養時間的延長，葛根素組細胞增殖活性顯著高于空白組，但葛根素不同濃度組(0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L)，以葛根素1 μmol/L組細胞的生長最快，差異統計學意義(P<0.05)；多孔鉭組細胞增殖活性亦顯著高于空白組(P<0.05)；葛根素組和多孔鉭組細胞增殖活性無統計學差異(P>0.05)。經析因方差分析得出，葛根素和多孔鉭均可促進成骨細胞的增殖活性，兩者之間具有協同促進細胞快速增殖的作用。

表2 CCK-8法檢測各組細胞生長增殖情況(OD)Table 2 CCK-8 to detect the osteoblasts proliferation in different groups of cells (OD)

注：△：P<0.05VS其它各組；*：P<0.05VS空白組；※：P<0.05VS空白組

2.3 各組成骨細胞COL-Ⅰ、OC和OPN mRNA的表達水平

本實驗通過比較CT法對數據進行分析處理，各組成骨細胞COL-Ⅰ、OC和OPN mRNA的相對表達量結果(見表3)。葛根素組和多孔鉭組的COL-Ⅰ與OC mRNA表達量均顯著高于空白組(P<0.05)，葛根素組和多孔鉭組的COL-Ⅰ與OC mRNA表達量無顯著性差異(P>0.05)，葛根素多孔鉭組COL-Ⅰ與OC mRNA表達量均顯著高于其它各組，各組間OPN mRNA的表達差異無統計學意義(P>0.05)，各組間經析因方差分析得出：葛根素和多孔鉭均可促進成骨細胞COL-Ⅰ與OC mRNA的表達，兩者之間具有協同促進COL-Ⅰ與OC mRNA的表達作用，但對OPN mRNA的表達無顯著影響。

組別COL-ⅠOCOPN葛根素組1.48±0.58?1.50±0.13?1.10±0.12多孔鉭組1.44±0.61※1.52±0.22※1.08±0.28葛根素多孔鉭組1.92±0.25△1.87±0.63△1.13±0.56空白組1.001.001.00F23.60720.4632.401P0.0030.0010.125

注：△：P<0.05VS其它各組；*：P<0.05VS空白組；※：P<0.05VS空白組

2.4 各組成骨細胞COL-I、OC、OPN蛋白的表達情況

采用Image-Pro Plus圖像分析系統對各組進行半定量分析得出結果(見圖2、3、4和表4)。COL-I、OC和OPN蛋白均表達于成骨細胞胞漿，陽性反應呈棕黃色顆粒，可見各組細胞均不同程度表達COL-Ⅰ、OC與OPN，細胞胞漿中可見大量棕黃色顆粒。葛根素組和多孔鉭組的COL-Ⅰ與OC表達量均顯著高于空白組(P<0.05)，葛根素多孔鉭組COL-Ⅰ與OC表達量均顯著高于其它各組(P<0.05)，葛根素組和多孔鉭組的COL-Ⅰ與OC表達量無顯著性差異(P>0.05)，但各組間OPN蛋白的表達量無統計學意義(P>0.05)。經析因方差分析得出：葛根素和多孔鉭均可促進成骨細胞COL-Ⅰ與OC蛋白的表達，兩者之間具有協同促進COL-Ⅰ與OC蛋白表達的作用，但對OPN蛋白的表達無顯著影響。

組別COL-IOCOPN葛根素組16.690±0.890?17.643±1.328?16.243±0.625多孔鉭組16.943±0.944※17.575±1.043※16.345±1.452葛根素多孔鉭組18.170±0.629△19.043±1.328△16.382±0.328空白組14.170±0.53816.243±1.12815.896±0.628F17.68218.2582.674P0.0000.0000.064

注：△：P<0.05VS其它各組；*：P<0.05VS空白組；※：P<0.05VS空白組

圖2 免疫細胞化學染色觀察各組COL-I蛋白表達情況(×200)注：A：葛根素組；B：多孔鉭組；C：葛根素多孔鉭組；D：空白組Fig.2 The expression of COL-I protein of each group observed by immunocytochemical staining (×200)

圖3 免疫細胞化學染色觀察各組OC蛋白表達情況(×200)注：A：葛根素組；B：多孔鉭組；C：葛根素多孔鉭組；D：空白組Fig.3 The expression of OC protein of each group observed by immunocytochemical staining (×200)

圖4 免疫細胞化學染色觀察各組OPN蛋白表達情況(×200)注：A：葛根素組；B：多孔鉭組；C：葛根素多孔鉭組；D：空白組Fig.4 The expression of OPN protein of each group observed by immunocytochemical staining (×200)

3 討論

鉭素有“親生物”金屬之稱，具有良好的生物相容性、較高的孔隙率和與人松質骨相近的彈性模量與強耐酸性等優勢[5,6]。許多學者將其稱為骨小梁金屬[7]。多孔鉭骨植入物現已廣泛應用于關節置換、股骨頭壞死、骨缺損等骨科領域。本研究采用的國產多孔鉭支架材料呈三維連通多孔網狀結構，掃描電鏡觀察多孔鉭表面呈蜂窩狀孔隙，內部包含大量微孔結構，直徑約400～600 μm，內部空隙相互連通。此材料是由重慶潤澤醫療器械有限公司和國內多家高校科研機構共同研制的國產多孔鉭。國產多孔鉭材料表面粗糙，增加了成骨細胞與支架材料的接觸面積，增加細胞對纖維素的捕獲能力并且能夠促進成骨細胞黏附與聚集，加快骨整合及整合強度，利于細胞黏附生長，可促進骨長入，加快骨形成[8]。

