山西大豆皂苷類型及其關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析

趙巧玲 刁秀楠 郭春絨 趙晉忠 杜維俊 岳愛(ài)琴

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，太谷 030801）

山西大豆皂苷類型及其關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析

趙巧玲 刁秀楠 郭春絨 趙晉忠 杜維俊 岳愛(ài)琴

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，太谷 030801）

大豆皂苷Aa、Ab的含量影響大豆制品口感，旨在了解大豆籽粒中皂苷Aa和Ab的組成及含量，進(jìn)而研究其合成代謝機(jī)制。采用HPLC-ESI-MS/MS技術(shù)測(cè)定大豆材料中Aa、Ab皂苷的含量，利用qRT-PCR技術(shù)研究籽粒發(fā)育過(guò)程中GmSg-1基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，68個(gè)山西大豆材料種子中Aa型大豆材料胚和子葉中Aa皂苷含量的變異范圍分別為0.41-33.79 mg/g，0.21-8.39 mg/g；Ab型大豆胚和子葉中Ab皂苷的變異范圍分別為0.85-44.96 mg/g，0.26-11.09 mg/g。GmSg-1基因序列有19個(gè)SNP多態(tài)性位點(diǎn)，其中10個(gè)SNP引起氨基酸變異。Aa、Ab大豆皂苷含量在籽粒發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，在開花后40-50 d皂苷含量達(dá)到最大值，而GmSg-1基因的相對(duì)表達(dá)量在前期呈現(xiàn)與含量基本相同的趨勢(shì)。

大豆；皂苷；GmSg-1

大豆皂苷（Soyasaponin）是大豆生長(zhǎng)過(guò)程中的一類次生代謝產(chǎn)物［1］。具有許多對(duì)人體有益的生理功能［2-5］，因此越來(lái)越受到人們的重視。大豆皂苷種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，根據(jù)大豆皂苷苷元的不同目前把發(fā)現(xiàn)的54種大豆皂苷［6-8］分為7類：A類、B類、DDMP類、E類、H類、I類和J類皂苷［9-12］。

A類大豆皂苷是以大豆皂醇A為苷元，在其C-3和C-22位各結(jié)合一個(gè)糖基鏈，根據(jù)糖基鏈的不同A類皂苷又可分為Aa、Ab和Ao 3個(gè)系列［6，9，12，13］。Aa和Ab系列C-22位上分別連有乙?；咎腔鸵阴；咸烟腔?4］，Ao系列皂苷是不含乙?；腔模?5］。GmSg-1基因編碼Aa和Ab皂苷合成的關(guān)鍵酶UGT73F4和UGT73F2（圖1）。A類皂苷C-22位末端糖基乙酰化會(huì)導(dǎo)致大豆及其制品味道苦澀［16］，這嚴(yán)重影響其口感。因此，為了改善大豆制品的口感，降低和去除A類皂苷，逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)。

本研究采用高效液相色譜-電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（High performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandern mass spectrometry，HPLC-ESI-MS/MS）測(cè)定68份大豆材料胚和子葉中Aa、Ab皂苷的含量以及籽粒發(fā)育過(guò)程中Aa、Ab皂苷的含量，利用qRT-PCR技術(shù)研究了籽粒發(fā)育過(guò)程中Aa、Ab皂苷合成的關(guān)鍵酶基因GmSg-1的表達(dá)量，并分析GmSg-1基因DNA序列的多態(tài)性。旨在了解大豆籽粒中大豆皂苷Aa和Ab的合成代謝機(jī)制，為降低大豆籽粒中A類皂苷含量以及改良大豆品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取適宜山西種植的68份大豆材料作為實(shí)驗(yàn)材料，所有材料由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆育種室提供。供試大豆材料于2015年種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，按小區(qū)種植，3次重復(fù)。大豆種子成熟后自然晾干，分離胚和子葉，保存用于檢測(cè)大豆皂苷。

