溫度和營養鹽限制對網狀原角藻生長與產毒的影響

高春蕾,孫 萍,賈智慧,姜美潔,2,3,趙翠瓊,張學雷,2,3，吳振興，梁成珠

1 國家海洋局第一海洋研究所, 青島 266061 2 青島海洋科學與技術國家實驗室 海洋生態與環境科學功能實驗室, 青島 266061 3 國家海洋局海洋環境與科學重點實驗室, 青島 266061 4 中國海洋大學, 青島 266003 5 國家海洋局東海預報中心, 上海 200081 6 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，青島 266002

?

溫度和營養鹽限制對網狀原角藻生長與產毒的影響

高春蕾1,2,3,*,孫 萍1,2,3,4,賈智慧1,姜美潔1,2,3,趙翠瓊5,張學雷1,2,3，吳振興6，梁成珠6

1 國家海洋局第一海洋研究所, 青島 266061 2 青島海洋科學與技術國家實驗室 海洋生態與環境科學功能實驗室, 青島 266061 3 國家海洋局海洋環境與科學重點實驗室, 青島 266061 4 中國海洋大學, 青島 266003 5 國家海洋局東海預報中心, 上海 200081 6 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，青島 266002

網狀原角藻(Protoceratiumreticulatum)是能夠形成有毒赤潮的海洋甲藻之一,所產毒素為蝦夷扇貝毒素(yessotoxins, YTXs),該藻在全球很多海域中普遍存在,其生長與產毒特征表現出較強的海域差異性。以分離自我國北黃海海域的網狀原角藻為實驗對象,研究了溫度和營養鹽(N、P)限制對該藻生長與產毒的影響。研究發現：溫度和營養鹽限制對藻細胞的生長和產毒均有影響,但營養鹽限制影響更為顯著。較低的溫度更適宜P.reticulatum的生長,15℃時無營養鹽限制的L1-Si培養基中藻細胞生長最好。營養鹽限制尤其是P限制能夠顯著降低藻細胞的比生長速率和細胞密度(P<0.01),縮短藻細胞指數生長期和穩定期的持續時間。所有溫度下N、P限制均有利于藻細胞內毒素累積,15℃P限制培養基中單個藻細胞中YTX毒素最高,達到92.6 pg/細胞,分別是相同培養溫度下N限制和L1-Si中藻細胞毒素含量的3.8倍和7.1倍。溫度變化對N和P限制下藻細胞毒素含量影響不同：在5—15℃范圍內,隨溫度升高,N限制培養基中藻細胞YTX含量增幅逐漸下降,而P限制條件下反之。在所有培養條件下,濾液中毒素含量在穩定期后開始增多,與L1-Si相比,N、P限制不利于毒素的釋放。高溫能促進L1-Si培養基和N限制培養基中毒素的釋放,但對P限制影響不顯著。

網狀原角藻；營養鹽限制；溫度；蝦夷扇貝毒素；北黃海

近年來,有毒有害赤潮在全球很多海域中頻繁發生,對當地的水產養殖、旅游、人類健康和生命安全等造成了極大的危害。有毒赤潮的危害不僅取決于赤潮藻的生物量,還受到藻細胞毒素含量的影響。對于能夠形成有毒赤潮的甲藻,其生長和產毒會受到許多因素的影響,其中營養物質、溫度、鹽度、光照等都是非常重要的影響因子。但環境因素對藻細胞生長與產毒的影響因藻種而異,相同環境條件下,不同的藻結果可能完全不同。

網狀原角藻(Protoceratiumreticulatum)是廣泛分布于全球近岸海水中并能夠形成赤潮的有毒甲藻之一,是第一個被確認產生蝦夷扇貝毒素(yessotoxins, YTXs)的單細胞藻類[1],已在新西蘭[2- 4]、日本[5- 6]、挪威[7- 8]、意大利[9]、英國和加拿大[10]、西班牙和美國[11- 12]、德國[13]等國的近岸海水中分離到。該藻所產的蝦夷扇貝毒素是一類毒性較強的細胞毒素[14- 15],心臟、肝臟、神經系統、免疫系統、細胞溶酶體、胸腺等都有可能是YTXs作用的靶器官[16]。貝類通過濾食藻細胞將YTXs在體內累積轉化并沿食物鏈傳遞,對貝類消費者及人類健康及生命安全造成了潛在的威脅。

目前對該藻的研究大多集中于其所產毒素的種類、結構及毒素的檢測方法等,對于環境因子對網狀原角藻生長和產毒的影響的研究并不是太多。2001年,Seamer[17]最早開展了溫度、光照、鹽度、營養鹽單因素變化對新西蘭海域的網狀原角藻生長及產毒的影響研究；2004年,Mitrovic[18]等報道了微量元素Fe、Se和Co對相同海域中網狀原角藻生長和產毒的影響；之后,Paz等[19]和Rodríguez等[20]分別報道了溫度、光照和鹽度及成倍提高L1-Si中大量營養鹽(N、P)的濃度對西班牙海域的網狀原角藻生長與產毒的影響；Guerrini[21]等以分離自意大利亞得里亞海的網狀原角藻為研究對象,研究了鹽度、溫度及營養鹽對該藻產毒的影響； R?der等[13]報道了鹽度、溫度及營養鹽對北海德國灣的網狀原角藻生長與產毒的影響。通過分析已有的研究發現,環境因子會強烈影響藻細胞密度和藻毒素的種類與組成,但是由于采用了不同地理株系開展研究,很多情況下即使環境因子相同得到的結果卻不同甚至相互矛盾。可見,藻株生長、YTXs合成及毒素組分的變異性與藻株的地理分布密切相關[5,8-9]。