葛根素一種異黃酮類化合物，具有減慢心率、擴張血管、降血壓的作用，臨床主要用于治療高血壓、心絞痛、腦供血不足和腦梗死[9,10]。因其對骨質疏松有預防作用，近幾年引起研究者的廣泛關注。有研究通過體外培養人成骨細胞，發現葛根素能促進成骨細胞的增殖、分化，提高堿性磷酸酶活性，對堿性磷酸酶活性也有較好的刺激作用，這可能提示葛根素具有提高成骨細胞骨形成的功能[11]。因此，本研究進一步探索葛根素和國產多孔鉭材料對成骨細胞影響的研究。掃描電鏡觀察表明葛根素對人成骨細胞在國產多孔鉭支架上伸展性良好，可連接成片狀，細胞基質分泌正常，細胞及細胞基質可覆蓋多孔鉭表面，具有良好的生物學相容性。CCK-8法檢測不同濃度葛根素和國產多孔鉭支架對人成骨細胞增殖的影響。實驗結果表明不同濃度的葛根素均促進成骨細胞的快速增殖，但以葛根素1 μmol/L組細胞增殖最快，差異有統計學意義(P<0.05)。國產多孔鉭亦可促進成骨細胞的快速增殖，但葛根素多孔鉭組相對其他各組成骨細胞的快速增殖更加顯著(P<0.05)，經多重比較分析，兩者之間具有協同促進成骨細胞增殖的作用。本課題組前期研究也顯示國產多孔鉭具有良好的三維立體空間構型及良好的生物相容性，可促進成骨細胞粘附和生長[12]。林鳳飛等[13]也研究發現多孔鉭金屬對成骨細胞生長無不良影響，且適應成骨細胞粘附、生長及分化，具有良好的生物相容性。臧洪敏等[13]研究發現不同劑量的葛根素均可促進成骨細胞的增殖和分化及礦化的作用，以中高劑量作用最明顯，與本研究結果相一致。

Ⅰ型膠原(Type I collgaen，COL-I)、骨鈣素(osteocalcin，OC)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是重要的成骨相關因子，是成骨細胞分化的標志物。COL-I由成骨細胞分泌的特異性膠原蛋白，是主要的骨結構蛋白，為鈣鹽沉積和細胞黏附提供支架，可作為評價成骨細胞功能狀態的指標；OC是由成骨細胞特異性分泌的一種非膠原蛋白，是成骨細胞向基質礦化的標志物，可反映成骨細胞活性；OPN也是成骨細胞的標志物之一，OPN促進骨基質的吸收、礦化，在參與骨形成與骨改建過程中發揮重要作用。

本研究采用RT-PCR法和免疫細胞化學染色法檢測成骨細胞成骨相關因子COL-I、OC、OPN mRNA和蛋白的表達，成骨細胞COL-I、OC、OPN蛋白均表達于胞漿，陽性反應呈棕黃色顆粒。結果發現葛根素組和多孔鉭組相較對照組均可促進成骨細胞COL-I、OC mRNA和蛋白的表達，差異具有統計學意義(P<0.05)，葛根素組和多孔鉭組之間COL-I、OC mRNA和蛋白表達無顯著差異(P>0.05)，葛根素多孔鉭組細胞COL-I、OC mRNA和蛋白的表達均顯著高于其它各組(P<0.05)，各組成骨細胞OPN mRNA和蛋白的表達無明顯差異(P>0.05)。經析因方差分析得出，葛根素和多孔鉭支架兩者具有協同促進成骨細胞COL-I、OC表達的作用，對OPN的表達無顯著影響。本課題組前期研究利用免疫細胞化學和Western blot法檢測國產多孔鉭復合MG-63細胞培養Col-I、OC和OPN蛋白表達，結果提示多孔鉭復合培養組出現Col-I、OC表達的增強，OPN的表達無明顯差異。國產多孔鉭材料可能通過影響Col-I、OC的表達，有利于MG-63細胞的黏附、生長，具備良好的生物相容性[15,16]。耿麗鑫等[12]采用RT-PCR檢測結果顯示國產多孔鉭促進成骨細胞成骨基因OPN、OC及FN mRNA的表達升高。袁斯遠等[17]等研究發現葛根素和雌二醇可增加BSP、OC mRNA的表達。葛根素和雌二醇能夠減少OPN mRNA的表達，表明葛根素能夠通過影響成骨細胞分化相關特征性蛋白mRNA表達，促進成骨細胞的分化。趙艷威等[18]研究發現葛根素在0.01-1μmol/L劑量內，以劑量依賴性方式顯著提高ALP活性和COL-I的分泌促進人成骨細胞分化成熟，

綜上所述，本研究初步探索葛根素和國產多孔鉭對人成骨細胞成骨相關因子COL-I、OC、OPN表達和細胞增殖的影響，為葛根素和國產多孔鉭支架材料治療骨缺損、骨折愈合提供了科學的理論依據，并且擴展了葛根素的藥用價值和臨床試用范圍，在固有臨床治療骨質疏松的基礎上，擴展了新的思路與方法。并且提高了我國中藥材葛根的使用范圍，推動了其藥用價值和經濟價值。同時在研究的過程中，也是對中藥材分子生物學實驗的一種積極嘗試和探索。也是對中西醫結合治療骨修復的一次積極的探索和嘗試。葛根素可作為骨移植支架材料修復骨缺損的輔助藥物，并具有促成骨的作用，為進一步臨床應用提供理論和實踐依據。