稻田養(yǎng)殖沙塘鱧對稻田水體及底泥微生物群落結構及多樣性的影響

趙翔剛，羅 衡，劉其根，趙良杰，蔡林榮，戴亮亮，張 真

(上海海洋大學，農業(yè)部水產種質資源與利用重點開放實驗室，上海 201306)

稻田養(yǎng)殖沙塘鱧對稻田水體及底泥微生物群落結構及多樣性的影響

趙翔剛，羅 衡，劉其根，趙良杰，蔡林榮，戴亮亮，張 真

(上海海洋大學，農業(yè)部水產種質資源與利用重點開放實驗室，上海 201306)

為了研究養(yǎng)殖沙塘鱧(Odontobutisobscurus)對稻田水體及底泥的微生物群落結構及多樣性的影響，2015年于浙江海鹽江南四阡現(xiàn)代農業(yè)公司進行了沙塘鱧的稻田養(yǎng)殖實驗，利用DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技術對養(yǎng)殖過程中的稻田水體及底泥中細菌的16S rDNA片段進行指紋圖譜分析。DGGE條帶測序分析結果顯示：稻田水體及底泥共檢測到包括α-變形菌亞門(Alphaproteobacteria)、β-變形菌亞門(Betaproteobacteria)、γ-變形菌亞門(Gammaproteobacteria)、δ-變形菌亞門(Deltaproteobacteria)、ε-變形菌亞門(Epsilonproteobacteria)、綠菌門(Chlorobi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)等細菌門類。多樣性分析結果顯示，養(yǎng)殖沙塘鱧的稻田底泥微生物DGGE條帶數(shù)多于常規(guī)養(yǎng)殖稻田，養(yǎng)殖稻田的底泥Shannon多樣性指數(shù)2.86，顯著高于常規(guī)稻田的2.27，同時養(yǎng)殖稻田養(yǎng)殖溝底泥的Shannon多樣性指數(shù)隨養(yǎng)殖時間由2.56變化到2.16。PCA(Principal Component Analysis)及DGGE聚類分析結果顯示，養(yǎng)殖稻田的水體及底泥微生物群落結構與常規(guī)稻田存在較大差異。結果表明，稻田養(yǎng)殖環(huán)境的微生態(tài)條件可能優(yōu)于常規(guī)稻田。

稻田養(yǎng)魚；DGGE;沙塘鱧(Odontobutisobscurus)

我國在稻田養(yǎng)魚有著悠久的歷史，人們利用稻田的水環(huán)境，并對其加以改造，在種植水稻的同時養(yǎng)殖水產品，一方面使稻田的水資源、雜草、水生動物、昆蟲等資源被充分利用，另一方面通過水產養(yǎng)殖動物的活動達到給稻田除草、增肥及滅蟲的效果，合理地改善了水稻的生長發(fā)育條件，促進了稻谷的生長，實現(xiàn)稻魚雙豐收的目標[1]。謝建等[2]的調查表明，稻田養(yǎng)魚模式相較于傳統(tǒng)稻田可以減少68%的農藥及24%的化肥使用量，稻魚互利共生，魚的活動可以減少水稻蟲害而稻田也相應的為養(yǎng)殖魚類提供適合的生長環(huán)境，并降低N、P對環(huán)境的污染。俞水炎等[3]研究表明，稻田放養(yǎng)草魚、鯉、尼羅羅非魚后,對早稻第3代白背飛虱的蟲口能減少34.48%～74.31%,晚稻第5代褐飛虱可減少51.23%～55.49%,早稻2代二化螟下降44.26～51.10%,早稻紋枯病減輕42.65%～59.91%。并可基本控制本田期萌生稗草、牛毛氈、矮慈菇等19種雜草。林傳政等[4]研究顯示，不同稻魚共生方式對中稻、再生稻主要農藝性狀及稻、魚產量有影響。平作稻養(yǎng)魚和平作稻凼式養(yǎng)魚共生方式水稻單產能保持平作稻產量水平，增收魚53.6～69.4 kg/667 m2，增加純收益745～780元/667m2；壟稻溝魚共生方式水稻單產比平作稻增產9.13%，增收魚66.9 kg/667m2，增加純收益1 040元/667m2。當前國內外大多數(shù)的研究主要集中于稻魚共生互利機制、稻田養(yǎng)殖病蟲害控制及經濟效益等機關研究，而國內對于稻魚共生系統(tǒng)中養(yǎng)殖生物對微生物的影響的研究鮮見。