我國也是有毒赤潮高發的國家之一,貝類中赤潮毒素沾染情況亦較嚴重,而YTXs毒素是近年來貝類中累積含量較高的毒素之一,如陳建華等從2011年采自北黃海海域的蝦夷扇貝樣品中檢測到的YTX毒素含量竟高達6.68×103μg/kg[22],大大超出了歐盟規定的安全食用標準(3750 μg/kg),嚴重威脅消費者的食用安全。2014年國家海洋環境監測中心梁玉波研究團隊成功從北黃海海域分離純化到1株網狀原角藻,這也是目前國內首次分離到產YTXs的網狀原角藻,為進一步研究該藻生長、產毒、赤潮發生發展及防控、毒素危害及致毒機理等提供了最基本的研究材料。

由于是首次在我國海域中分離到網狀原角藻,關于該株藻生長和產毒的相關信息尚為空白,加之近海貝類中YTXs污染情況嚴重,進行相應的研究就顯得非常迫切和必要。本研究以北黃海域的網狀原角藻為研究對象,選擇對藻細胞生長和產毒影響比較顯著的兩個環境因子——溫度和營養鹽,研究不同溫度和N、P營養鹽限制條件下該藻的生長與產毒情況的變化,為更深入地了解該藻存在、大量繁殖與現場環境因子之間的聯系,補充該藻的生理生態學相關信息,預防該藻赤潮爆發及海洋食品安全提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 藻種培養

實驗用網狀原角藻采自北黃海海域,經分離純化而得。

藻種培養所用海水取自青島石老人海水浴場,鹽度為31, pH為7.9±0.1,砂濾后經0.45 μm微孔濾膜過濾,轉移至三角瓶中高溫高壓(120℃, 0.12 MPA)滅菌冷卻至室溫,按比例加入除菌的無Si L1培養基(L1-Si)(Guillard和Hargraves, 1993)[23],于15℃,光照強度為90 μmol m-2s-1的恒溫恒濕的氣候室中培養,光暗比為12h:12h。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

實驗中共設4個溫度梯度,分別為5、10、15、20℃；在每個溫度下再設3種培養基,分別為L1-Si培養基、N限制 L1-Si培養基(N濃度為L1-Si中的1/10,以下簡稱為1/10N)、P限制 L1-Si培養基(P濃度為L1-Si中的1/10,以下簡稱為1/10P),共12種組合,每種組合設3個平行樣,試驗周期為48 d。

在實驗正式開始前,將網狀原角藻在相應的溫度條件下馴化一個培養周期。

實驗采用一次性培養的方法。將近岸海水經過孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾并高溫滅菌后,按照不同的N、P濃度添加L1培養基各種營養鹽儲備液(經0.2 μm一次性無菌針頭濾器(?25 mm, Pall, USA)過濾除菌),配制成實驗需要的3種培養基,并將配制好的培養基置于實驗需要的不同培養溫度下進行同步化。取經馴化后的平臺期藻細胞進行接種,初始接種密度均為500 個細胞/mL,培養體積均為1000 mL,置于GZX- 250BS-Ⅱ型光照培養箱(上海新苗醫療器械廠)內培養,光強為90 μmol m-2s-1,光暗周期為12h:12h。接種當天取樣,之后每3 d取1次樣,時間為18：00點,試驗中所測參數之所需樣品的采集均同步進行。

1.2.2 樣品采集、處理及分析

(1)藻細胞計數、形態觀察及比生長速率計算

自接種日起每3d取1次樣,取樣前輕輕晃動培養瓶,使藻液充分混勻。取2 mL藻液,加入1% Lugol′s碘液固定,混勻后,用浮游植物計數板在TE2000倒置顯微鏡(Nikon, Japan)下計數,同時觀察細胞形態的變化。

藻的比生長速率按以下公式計算：比生長速率(μ)=(lnN1-lnN0)/ (t1-t0), 式中μ為比生長速率(d-1),N0和N1分別為t0和t1時間的細胞密度。

(2) 毒素提取與分析

藻毒素提取 取20 mL藻液,低真空度抽濾至GF/F膜(?25 mm, WhatmanTM, UK),同時收集濾液用于胞外毒素分析。將帶有藻細胞的濾膜剪碎后,用4mL 80%的甲醇冰浴中超聲破碎,反復鏡檢,直至細胞全部破碎。4℃,6500 r/min離心10 min,收集上清；重復提取1次,合并兩次的上清液,80%甲醇定容至10 mL。用0.22 μm的尼龍膜(?13 mm,艾杰爾,北京)過濾,濾液置于-20℃保存至分析。

