篩選脫氮假單胞菌啟動子提高維生素B12產量

王玲玲夏苗苗董會娜朱蓓薇張大偉，

（1. 大連工業大學食品學院，大連 116034；2. 中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

篩選脫氮假單胞菌啟動子提高維生素B12產量

王玲玲1夏苗苗2董會娜2朱蓓薇1張大偉1，2

（1. 大連工業大學食品學院，大連 116034；2. 中國科學院天津工業生物技術研究所，天津 300308）

維生素B12（VB12/鈷胺素）具有多種生理學功能，廣泛應用于制藥、食品等行業。脫氮假單胞菌是維生素B12常用工業菌株之一。通過篩選高表達啟動子來過表達VB12合成途徑基因，能有效提高菌株的VB12生產能力。通過對脫氮假單胞菌中某些編碼熱激蛋白和分子伴侶基因前含啟動子在內的非編碼序列用啟動子在線預測軟件進行分析，選取PibpA、PcbpA、PdnaJ、PhtpG、Pdnak、PgrpE的非編碼區與編碼綠色熒光蛋白的GFP報告基因相連，通過酶標儀檢測GFP的熒光信號值，對編碼熱激蛋白和分子伴侶基因前的非編碼區所含有的啟動子的表達強度進行評估，以獲得高表達的啟動子對VB12合成途徑的基因進行過表達。結果表明，含有啟動子Pdnak的非編碼區，其表達的GFP熒光值最高。進而構建強啟動子Pdnak與維生素B12合成途徑基因cobA的過表達重組菌，發酵數據表明，與對照菌株相比重組菌株維生素B12產量提高21.5 mg/L。篩選高表達啟動子用于維生素B12合成途徑關鍵基因的表達，是一種有效的提高維生素B12產量的方法。

脫氮假單胞菌；強啟動子；cobA；維生素B12；Gibson assembly

維生素B12（Vitamin B12）又稱鉆胺素［1］，作為一種含鈷的類咕啉化合物［2］，是唯一需要腸道分泌物幫助才能被吸收的維生素。維生素B12是維生素產品中價格最為昂貴的品種之一，具有廣泛的生理學作用，它參與體內甲基轉換以及葉酸代謝，促進神經髓鞘中脂蛋白的形成，保持中樞神經和外周髓鞘神經纖維的功能完整，并參與廣泛的蛋白質及脂肪代謝［3］。維生素B12在微生物中合成是受限的，由于其復雜的結構，超過30個基因參與到維生素B12的生物合成全過程，數量占到典型細菌基因組的1%［4］。生物合成維生素B12在自然界中有2條途徑［5］：（1）好氧途徑，此途徑在Rhodobacter sphaeroides、Sinorhizobium meliloti和脫氮假單胞菌中有所研究；（2）厭氧途徑，此途徑在Bacillus megaterium、P.shemanii 和 Salmonella typhimurium 中有所研究［6］。相比于厭氧發酵過程的丙酸桿菌，好氧發酵過程的脫氮假單胞菌表現出更快速的細胞生長和高效維生素B12的生產能力。

啟動子是基因表達調控的順式元件，也是基因工程表達載體的一個重要元件。啟動子在轉錄水平上所起到的重要作用，不僅決定了基因的表達水平，而且決定了基因表達的時空順序［7-9］，在確定啟動子表達強度的研究中，大多是利用報告基因的表達量來達到研究目的，常用的報告基因有綠色熒光蛋白 GFP（Green fluorescent protein）、紅色熒光蛋白RFP（Red fluorescent protein）和β-半乳糖苷酶lacZ（β-galactosidase）等［10，11］。根據在菌株中篩選強啟動子的相關文獻報道，某些編碼熱激蛋白和分子伴侶基因前的啟動子表現出較高的表達強度。熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）啟動子是一段位于結構基因5′端上游區的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確結合并具有轉錄起始的特異性，在基因表達調控中具有開關性作用［12］。Dong等［13］在氧化葡萄糖酸桿菌中發現高強度啟動子Pdnak，分子伴侶蛋白啟動子Pdnak在強化氧化葡萄糖酸桿菌中D-山梨醇脫氫酶關鍵基因 sldAB1的表達時，有效縮短 D-山梨醇的轉化時間、提高 L-山梨糖產量，轉化時間比野生菌縮短了33.3%以及產量提高了11.2%，驗證了 Pdnak的高強度啟動活性。

S-腺苷-L-甲硫氨酸依賴型尿卟啉原Ⅲ轉甲 基 酶（S-adenosy-L-methionine uroprophyrinogenⅢ methyltransferase，SUMT） 催 化 尿 卟 啉 原 Ⅲ（Uroprophyrinogen Ⅲ）生成前咕啉-2，是維生素 B12生物合成途徑中的一個關鍵酶，由cobA基因編碼。法國RPR公司曾經提高了脫氮假單胞菌中cobA基因的拷貝數，發現對提高維生素B12產量有所幫助［4］。本研究通過篩選高表達的啟動子，能提高cobA基因的表達水平，并在質粒上過表達cobA增加其拷貝數，達到提高維生素B12產量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 本研究所用菌株和質粒均列于表1。

表1 所用菌株與質粒

1.1.2 PCR引物 本研究所用PCR引物用Primer 5.0軟件進行設計，引物均合成于蘇州金唯智生物科技有限公司，見表2。

1.1.3 主要試劑、儀器和培養基 主要試劑：基因組DNA提取試劑盒（DP302-02），質粒小提試劑盒（D69-4302），膠回收試劑盒和柱式PCR產物純化試劑盒（D6492-02）購于OMEGA公司，其他未特殊指明的試劑均購自索萊寶生物科技有限公司。