眾所周知，細菌既是分解者，又可作為水生生物的間接或直接餌料，與此同時，水體中細菌對腐質碳的礦化作用在水體碳循環(huán)中也起著重要作用[5]。大量實驗證明，稻田土壤微生物群落在推動土壤有機質積累、轉換、礦化及N的釋放過程中扮演著十分重要的角色[6]。田相利等[7]研究發(fā)現(xiàn)草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鰱(Hypophythalmichthysmolitrix)和鯉魚(Cyprinuscarpio)的三元合理混養(yǎng)使得系統(tǒng)中微生物的結構和功能得到優(yōu)化，細菌群落的組成與代謝功能更趨于豐富化和多樣化。鑒于微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用，深入研究不同養(yǎng)殖模式下環(huán)境中微生物數(shù)量和功能，對于進一步理解微生物在人工生態(tài)系統(tǒng)中的作用及其機制具有十分重要的意義[8]。

沙塘鱧(Odontobutisobscurus)隸屬鱸形目(Perci-formes)虎魚亞目(Gobioidei)沙塘鱧科(Odontobuti-dae),為東亞特有的小型淡水底棲肉食性魚類,特別是在江浙地區(qū)為傳統(tǒng)的名貴食用魚，具有較高的漁業(yè)價值[9]。目前稻田養(yǎng)殖沙塘鱧的研究報道鮮見。本研究基于DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)分子技術對稻田養(yǎng)殖沙塘鱧對稻田水體及底泥微生物的影響進行探究，以期為研究稻田沙塘鱧種養(yǎng)模式優(yōu)化、了解共生機制提供理論依據(jù)，為后續(xù)研究稻田養(yǎng)殖沙塘鱧的研究者提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗設計

本實驗共設計了六個實驗田，其中四個為稻田養(yǎng)殖沙塘鱧組，其余兩個為常規(guī)稻田組，六個稻田面積均為6 670 m2，養(yǎng)殖沙塘鱧的稻田四周具有環(huán)溝，寬度為3.5 m，深0.8 m，稻田內部有三條縱溝，長40 m，寬3 m，深0.7 m，常規(guī)稻田無溝。四個養(yǎng)殖稻田均放養(yǎng)密度為0.5尾/m2，養(yǎng)殖規(guī)格為平均2 cm/尾的沙塘鱧。除此之外，養(yǎng)殖稻田每畝還增加放養(yǎng)了規(guī)格為3～4 cm/尾的抱卵青蝦1.5 kg。養(yǎng)殖過程中不使用化肥及農藥。

1.2 樣品采集及處理

分別于7月、9月、10月進行樣品的采集，水樣采用5 L的采水器于水面下方0.2 m處采集，分為七個采集點，均為每條養(yǎng)殖溝的中部位置，七個點混合在無菌桶內用500 mL的無菌瓶進行收集，泥樣采集在稻田中隨機采集7個點的稻田表層泥及于養(yǎng)殖溝中7個點采集水底表層泥，裝入無菌收集瓶內，樣品采集后，保存于-20 ℃冰箱。水體樣品采用0.22 μm濾膜進行抽濾，抽樣體積為200 mL。在實驗室中將四個實驗組的底泥樣品進行充分混勻，最終每次采樣得到三個待測樣品，G#(養(yǎng)魚稻田溝中樣品)D#(養(yǎng)魚稻田樣品)K#(常規(guī)稻田樣品)，按次序分別記錄為第一次(G1#、D1#、K1#)、第二次(G2#、D2#、K2#)、第三次(G3#、D3#、K3#)采樣。水樣以s表示，泥樣以n表示。