胞外毒素提取 根據Paz 等[12]的方法并稍作調整收集濾液中的毒素。具體洗脫步驟為：依次用10 mL 70%甲醇和10 mL 20%的甲醇平衡固相萃取(SPE)小柱后,將20 mL濾液上樣到SPE小柱；用10 mL 20%的甲醇洗脫SPE小柱,棄掉洗脫液；之后,用10 mL 70%的甲醇洗脫SPE小柱,收集洗脫液,用0.22 μm的尼龍膜過濾,濾液置于-20℃保存至分析。

毒素的分析檢測 采用高效液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)法進行藻毒素和胞外毒素的檢測。液相色譜-質譜系統為Agilent1200液相系統(包括G1311A四元泵、G1313A自動進樣器,G1316A柱溫箱)；API4000三重四極桿質譜檢測器(Applied Biosystems GmbH, Germany),離子源為ESI電噴霧離子源；液相色譜柱為Phenomenex RP C18柱(150×3.0mm, 5μm)。

液相色譜條件 流動相A為水(含0.1%甲酸,5 mmol/L甲酸銨),流動相B為95%乙腈水溶液(含0.1%甲酸,5 mmol/L甲酸銨)；流速為0.3 mL/min,進樣體積10 μL,柱溫30℃,梯度洗脫程序如表 1所示。質譜檢測條件 采用ESI+/-切換多參數掃描方式(MRM),各項參數見表 2和表3 。

表1 液相梯度洗脫程序

A: 水(含0.1%甲酸,5 mmol/L甲酸銨);B: 95%乙腈水溶液(含0.1%甲酸,5 mmol/L甲酸銨)

表2 多反應監測參數(正離子模式)

Q1 Mass: 四級桿質譜1 Quadrupole mass 1; Q3 Mass: 四級桿質譜3 Quadrupole mass 3; DP: 去簇電壓Declustering potential；EP:射入電壓Entrance potential; CE: 碰撞電壓Collision energy；CXP：碰撞室出口電壓Cell exit potential

表3 多反應監測參數(負離子模式)

1.2.3 數據處理與分析

采用SPSS 13統計軟件分別進行方差的單變量分析和多重比較分析,分析不同溫度和N、P限制對網狀原角藻生長及產毒是否具有顯著影響。設定α=0.05,數據以M±S.D.表示(n=3)。當P<0.05時具有顯著性差異,P<0.01時具有極顯著差異。另外,利用Origin 9.0作圖軟件進行作圖分析。

2 實驗結果

2.1 溫度和N、P限制對網狀原角藻生長的影響

根據圖1和圖2,溫度和營養鹽限制均對藻細胞的生長有影響,但影響的程度與細胞生長階段不同。

圖1 不同溫度和營養鹽條件下網狀原角藻的生長情況Fig.1 Growth curves of P. reticulatum cultured at different temperature and nutrient levels

圖2 不同溫度和營養鹽條件下網狀原角藻比生長速率的變化Fig.2 Changes of specific growth rate of P. reticulatum in the exponential phase at different temperature and nutrient levels

在所有溫度條件下,網狀原角藻均在L1-Si培養基中生長最好,最大細胞密度和比生長速率也出現在該培養基中, P限制則顯著抑制藻的生長。以15℃為例,P限制培養基中最大細胞密度和比生長速率分別為0.47×107個細胞/L和0.132 d-1,僅為L1-Si的一半,差異極顯著(P<0.01)；另外,P限制明顯縮短了藻細胞的指數生長期和穩定期,與L1-Si培養基相比至少提前6d結束指數生長期；N限制明顯縮短了穩定期的持續時間,對指數生長期藻細胞的生長影響不大。

溫度的影響主要體現在L1-Si和N限制培養基中藻細胞指數生長期階段,在此階段藻細胞的生長基本與溫度變化呈正相關,高溫區(15℃和20℃)和低溫區(5℃和10℃)之間細胞密度差異顯著(P<0.05)。但在P限制培養基中,5—15℃范圍內藻細胞的生長與溫度變化呈負相關。指數生長期后,溫度的影響在營養鹽限制的培養基中變得不明顯,藻細胞密度均開始下降并快速進入衰敗期；20℃L1-Si培養基中藻細胞也表現出相似的生長情況,但其余溫度下藻細胞在經過較長的穩定期后密度又出現“返增”現象。

2.2 溫度和N、P限制對網狀原角藻產毒的影響

2.2.1 溫度和N、P限制對網狀原角藻胞內YTX含量的影響

HPLC-MS/MS檢測發現,網狀原角藻主要產YTX及少量YTX衍生物,其中YTX占到96%,所以本實驗中主要以YTX含量的變化來考察溫度和N、P限制對其產毒的影響。

研究發現,在所有培養條件下,網狀原角藻胞內YTX含量隨著藻細胞的生長階段有著相同的變化的趨勢：指數生長期藻細胞內YTX含量較穩定,從指數生長期后期開始,胞內YTX濃度開始急劇增加,穩定期末期時達到最高,之后開始下降。