開花期對(duì)晉豆52、晉遺30、千斤豆、武黑、中黃13、L-6開花時(shí)間相同且在同一部位的花進(jìn)行掛牌標(biāo)記，分別取開花后25、32、40、50、60和70 d的大豆莢，每莢取兩粒大豆籽粒，其中一粒用于大豆皂苷的測(cè)定，低溫冷凍干燥，-20℃保存?zhèn)溆?。另一粒用于基因表達(dá)分析，并立即將籽粒于液氮中冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)時(shí)期取材均3次重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 Aa、Ab皂苷含量的測(cè)定 參考岳愛(ài)琴等［17］測(cè)定大豆皂苷的方法，采用HPLC-ESI-MS/MS測(cè)定不同大豆材料胚和子葉中Aa、Ab皂苷的含量。

圖1 Aa和Ab皂苷合成途徑

1.2.2 GmSg-1基因的獲得和測(cè)序 采用CTAB法提取材料基因組DNA，使用BioPhotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA的濃度和質(zhì)量，將DNA稀釋至20 ng/μL供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。用Primer Premier 5軟件，參照NCBI公布的GmSg-1序列（AB628091），設(shè)計(jì)引物F1/R1（F1：5′-ATGGGGTCTCTTGTCATCTTCA -3′；R1：5′-TTTAGAGAACAAAAGAAGGCGTAGT-3′）。以材料基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段。PCR體系總體積15 μL，其中DNA模板（20 ng/μL）2.1 μL、5×buffer 3.0 μL、正反引物各0.3 μL（10 μmol/L）、dNTP（2.5 μmol/L）0.4 μL、TransStart?Fast Pfu 0.3 μL和ddH2O 8.6 μL。PCR程序：95℃ 5 min；95℃ 1 min，57℃ 45 s，72℃ 1 min 48 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，15℃保存。用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)單一目標(biāo)條帶進(jìn)行割膠回收，送上海生工進(jìn)行測(cè)序。

表1 不同品種大豆的分類

1.2.3 目標(biāo)基因DNA序列單核苷酸多態(tài)性分析 利用DNAStar軟件分析GmSg-1序列的基因多態(tài)性位點(diǎn)。

1.2.4 qRT-PCR檢 測(cè)GmSg-1基 因表 達(dá) 利 用Trizol法［18］提取RNA，TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金）試劑盒轉(zhuǎn)錄cDNA。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)目標(biāo)片段長(zhǎng)度為100 bp左右的qRT-PCR引物F2/R2（F2：5′-TCCTGGGCGGATGACG-3′；R2：5′-CGGAATGGAGTTCGGGG-3′），選擇CYP2基因作為內(nèi)參基因（引物F3：5′-CGGGACCAGTGTGCTTCTTCA-3′；R3：5′-CCCCTCCACTACAAAGGCTCG-3′）。反應(yīng)總體積為10 μL，含SYBR Premix Ex Taq II 5 μL，引物各1 μL（10 μmol /L），cDNA模板1 μL（100 ng/μL）和RNase Free water 3 μL。qRT-PCR程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s；58℃ 15 s，40次循環(huán)，每個(gè)循環(huán)采集一次信號(hào)；完成以上步驟后，65℃ 5 s；完成最后的熒光信號(hào)采集，3次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 大豆皂苷組成多態(tài)性分析

對(duì)山西68份大豆材料種子中的大豆皂苷組成進(jìn)行多態(tài)性分析，分為Aa型、Ab型、AaAb型3種類型（圖2），所占比例分別為51.5%、44.1%和4.4%，說(shuō)明本試驗(yàn)山西大豆材料大豆皂苷類型主要為Aa型和Ab型。其中35份大豆材料為Aa型，30份大豆材料為Ab型，3份大豆材料（晉大47、SNWS285、中黃42）為AaAb型（表1）。

2.2 不同類型大豆材料Aa、Ab皂苷含量分析

采用HPLC-ESI-MS/MS法分別測(cè)定了不同大豆材料胚和子葉中Aa、Ab皂苷的含量，結(jié)果（表2）表明，不同大豆籽粒中Aa、Ab皂苷含量相差較大，Aa型大豆材料胚和子葉中Aa皂苷含量的變異范圍分別為0.41-33.79 mg/g和0.21-8.39 mg/g，Ab型大豆材料胚和子葉中Ab皂苷含量的變異范圍分別為0.85-44.96 mg/g和0.26-11.09 mg/g。胚中Aa或Ab皂苷含量均高于子葉。