1.3 樣品DNA提取

泥樣中微生物DNA的提取利用上海博彩生物科技公司的土壤DNA抽提試劑盒進行提取，水樣中微生物DNA的提取，首先用滅菌的剪刀及鑷子將濾膜充分剪碎，置于1.5 mL滅菌的離心管中，接下來利用上海博彩生物科技公司的3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒V2.2進行樣品DNA的提取。

1.4 PCR反應及DGGE電泳

本實驗中，擴增的DNA片段為細菌的16S部分序列，引物為357F-GC-clamp和518R[10],擴增長度為220～230 bp，使用Peltier Thermal Cycle-200 PCR儀完成，模式為降落PCR(touchdown-PCR,td-PCR)[11]。反應體系為50 μL，包括引物357F-GC-clamp 1 μL，518R 1 μL，dNTP 1 μL，10×Buffer 5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 40.5 μL，DNA模板1 μL。反應程序設定：95 ℃預變性5 min，94℃變性1 min，65 ℃退火1 min(每個循環(huán)退火溫度降低0.5 ℃直至55 ℃)，72 ℃延伸30 s，以上進行20個循環(huán)，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，此過程進行15個循環(huán)，72 ℃最終延伸8 min，產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

利用美國Bio-Rad公司生產的D-code System電泳儀進行DGGE分離實驗，DGGE條帶的切割和擴增；DNA載體連接、轉化；細菌群落的挑選方法等參考唐永濤等[12]的實驗。

1.4 分析方法及運用的公式

數(shù)據(jù)處理利用BIO-RAD Quantity One 4.6.2軟件，PCA分析利用SPSS、EXCEL軟件，微生物的多樣性指數(shù)以條帶數(shù)目S、Shannon多樣性指數(shù)H、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)λ、Margalef豐富度指數(shù)R及Pielou均勻度指數(shù)J為參考進行計算，以下為各指數(shù)計算方法：

H=-∑[(ni/N)ln(ni/N)]

λ=∑[ni(ni-1)/N(N-1)]

R=(S-1)/lnLN

J=H/lnLS

注：S為每個電泳條帶中光亮的條帶數(shù)；ni為第i個條帶的光密度值；N為某一電泳條帶的總的光密度。

2 結果

2.1 微生物群落結構及多樣性統(tǒng)計分析

2.1.1 不同樣品的多樣性指數(shù)

泥樣G1n#、G2n#、G3n#的平均Shannon多樣性指數(shù)H為2.25，D1n#、D2n#、D3n#的平均Shannon多樣性指數(shù)H為2.86，K1n#、K2n#、K3n#的平均Shannon多樣性指數(shù)H為2.27。水樣G1s#、G2s#、G3s#的平均Shannon多樣性指數(shù)H為2.22，D1s#、D2s#、D3s#的平均Shannon多樣性指數(shù)H為2.34，K1s#、K2s#、K3s#的平均Shannon多樣性指數(shù)H為2.36。Shannon多樣性指數(shù)HG1s#>G2s#>G3s#，D2s#>D3s#>D1s#,K2s#>K3s#=K1s#(表1)。

表1 不同樣品的多樣性指數(shù)Tab.1 Diversity index of different samples

2.1.2 DGGE聚類分析

2.1.2.1 泥樣聚類分析

根據(jù)泥樣聚類分析圖(圖1)可以看出，G1n#、G2n#、G3n#聚在一起，D1n#、D2n#、D3n#聚在一起，K1n#、K2n#、K3n#聚在一起，可以看出三次采樣養(yǎng)殖稻田底泥、常規(guī)稻田底泥、養(yǎng)殖稻田溝底泥都各自具有較高的相似性，且表現(xiàn)出空間距離差異，不同地點采集的樣品聚類距離較遠。