與無營養鹽限制相比,N、P限制能顯著提高網狀原角藻胞內YTX的含量。1/10N培養基中,從指數生長期后期或穩定期前期,各溫度下胞內YTX含量開始明顯升高,但增幅與溫度變化呈負相關：5℃時YTX含量最高,約為30 pg/細胞,15℃和20℃時毒素含量降低到20 pg/細胞左右；1/10P培養基中,從指數生長期的中期開始,胞內YTX含量就開始升高,略早于L1-Si和1/10N培養基。在5—15℃范圍內,胞內YTX毒素含量隨溫度升高而升高,20℃時,毒素含量開始下降,其中15℃時穩定期末期單個藻細胞中YTX毒素含量最高,達到92.6 pg/細胞,顯著高于其余3個溫度(P<0.01)(圖3)。

圖3 不同溫度和營養鹽條件下網狀原角藻胞內YTX濃度變化情況Fig.3 Changes of intracellular YTX concentration of P. reticulatum at different temperature and nutrient levels

2.2.2 溫度和N、P限制對網狀原角藻胞外YTX含量的影響

圖4 不同溫度和營養鹽條件下指數生長期和穩定期濾液中YTX毒素的細胞配比Fig.4 Percentage of YTX in the media filtrates of P. reticulatum in the exponential and the stationary phase respectively at different temperature and nutrient levels

濾液中的YTX毒素主要來源于藻細胞正常代謝分泌和死亡細胞的釋放而來。指數生長期和穩定期細胞死亡較少,濾液中的毒素主要來源于藻細胞的代謝分泌,而穩定期以后細胞逐漸衰敗死亡,胞內大量毒素釋放。為了客觀地評價溫度和營養鹽限制對網狀原角藻胞外YTX毒素含量的影響,本研究只比較指數生長期和穩定期濾液中毒素含量的變化。為了便于胞內和胞外毒素進行比較,根據測定的濾液中毒素的濃度及相應的細胞密度,將濾液中YTX毒素折算成單細胞濃度,從而比較胞內和胞外毒素的細胞配額的變化。

從圖4可以看出,在所有培養條件下及各個不同的生長階段,濾液中YTX毒素的濃度均很低。不論是指數生長期還是穩定期,L1-Si培養基濾液中YTX毒素含量顯著高于N和P限制下濾液中YTX毒素含量(P<0.01),且隨溫度升高明顯升高； N 和P限制均不利于YTX的釋放,高溫能加劇N限制下YTX毒素的釋放,但對P限制無顯著影響。

3 討論

3.1 溫度和N、P限制對網狀原角藻生長的影響

溫度是影響赤潮生物生長、繁殖、代謝等的重要環境因子,也是赤潮爆發的關鍵影響因子之一。每種赤潮生物都有自己生存的最適生長溫度和溫度范圍。本研究中采用的網狀原角藻是2014年5月首次分離自我國的北黃海海域,當時該藻以較高密度存在于5 m以淺的表層海水中,海水表層溫度在15℃左右。而本研究的實驗結果表明,在20℃的L1-Si培養基中,藻細胞比生長速率和指數生長期結束時藻細胞密度最高,分別為0.256 d-1和1.1×107/L-1,比15℃時略高(分別為0.252 d-1和1.04×107/L-1)；但在20℃時,藻細胞在指數期結束后很快就進入衰退期,藻細胞密度降為原來的70%；而15℃條件下,藻細胞在經過較長的穩定期后細胞密度又開始增加。另外,在預實驗中我們也發現,20℃培養時,藻細胞的生長周期比低溫度條件下短,25℃培養條件下藻細胞密度很低,且藻細胞嚴重變形；而30℃時在接種后的較短時間內藻細胞即死亡(預實驗的結果,未顯示),可見,該株藻適宜在較低溫度下生長。Guerrini等[18]和R?der等[13]分別以分離自意大利和德國近岸海域的網狀原角藻進行研究也發現20℃和15℃分別是上述兩株藻的最適生長溫度。Koike等[24]在對日本北部Okkirai Bay水體中網狀原角藻種群的季節變化進行了1周年的調查后發現,溫度在8.23—19.99℃范圍內,水體中能夠檢測到網狀原角藻細胞,形成赤潮并且細胞密度達到峰值時水溫在14.3—16.53℃之間。在我國北黃海海域分離到的網狀原角藻與上述研究中的藻株的適宜生長溫度非常接近,推測其在北黃海海域大量增殖并引發赤潮最有可能是在春末夏初季節,這與現場調查結果也一致。Okolodkov等[25]在通過分析1976—1999年期間歐亞北極地區的28次調查(539個站位,1810個樣品)的數據和500多篇相關文獻后得出:網狀原角藻分布范圍大致在25—0℃等溫線之間,主要分布在15℃等溫線附近海域。上述研究結果也解釋了為什么在熱帶海域較少發生該藻赤潮[24, 26- 27]。