表2 大豆胚和子葉中Aa、Ab皂苷含量分析（mg·g-1）

圖2 三種類型大豆的HPLC-ESI-MS/MS譜圖

2.3 籽粒不同發(fā)育時(shí)期大豆皂苷含量的分析

采用HPLC-ESI-MS/MS法分別對(duì)3種Aa型（武黑、中黃13、L-6）、3種Ab型（晉豆52、晉遺30、千斤豆）大豆材料籽粒不同發(fā)育時(shí)期Aa和Ab皂苷含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果（圖3）表明，Aa型和Ab型大豆籽粒中Aa、Ab皂苷含量均在開花后40-50 d達(dá)到最大值，之后隨著大豆的成熟，大豆皂苷含量降低，總體呈先增后減的變化趨勢(shì)。

2.4 GmSg-1基因的多態(tài)性分析

從NCBI得知，GmSg-1基因位于染色體7 -NC_016094.2，開放性閱讀框?yàn)?383 bp，測(cè)序結(jié)果與cDNA進(jìn)行比對(duì)結(jié)果表明該序列沒(méi)有內(nèi)含子。用GmSg-1基因特異性引物F1/R2對(duì)5種Aa型、5種Ab型大豆材料的GmSg-1基因進(jìn)行擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示10個(gè)材料均在1 800 bp左右有單一條帶（圖4）。對(duì)測(cè)序所得DNA序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（表3和圖5）表明GmSg-1a和GmSg-1b基因共有19個(gè)SNP位點(diǎn)差異，其中10個(gè)SNP位點(diǎn)引起氨基酸變異，其余9個(gè)SNP為同義突變。

2.5 不同發(fā)育時(shí)期GmSg-1基因相對(duì)表達(dá)量分析

對(duì)晉遺30不同發(fā)育時(shí)期籽粒中GmSg-1基因的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖6）表明，GmSg-1和CYP2基因的溶解曲線峰值單一，引物的特異性好，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。GmSg-1基因相對(duì)表達(dá)量在開花后25、32、40、50、60 d呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，開花后70 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量變高（圖7）。開花后40 d GmSg-1基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于25 d和32 d，開花后50 d、60 d表達(dá)量顯著降低。GmSg-1基因相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)與籽粒皂苷含量變化趨勢(shì)基本一致（圖3），最后一個(gè)時(shí)期GmSg-1基因相對(duì)表達(dá)量與皂苷含量變化趨勢(shì)不一致，可能是其他基因調(diào)控所致，還有待進(jìn)一步研究。

圖3 不同發(fā)育時(shí)期籽粒大豆皂苷含量分析

3 討論

大豆皂苷是大豆發(fā)育過(guò)程中的一種重要次生代謝產(chǎn)物［1］，具有許多對(duì)人體有益的生理功能［2-5］。目前發(fā)現(xiàn)大豆皂苷由54種皂苷組成［8］，其中A類皂苷中Aa、Ab皂苷C-22位末端糖基乙酰化是導(dǎo)致大豆及其制品味道苦澀的主要原因［6，14］。A 類皂苷缺失的大豆材料其大豆制品口感較好［13］。前人研究表明大豆皂苷在不同大豆種質(zhì)材料中具有豐富的遺傳變異［19］。因此，對(duì)大豆種質(zhì)資源的皂苷組成和含量進(jìn)行研究，不斷篩選出皂苷組成和含量特異材料，不僅可以用于大豆皂苷的代謝機(jī)制研究，還可以用于大豆皂苷品質(zhì)的遺傳改良。本研究利用HPLCESI-MS/MS對(duì)具有代表性的68份山西大豆材料種子中大豆皂苷組成進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)供試材料分為Aa、Ab、AaAb 3種類型，并且主要為Aa和Ab型。Takahashi等［20］對(duì)我國(guó)3 731份野生大豆資源大豆皂苷類型進(jìn)行鑒定，結(jié)果也表明Aa 型和Ab 型為主要類型，同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)了一份Aa和Ab皂苷均缺失的Ao類型野生大豆材料。本研究供試材料中未發(fā)現(xiàn)Ao類型，但研究發(fā)現(xiàn)Aa和Ab皂苷含量存在較大的變異范圍，Aa和Ab皂苷含量低的大豆材料可用于今后改良大豆皂苷品質(zhì)的改良。