圖1 泥樣聚類分析Fig.1 Cluster analysis of mud samples

2.1.2.2 水樣聚類分析

從圖2中可以明顯看出采樣初期G1s#、K1s#、D1s#具有較高的微生物群落結構相似性，三者聚在一起。第二次采樣G2s#、D2s#、K2s#三者距離相對較遠，表現(xiàn)出空間上的差異，說明隨著養(yǎng)殖的進行微生物群落結構開始出現(xiàn)分化。后期采樣聚類結果同樣表現(xiàn)出空間差異，G3s#與D3s#相聚較近，與K3s#距離較遠，到養(yǎng)殖后期養(yǎng)殖稻田水與養(yǎng)殖稻田溝中水的微生物群落結構相似性較大，而與常規(guī)稻田則相似性較低。另外，聚類還顯示，G1s#與G2s#、G3s#距離較近，而D1s#與D2s#、D3s#距離較遠，K1s#與K2s#、K3s#亦距離較遠，可以看出隨著養(yǎng)殖時間推移，養(yǎng)殖稻田溝微生物群落結構相似性較高，系統(tǒng)穩(wěn)定。而養(yǎng)殖稻田及常規(guī)稻田的微生物群落結構則發(fā)生變化，到后期趨于穩(wěn)定。

圖2 水樣聚類分析Fig.2 Cluster analysis of water samples

2.1.3 PCA分析

2.1.3.1 泥樣PCA分析

通過主成分分析法根據(jù)各條帶因子得分系數(shù)利用PC1、PC2這兩個占比超過50%的主成分因子構建PCA二維圖，從圖3中可以看出，三次采樣養(yǎng)殖稻田底泥、養(yǎng)殖稻田溝底泥、常規(guī)稻田底泥均各自聚集在一起，位置很接近。而每一次采樣的G#、D#、K#均位置較遠。

2.1.3.2 水樣PCA分析

水樣PCA圖(圖4)顯示，第一次采樣G#、D#、K#位置接近，從第二次采樣開始出現(xiàn)分化，G#、D#、K#位置相距較遠，第二次及最后一次采樣G#與D#位置相對接近，與K#位置相對疏遠。水樣及泥樣的PCA分析結果與DGGE聚類分析結果相似。

圖3 泥樣PCAFig.3 PCA of mud sample

圖4 水樣PCAFig.4 PCA of water samples

2.2 DGGE切膠圖譜及物種測定結果

分別對DGGE圖譜上較為清晰且具有一定明顯特征的條帶進行切割，水樣和泥樣分別切割8、10個條帶(圖5、圖6)。將條帶進行回收并重新克隆后進行測序，所得到的DNA片段通過U.S National Library of Medicine 的nucleotide blast項目進行匹配，找出相似性較高的物種，相似性在93%～100%之間結果顯示，總共匹配的物種門類分別是變形菌門(α-變形菌亞門、β-變形菌亞門、γ-變形菌亞門、δ-變形菌亞門、ε-變形菌亞門)、綠菌門、酸桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、藍藻門。養(yǎng)殖稻田溝底泥主要的細菌為β-變形菌亞門、ε-變形菌亞門、綠菌門、酸桿菌門。養(yǎng)殖稻田底泥主要的細菌門類為ε-變形菌亞門、綠菌門、酸桿菌門、β-變形菌亞門、δ-變形菌亞門。常規(guī)稻田主要細菌門類為ε-變形菌亞門、厚壁菌門、α-變形菌亞門、酸桿菌門、β-變形菌亞門、γ-變形菌亞門、δ-變形菌亞門。綠菌門沒有出現(xiàn)在常規(guī)稻田中，α-變形菌亞門、厚壁菌門、γ-變形菌亞門只出現(xiàn)在常規(guī)稻田(表2)。