水體中氮、磷的種類、組成和含量不僅對赤潮生物的生長、生理生化過程有著重要的影響,而且對赤潮形成的規模和程度也起著決定性的作用。

本研究結果表明,網狀原角藻的生長更多地受P限制的影響而不是N限制,藻細胞大量增殖時對P的需求較大,當環境中P的濃度比較低時,P可能成為網狀原角藻生長的限制因子。這與Guerrini等[18]和R?der等[13]對網狀原甲藻的研究結果相同,也與其他許多產腹瀉性貝毒[28-29]和麻痹性貝毒[30-1]的甲藻中的研究結果相同。另外,Rodríguez等[21]開展的網狀原角藻對大量營養鹽需求的研究結果也間接證實了上述結論。他們發現,L1培養基中P的濃度遠遠不能滿足網狀原角藻生長的需要,當P的濃度增加到217 μmol/L(6×L1)時藻細胞的生長速率和生物量達到最大,超過此濃度藻細胞的生長才會受到抑制；而N在882 μmol/L(1×L1)—8824 μmol/L(10×L1)濃度范圍內對藻細胞的生長均無明顯影響,本研究中將N濃度降低至88.2 μmol/L(1/10×L1)時,對藻細胞的生長影響也不顯著,推測該藻對N濃度的改變不敏感。但是根據實驗室的研究結果外推現場中藻的生長狀況是很難的,即便是現場調查的結果,也很難得出確切的結論,如Koike等[24]在現場調查中發現環境中的N和P濃度與網狀原角藻的爆發性增殖之間的沒有相關性,網狀原角藻赤潮發生前后水體中N和P的濃度始終處于較低的濃度水平。

研究中還發現,穩定期后期,L1-Si培養基中藻細胞密度卻出現明顯的返增現象,這可能是取樣后期培養瓶中培養液體積減少,空氣增多,細胞周圍氣體不斷更新和交換,加之L1-Si培養基中N、P營養鹽本身就過量,培養后期仍有剩余,幾種因素共同促進了細胞的生長和繁殖。由于本研究并未對培養過程中營養鹽的變化進行檢測,所以L1-Si培養基中藻細胞密度在衰敗期返增現象的具體原因還需要進一步的研究。

3.2 溫度和N、P限制對網狀原角藻產毒的影響

溫度對有毒甲藻產毒能力的影響存在明顯的種間差異,即使是同一種甲藻,不同地理株系間產毒情況也不完全相同。本研究中,在無營養鹽限制的L1-Si培養基中,溫度對網狀原角藻的產毒能力影響不大。這與Manuel[32]研究分離自格陵蘭島附近海域的網狀原角藻產YTX的能力隨溫度變化情況相一致；而R?der等[13]的研究表明分離自德國北海灣的網狀原角藻在低溫下產YTX的能力更強；另外,Guerrini等[18]研究卻發現,在較高溫度(26℃)下,分離自意大利海域的網狀原角藻能夠產生更多的YTX。但是,溫度對藻細胞產毒的影響在有營養鹽限制或不足時變得比較顯著,這可能是營養鹽限制使毒素合成過程中某些酶的活性對溫度更加敏感,從而直接或間接影響毒素的合成。

有研究表明,在營養平衡的條件下,藻類產毒量往往較低；而當營養失衡,尤其是在低磷濃度的條件下,能夠刺激藻類產毒增加,高濃度溶解無機磷,往往不利于毒素的蓄積[33],本研究結果也支持上述觀點。在15℃ P限制培養基中穩定期的藻細胞中YTX含量最高,達到92.6 pg/細胞,是同一溫度相同生長階段L1-Si培養基中的7倍有余。由于P限制情況下,細胞密度顯著降低而細胞體積變大,如果以單位體積培養液來衡量毒素含量的變化,那么磷限制對毒素合成的影響就明顯削弱了,類似的結果在以往對亞歷山大藻的研究中已被多次報道[34-37]。盡管如此,P限制下單位體積培養液中YTX的含量仍是營養鹽平衡條件下的1.5—2倍。

甲藻對營養物質吸收的能力比其它藻類差,在營養限制條件下,甲藻的競爭能力會比其他硅藻和無毒甲藻差[38],而毒素的產生可能是其對低營養利用率的一種補償性競爭策略[39],可以作為對攝食浮游藻類生物的威懾,防止被攝食；當營養不平衡時,毒素作為營養儲存化合物,也可以減輕某些過剩營養物質對藻造成的不利影響[34, 40]。YTX為多環聚醚類化合物,其分子中不含N、P原子,營養鹽對其合成的影響可能是通過直接或間接影響與YTX合成相關酶及相關中間產物來實現的。通過穩定性同位素投喂實驗發現,YTX分子中碳骨架結構起源于聚酮類化合物(polyketides)[41],而聚酮類化合物碳鏈的組裝在一定程度上與脂肪酸的合成相關[42]。根據以上推測,當N、P限制時,YTX毒素的合成可能與網狀原角藻細胞的脂肪酸代謝有關,但這需要實驗來驗證。

關于濾液中YTX的含量,Guerrini等[18]與Paz等[11]均認為濾液中檢測到的YTX是由細胞死亡后釋放到培養基中導致的。本研究的結果也基本與上述觀點一致,高溫及穩定期中后期后死亡細胞增多,濾液中的YTX濃度升高。但本研究中,無論在什么培養條件下,整個培養過程中,只有很少一部分YTX釋放到濾液中,這與R?der等[13]對分離自德國北海的網狀原角藻在N限制下釋放43%的YTX毒素到濾液中的研究結果不同,這可能由于不同株系、不同培養條件及檢測方法等不同所導致。

4 結論

溫度和營養鹽限制對網狀原角藻生長和產毒均有影響,其中營養鹽的影響更為顯著和強烈。

本研究中,網狀原角藻在15℃L1-Si培養基中生長最好；N、P限制均有利于YTX毒素的合成和累積,15℃時P限制培養基中胞內YTX含量最高。

[1] Satake M, Ichimura T, Sekiguchi K, Yoshimatsu S, Oshima Y. Confirmation of yessotoxin and 45, 46, 47-trinoryessotoxin production byProtoceratiumreticulatumcollected in Japan. Natural Toxins, 1999, 7(4): 147- 150.