圖4 GmSg-1基因PCR結(jié)果檢測(cè)

表3 GmSg-1基因的多態(tài)性位點(diǎn)

圖5 Aa型、Ab型大豆GmSg-1基因序列比對(duì)

圖6 目標(biāo)基因的溶解曲線

圖7 晉遺30不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量分析

通過(guò)研究不同品種大豆籽粒中Aa、Ab皂苷含量以及大豆籽粒成熟過(guò)程中皂苷Aa、Ab的積累和GmSg-1基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，參試大豆材料籽粒胚和子葉中Aa、Ab皂苷變異范圍大，說(shuō)明我國(guó)擁有的大豆資源Aa、Ab皂苷變異豐富，對(duì)今后研究大豆皂苷品質(zhì)育種工作具有重要意義。

本研究對(duì)晉遺30大豆籽粒不同發(fā)育時(shí)期的GmSg-1基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行研究，結(jié)果表明GmSg-1基因表達(dá)量呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，與其Ab含量的變化趨勢(shì)基本一致。但GmSg-1基因在大豆開花后70 d 籽粒中表達(dá)量達(dá)到最大，這可能說(shuō)明是GmSg-1基因是大豆皂苷Aa、Ab合成的關(guān)鍵酶基因，但是大豆皂苷Aa、Ab合成過(guò)程中是否還有其他基因調(diào)控，仍有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，68個(gè)品種大豆中Aa型大豆胚和子葉中Aa皂苷的變異范圍分別是0.41-33.79 mg/g，0.21-8.39 mg/g；Ab型大豆胚和子葉中Ab皂苷的變異范圍分別是0.85-44.96 mg/g，0.26-11.09 mg/g。大豆不同發(fā)育時(shí)期籽粒Aa、Ab皂苷含量呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，在開花后40-50 d皂苷含量達(dá)到最大值。測(cè)序發(fā)現(xiàn)Aa、Ab型大豆材料GmSg-1基因共有19個(gè)SNP多態(tài)性位點(diǎn)，其中10個(gè)SNP引起氨基酸變異。對(duì)不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)變化趨勢(shì)呈先增后減，與皂苷含量變化趨勢(shì)基本一致。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Type Analysis of Saponin and Gene Expression of Key Enzyme in Shanxi Soybeans

ZHAO Qiao-ling DIAO Xiu-nan GUO Chun-rong ZHAO Jin-zhong DU Wei-jun YUE Ai-qin
（Shanxi Agricultural University，Taigu 030801）

The contents of soysaponin Aa and Ab determine the taste of soybean products，this study aims to understand the composition and content of Aa and Ab soysaponin in soybean seeds，and then to study the mechanism of anabolism and synthesis. HPLC-ESI-MS/MS was employed to measure the contents of Aa and Ab saponins in soybean，and qRT-PCR technique to study the relative expression of GmSg-1 gene in grain accumulation. Results showed among 68 Shanxi soybean seeds，the range of Aa saponin variation were 0.41-33.79 mg/g and 0.21-8.39 mg/g in hypocotyls and cotyledons respectively for Aa type soybean materials；and the range of Ab saponin variation were 0.85-44.96 mg/ g and 0.26-11.09 mg/g for Ab type soybean materials. There were 19 SNP variants in GmSg-1 gene，and 10 of them resulting in amino acid substitutions were detected. The contents of Aa and Ab soysaponin increased at first and then decreased in the process of accumulation，and the contents of soysaponin were the highest after blossoming 40-50 d，while the relative expression of GmSg-1 gene was basically in the same trend as the content of soysaponin.

soybean；saponin；GmSg-1

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0395

2017-05-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171580），山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（201601D011076），山西省高等學(xué)校科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2015148），山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中青年拔尖創(chuàng)新人才支持計(jì)劃（201203），山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)費(fèi)（dwj）

趙巧玲，女，碩士研究生，研究方向：大豆品質(zhì)研究；E-mail：1009495213@qq.com

岳愛(ài)琴，女，副教授，研究方向：大豆品質(zhì)育種；E-mail：yueaiqinnd@126.com