水樣匹配的細菌門類為放線菌門、藍藻門、α-變形菌亞門。第一次樣品各個不同位置的細菌門類相似，含有放線菌門、藍藻門、α-變形菌亞門。第二次及第三次采樣均未在常規(guī)稻田中發(fā)現(xiàn)放線菌門、藍藻門聚球藻屬、α-變形菌亞門。藍藻門色球藻屬第二次及第三次采樣未在養(yǎng)殖稻田溝水體中出現(xiàn)(表2)。

圖5 泥樣切膠圖譜Fig.5 Rubber cutting map of mud samples

圖6 水樣切膠圖譜Fig.6 Rubber cutting map of water samples表2 16S rDNA-V3區(qū)片段序列比對結果Tab.2 Comparison of 16S rDNA-V3 sequences by sequencing and BLAST analysis

條帶編號基因登記號同源性最近種類相似度N1HM535225.1Thiobacillusthioparus97%N2KM979608.1Sulfuricurvumsp98%N3LC076472.1Sulfurirhabdus98%N4JQ669498.1Chlorobibacterium93%N5KM200457.1UnculturedAcidobacteriabacterium96%N6GU257819.1UnculturedZoogloeasp99%N7KT428289.1Pelagibacasp97%N8KT322923.1UnculturedAnaeromyxobactersp98%N9AB811051.1Legionellagresilensis93%N10KM585603.1Cetobacteriumsp99%S1GQ366691.1UnculturedKnoelliasp97%S2HQ707131.1UnculturedCyanobacteriumsp94%S3JN371211.1Unculturedactinobacterium97%S4KT893450.1Synechococcussp100%S5EF088332.1Merismopediasp100%S6KT893450.1Synechococcussp100%S7AB920864.1UnculturedHyphomicrobiumsp100%S8JN409246.1Unculturedcyanobacterium99%

3 討論

微生物群落是水體生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，在水體中氮、 磷、 硫和碳等要素的循環(huán)和利用中起到至關重要的作用[13]。土壤的功能及維持很大程度上取決于微生物的活動[14]。細菌多樣性對其所在的生態(tài)系統(tǒng)所發(fā)生的生化反應具有重要的影響，因此，對環(huán)境中細菌多樣性的研究可以用來監(jiān)控環(huán)境變化[15]。李成芳等[16]研究結果表明，與常規(guī)稻作相比,稻鴨共作能顯著提高土壤微生物數(shù)量,其中細菌數(shù)最多,放線菌次之,真菌最少。本實驗檢測出的沙塘鱧養(yǎng)殖稻田系統(tǒng)中底泥的變形菌最多，其余還有綠菌門、酸桿菌門等，常規(guī)稻田中檢測出的β-變形菌亞門、δ-變形菌亞門、酸桿菌門與陳俊輝等[17]研究得出的稻田土壤常見微生物種類相符合。電泳條帶的多少，可以直觀反映出樣品中細菌群落的遺傳多樣性，多樣性指數(shù)又是用以衡量群落物種數(shù)及個體的分布均勻度的一個綜合指標[18]。本實驗中，K1n#的物種條帶數(shù)比D1n#的少6條，K2n#的物種條帶數(shù)比D2n#的少8條，K3n# 的物種條帶數(shù)比D3n#的少10條，G1n#、G2n#、G3n#的平均Shannon多樣性指數(shù)為2.25， D1n#、D2n#、D3n#的平均Shannon多樣性指數(shù)為2.86，K1n#、K2n#、K3n#的平均Shannon多樣性指數(shù)為2.27，無論是物種的條帶數(shù)還是Shannon指數(shù)，養(yǎng)殖沙塘鱧的稻田均優(yōu)于常規(guī)稻田，說明稻田養(yǎng)殖沙塘鱧可以增加稻田底泥微生物種類數(shù)及微生物多樣性，使底泥環(huán)境更加穩(wěn)定，從而有利于養(yǎng)殖生物的生長及水稻的生長。從PCA及DGGE聚類圖的結果及分析可以得出，稻田養(yǎng)殖沙塘鱧可以對稻田的底泥微生物群落結構產生較大的影響。G1n#>G2n# 、G3n#，養(yǎng)殖稻田的溝底泥微生物多樣性由高到低變化。