[2] Miles C O, Wilkins A L, Hawkes A D, Selwood A, Jensen D J, Aasen J, Munday R, Samdal I A, Briggs L R, Beuzenberg V, MacKenzie A L. Isolation of a 1, 3-enone isomer of heptanor- 41-oxoyessotoxin fromProtoceratiumreticulatumcultures. Toxicon, 2004, 44(3): 325- 336.

[3] Miles C O, Wilkins A L, Hawkes A D, Selwood A, Jensen D J, Munday R, Cooney J M, Beuzenberg V. Polyhydroxylated amide analogs of yessotoxin fromProtoceratiumreticulatum. Toxicon, 2005, 45(1): 61- 71.

[4] Miles C O, Wilkins A L, Selwood A I, Hawkes A D, Jensen D J, Munday R, Cooney J M, Beuzenberg V, MacKenzie A L. Isolation of Yessotoxin 32-O-[β-L-arabinofuranosyl-(5′→1 ″)-β-l-arabinofuranoside] fromProtoceratiumreticulatum. Toxicon, 2006, 47(5): 510- 516.

[5] Eiki K, Satake M, Koike K, Ogata T, Mitsuy T, Oshima Y. Confirmation of yessotoxin production by the dinoflagellateProtoceratiumreticulatumin Mutsu Bay. Fisheries Science, 2005, 71(3): 633- 638.

[6] Suzuki T, Horie Y, Koike K, Satake M, Oshima Y, Iwataki M, Yoshimatsu S. Yessotoxin analogues in several strains ofProtoceratiumreticulatumin Japan determined by liquid chromatography-hybrid triple quadrupole/linear ion trap mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2007, 1142(2): 172- 177.

[7] Samdal I A, Naustvoll L J, Olseng C D, Briggs L R, Miles C O. Use of ELISA to identifyProtoceratiumreticulatumas a source of yessotoxin in Norway. Toxicon, 2004, 44(1): 75- 82.

[8] Samdal I A, Olseng C D, Sandvik M, Miles C O, Briggs L R, Torgersen T, Jensen D J, Cooney J M. Profile of yessotoxin analogues in a Norwegian strain ofProtoceratiumreticulatum//5th International Conference on Molluscan Shellfish Safety. Galway, Ireland, 2006: 118- 118.

[9] Ciminiello P, Dell′Aversano C, Fattorusso E, Forino M, Magno S, Guerrini F, Pistocchi R, Boni L. Complex yessotoxins profile inProtoceratiumreticulatumfrom north-western Adriatic sea revealed by LC-MS analysis. Toxicon, 2003b, 42(1): 7- 14.

[10] Stobo L A, Lewis J, Quilliam M A, Hardstaff W R, Gallacher S, Webster L, Smith E A, Mckenzie M. Detection of yessotoxin in UK and Canadian isolates of phytoplankton and optimization and validation of LC-MS methods // Bates S, ed. Eighth Canadian workshop on Harmful Marine Algae. New Brunswick: Gulf Fisheries, 2003: 8- 14.

[11] Paz B, Riobó P, Fernández M L, Fraga S, Franco J M. Production and release of yessotoxins by the dinoflagellatesProtoceratiumreticulatumandLingulodiniumpolyedrumin culture. Toxicon, 2004, 44(3): 251- 258.

[12] Paz B, Riobó P, Ramilo I, Franco J M. Yessotoxins profile in strains ofProtoceratiumreticulatum from Spain and USA. Toxicon, 2007, 50(1): 1- 17.

[13] R?der K, Hantzsche F M, Gebühr C, Miene C, Helbig T, Krock B, Hoppenrath M, Luckas B, Gerdts G. Effects of salinity, temperature and nutrients on growth, cellular characteristics and yessotoxin production ofProtoceratiumreticulatum. Harmful Algae, 2012, 15: 59- 70.

[14] Konishi M, Yang X M, Li B, Fairchild C R, Shimizu Y. Highly cytotoxic metabolites from the culture supernatant of the temperate dinoflagellateProtoceratiumcf.reticulatum. Journal of Natural Products, 2004, 67(8): 1309- 1313.

[15] Pérez-Gómez A, Ferrero-Gutierrez A, Novelli A, Franco J M, Paz B, Fernández-Sánchez M T. Potent neurotoxic action of the shellfish biotoxin yessotoxin on cultured cerebellar neurons. Toxicological Sciences, 2006, 90(1): 168- 177.

[16] Ogino H, Kumagai M, Yasumoto T. Toxicologic evaluation of yessotoxin. Natural Toxins, 1997, 5(6): 255- 259.

[17] Seamer C. The production of yessotoxin byProtoceratiumreticulatum[D]. Wellington, New Zealand: Victoria University of Wellington, 2001.