唐永濤等[12]通過樣品的聚類分析得出，蝦單養(yǎng)(SH1#)和蝦與三角帆蚌混養(yǎng)(SH3#)水體菌群組成和群落結構相似性較高，而蝦和鰱鳙混養(yǎng)(SH2#)和蝦、三角帆蚌、鰱鳙混養(yǎng)(SH4#)相似性較高，SH1#、SH3#與 SH2#、SH4#距離較遠，相似性很低。本實驗的水樣DGGE聚類圖及PCA圖同樣清楚地反應了個樣品之間的聚類遠近，除了前期差異不明顯，可能是前期各組的進水來自同一個蓄水池，所以無法顯現(xiàn)微生物群落結構的差異，G2s#、D2s#、K2s#相聚較遠，G3s#、D3s#、K3s#也相聚較遠，表現(xiàn)出不同采樣點之間的空間差異，這也充分體現(xiàn)了沙塘鱧養(yǎng)殖稻田對于稻田水體及溝中微生物群落結構的影響，第二次及第三次樣放線菌門、藍藻門、α-變形菌亞門只出現(xiàn)在稻田養(yǎng)殖系統(tǒng)水體中，且藍藻門色球藻屬只出現(xiàn)在養(yǎng)殖稻田的溝中水體，這說明沙塘鱧養(yǎng)殖稻田的微生物種類要比常規(guī)稻田的稻田水體豐富，這也從一個側面體現(xiàn)了沙塘鱧稻田養(yǎng)殖模式的優(yōu)越性。物種條帶數(shù)及Shannon多樣性指數(shù)各采樣點間數(shù)據(jù)沒有明顯的差異(P>0.05)。G1s#與G2s#、G3s#從圖中可以看出相聚較近，D1s#與D2s#、D3s#距離較遠，K1s#與K2s#、K3s#亦距離較遠，前者體現(xiàn)了養(yǎng)殖稻田溝的水體微生物群落結構三次采樣時間相似度較高，說明養(yǎng)殖稻田的溝的水體環(huán)境相對養(yǎng)殖稻田的稻田水體環(huán)境及常規(guī)稻田的水體環(huán)境要穩(wěn)定。

研究發(fā)現(xiàn)，稻田底泥中變形菌門的種類最多，這與陳香碧等[19]進行的變形菌的相關研究得出的研究區(qū)土壤4中類型樣地中分布最廣、多樣性最高的細菌類群是變形菌的結果一致。酸桿菌門是苯酚的主要降解菌[20]，本實驗中它在不同的采樣點均有出現(xiàn)，這也體現(xiàn)了此類細菌在稻田的常見性。在張銳[21]的研究中發(fā)現(xiàn)，厭氧脫氮系統(tǒng)中存在變形菌門、 擬桿菌門和綠菌門這幾種主要的細菌，變形菌同樣是最主要的菌群，同時這也發(fā)現(xiàn)綠菌門也參與脫氮反應，在本實驗中綠菌門沒有出現(xiàn)在常規(guī)稻田，說明可能沙塘鱧養(yǎng)殖稻田的環(huán)境更適合它生活，從側面反映出沙塘鱧養(yǎng)殖稻田微生物群落結構的豐富，這也有可能與綠菌門的習性有關，綠菌門主要是一些厭氧光合細菌，這就可以解釋其只在沙塘鱧養(yǎng)殖稻田出現(xiàn)的原因了，可能是養(yǎng)殖稻田的水體深度較之常規(guī)稻田深，形成了微弱的厭氧環(huán)境，更適合其生存，但是由于此類細菌均為未被培養(yǎng)的細菌，很難鑒定其在生態(tài)中的理化特性及功能[22]。本實驗中厚壁菌門只在常規(guī)稻田出現(xiàn)，而韓崗等認為，厚壁菌門細菌是一類生活在腸道內的與脂肪有關的細菌，可見此類細菌可能會造成水體的污染，沙塘鱧養(yǎng)殖稻田中檢測出厚壁菌門說明此養(yǎng)殖模式從一定程度上有利于環(huán)境的凈化，提高生態(tài)系統(tǒng)的安全性。后期的水體樣品顯示，常規(guī)稻田所含有的優(yōu)勢細菌門類遠少于沙塘鱧養(yǎng)殖稻田，而養(yǎng)殖稻田溝的種類亦小于養(yǎng)殖稻田，可以得出，沙塘鱧養(yǎng)殖稻田的稻田水體的優(yōu)勢菌群數(shù)最豐富。

稻田引入沙塘鱧，可以提高稻田底泥的微生物多樣性及改善其群落結構，豐富底泥微生物的種類數(shù)。對稻田的水體微生物群落結構具有一定的影響，提高其微生物種類數(shù)目。研究發(fā)現(xiàn)，沙塘鱧養(yǎng)殖稻田養(yǎng)殖溝渠中水體的微生物群落結構更加穩(wěn)定，底泥多樣性出現(xiàn)由高向低變化。α-變形菌亞門、γ-變形菌亞門只出現(xiàn)在常規(guī)稻田，沙塘鱧稻田養(yǎng)殖對于微生物具體的影響方式等還有待進一步的研究探討。

[1]沈雪達,茍偉明.我國稻田養(yǎng)殖發(fā)展與前景探討[J].中國漁業(yè)經濟,2013,31(2):151-156.

[2]Xie J,Hu L,Tang J,et al.Ecological mechanisms underlying the sustainability of the agricultural heritage rice-fish coculture system[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2011,108(50): E1381-E1387.

[3]俞水炎,吳文上,吳慶齋,等.稻田養(yǎng)魚對水稻病蟲草害控制效應的研究[J].中國生物防治,1989,(3):113-116.

[4]林傳政,呂澤林,周遠清,等.不同稻魚共生方式對水稻性狀及稻魚產量的影響[J].耕作與栽培,2015(6):19-21.

[5]劉國才,劉振奇.池塘底泥中細菌的初步研究[J].水生生物學報,1992,(3):284-286.

[6]Ding L J,Su J Q,Xu H J,et al.Long-term nitrogen fertilization of paddy soil shifts iron-reducing microbial community revealed by RNA-(13)C-acetate probing coupled with pyrosequencing.[J].Isme J,2014,9(3):721-734.

[7]田相利,鄭瑤瑤,柳炳俊,等.草魚混養(yǎng)系統(tǒng)細菌數(shù)量變動和群落功能多樣性研究[J].中國海洋大學學報:自然科學版,2012,42(11):19-27.

[8]Hagstrm,Azam F,Andersson A,et al.Microbial loop in an oligotrophic pelagic marine ecosystem: possible roles of cyanobacteria and nanoflagellates in the organic fluxes[J].Mar Ecol Prog,1988,49(1-2):171-178.

[9]任 崗,章 群.中國沙塘鱧屬魚類線粒體12S rRNA基因序列分析[J].水生生物學報,2007,31(4):473-478.

[10]張 敏,蔡俊鵬.不同DNA聚合酶對PCR-DGGE技術的影響[J].安徽農業(yè)科學,2011,39(14):8231-8233.

[11]Don R H,Cox P T,Wainwright B J,et al.'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.[J].Nucl Acid Res,1991,19(14):4008-4008.

[12]唐永濤,趙良杰,楊 洋,等.基于16S rDNA比較研究混養(yǎng)三角帆蚌和鰱鳙對池塘養(yǎng)殖水體微生物群落結構的影響[J].淡水漁業(yè),2015,(3):70-77.