[18] Mitrovic S M, Amandi M F, McKenzie L, Furey A, James K J. Effects of selenium, iron and cobalt addition to growth and yessotoxin production of the toxic marine dinoflagellateProtoceratiumreticulatumin culture. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2004, 313(2): 337- 351.

[19] Paz B, Vázquez J A, Riobó P, Franco J M. Study of the effect of temperature, irradiance and salinity on growth and yessotoxin production by the dinoflagellateProtoceratiumreticulatumin culture by using a kinetic and factorial approach. Marine Environmental Research, 2006, 62(4): 286- 300.

[20] Rodríguez J J G, Mirón A S, García M C C, Belarbi E H, Camacho F G, Chisti Y, Grima E M. Macronutrients requirements of the dinoflagellateProtoceratiumreticulatum. Harmful Algae, 2009, 8(2): 239- 246.

[21] Guerrini F, Ciminiello P, Dell′Aversano C, Tartaglione L, Fattorusso E, Boni L, Pistocchi R. Influence of temperature, salinity and nutrient limitation on yessotoxin production and release by the dinoflagellateProtoceratiumreticulatumin batch-cultures. Harmful Algae, 2007, 6(5): 707- 717.

[22] 陳建華, 于仁成, 孔凡洲, 高巖, 羅璇, 王云峰, 周名江. 北黃海海域蝦夷扇貝體內脂溶性藻毒素分析. 海洋與湖沼, 2014, 45(4): 855- 863.

[23] Guillard R R L, Hargraves P E.Stichochrysisimmobilisis a diatom, not a chrysophyte. Phycologia, 1993, 32(3): 234- 236.

[24] Koike K, Horie Y, Suzuki T, Kobiyama A, Kurihara K, Takagi K, Kaga S N, Oshima Y.Protoceratiumreticulatumin northern Japan: environmental factors associated with seasonal occurrence and related contamination of yessotoxin in scallops. Journal of Plankton Research, 2006, 28(1): 103- 112.

[25] Okolodkov Y B. The global distributional patterns of toxic, bloom dinoflagellates recorded from the Eurasian Arctic. Harmful Algae, 2005, 4(2): 351- 369.

[26] Boni L, Ceredi A, Guerrini F, Milandri A, Pistocchi R, Poletti R, Pompei M. ToxicProtoceratiumreticulatum(Peridiniales,Dinophyta) in the North-Western Adriatic Sea (Italy) // Hallegraeff G M, Blackburn S I, Bolch C J, Lewis R J, eds. Harmful algae. Paris: Intergovernmental Oceanographic Commission of UNESCO, 2001: 137- 140.

[27] Aasen J, Samdal I A, Miles C O, Dahl E, Briggs L R, Aune T. Yessotoxins in Norwegian blue mussels (Mytilusedulis): uptake fromProtoceratiumreticulatum, metabolism and depuration. Toxicon, 2005, 45(3): 265- 272.

[28] Varkitzi I, Pagou K, Granéli E, Hatzianestis I, Pyrgaki C, Pavlidou A, Montesanto B, Economou-Amilli A. Unbalanced N: P ratios and nutrient stress controlling growth and toxin production of the harmful dinoflagellateProrocentrumlima(Ehrenberg) Dodge. Harmful Algae, 2010, 9(3): 304- 311.

[29] Vanucci S, Pezzolesi L, Pistocchi R, Ciminiello P, Dell′Aversano C, Iacovo E D, Fattorusso E, Tartaglione L, Guerrini F. Nitrogen and phosphorus limitation effects on cell growth, biovolume, and toxin production inOstreopsiscf.ovata. Harmful Algae, 2012, 15: 78- 90.

[30] Granéli E, Flynn K. Chemical and physical factors influencing toxin content // Granéli E, Turner J T, eds. Ecological Studies: Ecology of Harmful Algae. Berlin: Springer-Verlag, Heidelberg, 2006, 189: 229- 241.

[31] Lim P T, Leaw C P, Kobiyama A, Ogata T. Growth and toxin production of tropicalAlexandriumminutumHalim (Dinophyceae) under various nitrogen to phosphorus ratios. JournalofAppliedPhycology, 2010, 22(2): 203- 210.

[32] Manuel S. Effect of temperature on growth and production of YTXs and lytic compounds byProtoceratiumreticulatumfrom Greenland[D]. Bremen: University of Bremen, 2014.

[33] Markou G. Alteration of the biomass composition ofArthrospira(Spirulina)platensisunder various amounts of limited phosphorus. Bioresource Technology, 2012, 116: 533- 535.

[34] Boyer G L, Sullivan J J, Anderson R J, Harrison P J, Taylor F J R. Effects of nutrient limitation on toxin production and composition in the marine dinoflagellateProtogonyaulaxtamarensis. Marine Biology, 1987, 96(1): 123- 128.

[35] Anderson D M, Kulis D M, Sullivan J J, Hall S, Lee C. Dynamics and physiology of saxitoxin production by the dinoflagellatesAlexandriumspp. Marine Biology, 1990, 104(3): 511- 524.

[36] Flynn K, Franco J M, Feranandez P, Reguera B, Zapata M, Wood G, Flynn K J. Changes in toxin content, biomass and pigments of the dinoflagellateAlexabdriumminutumduring nitrogen refeeding and growth into nitrogen or phosphorus stress. Marine Ecology Progress Series, 1994, 111: 99- 109.