[13]李革雷,陳昌福,高 宇,等.3種養(yǎng)殖模式水體中細菌多樣性研究[J].華中農業(yè)大學學報,2012,31(3):381-390.

[14]Anderson T H.Microbial eco-physiological indicators to asses soil quality[J].Agricult Ecosyst Environ,2003,98(1-3):285-293.

[15]Gilbride K A,Frigon D,Cesnik A,et al.Effect of chemical and physical parameters on a pulp mill biotreatment bacterial community[J].J Dairy Sci,2006,40(4):775-787.

[16]李成芳,曹湊貴,展 茗,等.稻鴨共作對稻田氮素變化及土壤微生物的影響[J].生態(tài)學報,2008,28(5):2115-2122.

[17]Chen J,Liu X,Li L,et al.Consistent increase in abundance and diversity but variable change in community composition of bacteria in topsoil of rice paddy under short term biochar treatment across three sites from South China[J].Appl Soil Ecol,2015,91:68-79.

[18]張鐿鋰,張雪梅.植物區(qū)系地理研究中的重要參數(shù)——相似性系數(shù)[J].地理研究,1998,17(4):59-63.

[19]陳香碧,蘇以榮,何尋陽,等.不同干擾方式對喀斯特生態(tài)系統(tǒng)土壤細菌優(yōu)勢類群-變形菌群落的影響[J].土壤學報,2012,49(2):354-363.

[20]吳松維.填埋垃圾生物反應器反硝化性能及反硝化微生物研究[D].杭州：浙江大學,2010.

[21]張 銳.厭氧脫氮系統(tǒng)中微生物群落結構研究[J].生物技術,2014,13(6): 530-533

[22]劉慧杰,楊彩云,田 蘊,等.基于PCR-DGGE技術的紅樹林區(qū)微生物群落結構[J].微生物學報,2010,50(7):923-930.

(責任編輯：張紅林)

Influence of the cultured Odontobutis obscurus to the microbial community structure and diversity in rice-fish system

ZHAO Xiang-gang,LUO Heng,LIU Qi-gen,ZHAO Liang-jie,CAI Lin-rong,DAI Liang-liang,ZHANG Zhen

(KeyLaboratoryofAquaticGeneticResourceandUtilization,MinistryofAgriculture/ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306,China)

In order to study influence of the culturedOdontobutisobscurusto the microbial community structure and diversity in rice-fish system.We investigated the microbial diversity of the water and sediment in rice-fish system using DGGE technology in Haiyan,Zhejiang.In this study,we detected species of Alphaproteo bacteria,Betaproteo bacteria,Gammaproteo bacteria,Deltaproteo bacteria,Epsilonproteo bacteria,Chlorobi,Acido bacteria,Firmicutes,Actino bacteria,Cyano bacteria.Diversity analysis showed that the number of sediment microbial species in rice-fish system were higher than that in the conventional rice fields.The Shannon-Weiner index in sediment of the rice-fish system was 2.86,significantly higher than 2.27 of the conventional rice field The Shannon-Weiner index in sediment was declined from 2.56 to 2.16 along the cultured process in rice-fish system.PCA and DGGE results showed the obvious differences of the microbial community structure in water and sediment between the rice-fish system and the conventional paddy fields,which indicated the cultured speciesO.obscurusmay play an important role in the regulation of the microbial community structure.

rice-fish system;DGGE;Odontobutisobscurus

2016-03-29；

2017-04-24

公益性行業(yè)(農業(yè))專項：淡水池塘工程化改造與環(huán)境修復技術研究與示范(201203083)；上海市高校知識服務平臺項目(ZF1206)

趙翔剛(1989- )，男，碩士研究生，專業(yè)方向為池塘生態(tài)養(yǎng)殖。E-mail:zxg198908@gmail.com

劉其根。E-mail: qgliu@shou.edu.cn

S931.3

A

1000-6907-(2017)04-0008-07