[37] John E H, Flynn K J. Modelling changes in paralytic shellfish toxin content of dinoflagellates in response to nitrogen and phosphorus supply. Marine Ecology Progress Series, 2002, 225: 147- 160.

[38] Smayda T J. Harmful algal blooms: Their ecophysiology and general relevance to phytoplankton blooms in the sea. Limnology and Oceanography, 1997, 42(5): 1137- 1353.

[39] Frangópulos M, Guisande C, deBlas E, Maneiro I. Toxin production and competitive abilities under phosphorus limitation ofAlexandriumspecies. Harmful Algae, 2004, 3(2): 131- 139.

[40] Cembella A D. Ecophysioology and metabolism of paralytic shellfish toxins in marine microalgae // Anderson D M, Cembella A D, Hallegraeff G M, eds. Physiological Ecology of Harmful Algal Blooms, Berlin: Springer-Verlag, 1998: 381- 403.

[41] Rein K S, Snyder R V. The biosynthesis of polyketide metabolites by dinoflagellates. Advances in Applied Microbiology, 2006, 59: 93- 125.

[42] Rein K S, Borrone J. Polyketides from dinoflagellates: origins, pharmacology and biosynthesis. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 1999, 124(2): 117- 131.

Effects of temperature and nutrient limitation on growth and yessotoxin production ofProtoceratiumreticulatum

GAO Chunlei1, 2, 3,*, SUN Ping1, 2, 3,4, JIA Zhihui1, JIANG Meijie1, 2, 3, ZHAO Cuiqiong5, ZHANG Xuelei1, 2, 3，WU Zhenxing6，LIANG Chengzhu6

1FirstInstituteofOceanography,StateOceanicAdministration,Qingdao266061,China2LaboratoryofMarineEcologyandEnvironmentalScience,Qingdao;NationalLaboratoryforMarineScienceandTechnology,Qingdao266061,China3KeyLaboratoryofMarineEcologicalEnvironmentalScienceandEngineering,StateOceanicAdministration,Qingdao266061,China4OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China5EastChinaSeaForecastCenter,StateOceanicAdministration,Shanghai200081,China6InspectionandQuarantinetechnologyCenterofShandongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Qingdao266002，China

Protoceratiumreticulatum,a marine dinoflagellate that produces yessotoxins (YTXs), is common in coastal waters worldwide and can form toxic algal blooms. There are marked differences in its growth and toxin-producing characteristics in different areas. This study investigated the effects of temperature and nutrient (N, P) limitation on the growth and toxin production ofP.reticulatumrecently isolated from the North Yellow Sea. The results showed that temperature and nutrient limitation affected growth and toxin production of the alga to different degrees, but nutrient limitation had a more significant influence. Lower temperatures were more suitable for the growth ofP.reticulatum. Growth of algal cells in L1-Si medium without nutrient limitation was best at 15℃. P limitation greatly reduced the specific growth rate and cell density (P< 0.01), and shortened the duration of the exponential and stationary phases. N-limited cultures, in contrast, resulted in a growth rate and maximum cell density similar to those in L1-Si medium, but with a shorter stationary phase. At all temperatures, both N and P limitation were favorable for the accumulation of YTX in algal cells, which was particularly marked in the latter. The maximum YTX content of 92.6pg/cell was observed in 1/10P medium at 15℃ at the end of the stationary phase. This was approximately 3.8 times and 7.1 times that of the YTX in the N limited and L1-Si medium at the same culture temperature, respectively. Changes in temperature had different influences on the content of intracellular YTX in N- and P-limitation cultures. In the range of 5—15℃, temperature change had a negative effect on YTX increase under N limitation, whereas in P-limited medium, the effect was positive. In all culture conditions, the YTX concentration in the filtrate began to increase during the stationary phase. Compared with L1-Si, both N- and P-limited media were not conducive to the release of toxins. Higher temperature helpful to YTX release in the L1-Si and N-limited media, but it did not significantly affect that in the P-limited medium.

Protoceratiumreticulatum; nutrient limitation; temperature; yessotoxin (YTX); North Yellow Sea

國家自然科學基金(41206161)；海洋公益性行業科研專項經費項目(201305010)；國家海洋局第一海洋研究所基本科研業務專項資金項目(2012T08, GY2013G28)；國家基金委-山東省聯合基金項目“海洋生態與環境科學”(U1406403)；青島市創業創新領軍人才項目計劃(13-CX-28)

2016- 05- 20;

2017- 01- 16

10.5846/stxb201605200974

*通訊作者Corresponding author.E-mail: gaochunlei@fio.org.cn

高春蕾,孫萍,賈智慧,姜美潔,趙翠瓊,張學雷，吳振興，梁成珠.溫度和營養鹽限制對網狀原角藻生長與產毒的影響.生態學報,2017,37(12):4217- 4226.

Gao C L, Sun P, Jia Z H, Jiang M J, Zhao C Q, Zhang X L,Wu Z X，Liang C Z.Effects of temperature and nutrient limitation on growth and yessotoxin production ofProtoceratiumreticulatum.Acta Ecologica Sinica,2017,37(12):4217- 4226.