限制性內切酶購自Thermo Fisher Scientific公司，DNA聚合酶PrimerSTAR Mix購自TaKaRa，2×Taq PCR MasterMix和DNA Marker購于北京天根生化科技有限公司。Gibson Assembly 1.2 Master Mix為紐英倫（NEW ENGLAND BioLabs）生物技術有限公司產品。

EDC-810基因擴增儀器：東勝國際貿易有限公司；EYETM凝膠自動成像儀：法國VILBER LOURMAT；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；DYY-6C核酸電泳儀：北京市六一儀器；WY-2112B恒溫培養振蕩器購自上海智城分析儀器有限公司；V-1600分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；5810R臺式高速離心機：德國Eppendorf公司；SpectraMax M5 多功能連續酶標儀：美國MD公司；Agilent 1260高效液相色譜分析儀：安捷倫科技有限公司；Leica MZFLⅢ熒光顯微鏡：購自東莞同創儀器有限公司。

大腸桿菌（Escherichia coli）采用LB（Luria-Bertani）培養基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，固體培養基另加入瓊脂15。

脫氮假單胞菌種子培養基（g/L）：KH2PO42.5，NaCl 2.5，NH4Cl 0.5，MgSO40.13，葡萄糖1，CaCl25，KOH將pH值調到pH 7.0-7.2。

發酵培養基（g/L）：蔗糖 50，玉米漿（Corn steep liquor）60，（NH4）2SO42，CoCl20.006，KH2PO42.6，甜菜堿6，前體（DMBI）1，KOH將pH值調到pH 7.0-7.2。

補料培養基（g/L）：前體（DMBI）12，甜菜堿30，CoCl20.15，葡萄糖130。抗生素和使用濃度：卡那霉素50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 啟動子的在線預測 利用啟動子在線預測軟件BPROM（http://www. softberry.com/berry. phtml? Topic = bprom&group=programs&subgroup=gfindb）來預測啟動子的序列位置。

1.2.2 含不同強度啟動子和gfp的重組菌的構建 從脫單假單胞菌菌株中提取基因組，并以此為模板，擴增啟動子 PibpA、PcbpA、PdnaJ、PhtpG、Pdnak、PgrpE以及cobA基因自身啟動子PcobA，與gfp基因overlap相連接。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測大小。用試劑盒回收目的片段，并和載體進行Gibson Assembly［15］，50℃反應1 h，轉化入大腸桿菌感受態細胞DH5α。轉化液涂布于含卡那霉素50 μg/mL的LB 平板上37℃過夜培養，挑取轉化子進行菌落PCR驗證，并對檢測正確的菌株加入至LB液體中過夜培養，用質粒小提試劑盒提取重組質粒送到蘇州金唯智生物技術有限公司進行測序。使用NCBI在線比對軟件BLAST（http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast.cgi）進行序列比對。質粒通過三親本轉化到脫氮假單胞菌，挑取單菌落過夜培養后，用終濃度15%的甘油保存菌液，凍存于-80℃。

1.2.3 酶標儀檢測重組菌的熒光值 分別取-80℃凍存管，將含有不同啟動子的重組菌株劃線，30℃倒置培養4 d。分別挑取單菌落接種于含有30 mL種子液的250 mL三角瓶中，200 r/min、30℃培養36 h，按10%的接種量，接種到含30 mL發酵液的250 mL三角瓶中200 r/min、30℃培養。每株重組菌株均設置兩個平行。每隔4 h取樣檢測，分別取2 mL培養液，使用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次，去除培養基中的雜質和死細胞。使用NUNC 96孔黑色酶標板進行熒光檢測，使用96孔白色細胞培養板進行OD600檢測（熒光和OD600檢測均做2個復孔，每孔加入200 μL洗滌后的細胞懸浮液），所用儀器為連續波長多功能酶標儀，操作軟件為Softmax Pro。熒光強度檢測參數設置為：激發波長485 nm，發射波長520 nm。OD600檢測參數設置為：吸收光波長 600 nm，并選擇調整光程。同時，取10 μL發酵菌液于載玻片上并使用熒光顯微鏡進行熒光鏡檢，曝光時間選擇為2 ms。

1.2.4 cobA過表達菌株的構建 以脫氮假單胞菌基因組為模板，利用引物擴增大小為843 bp的cobA基因。PCR產物經1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測大小，膠回收后，用Gibson assembly方法連接到質粒pBHR1 -PdnaK（載體需經Dpn1處理），構建得到質粒pBHR1-PdnaK-cobA。使用三親本轉化法，將構建得到的重組載體pBHR1-PdnaK-cobA導入到脫氮假單胞菌，驗證正確的轉化子被命名為重組菌脫氮假單胞菌 pBHR1-PdnaK-cobA。

1.2.5 過表達cobA重組菌的搖瓶發酵及維生素B12產量測定 將驗證正確的過表達cobA基因的重組菌株，挑單菌落接種于含30 mL種子液的250 mL三角瓶中200 r/min、30℃培養36 h，按10%的接種量，接種到含30 mL發酵液的250 mL三角瓶中200 r/min、30℃培養144 h。以野生型脫氮假單胞菌為對照組，每株重組菌株均設置兩個平行。菌體濃度采用測量吸光值法，取2 mL發酵液，定容至100 mL后，測量吸光值（OD600）。

維生素B12在液體發酵培養基中含量的測定方法是之前有過相關報道的高效液相色譜法（HPLC）［14］。發酵結束后取4 mL樣品液體并向其中加入1 mL NaNO28%和1 mL冰醋酸，在熱水中煮沸30 min。離心分離10 000 r/min、10 min并且將上清液通過0.22 μm膜過濾器（Φ= 0.22 μm），取濾液1 mL，加入2 %氰化鈉溶液20 μL，過濾至上樣瓶中。分析使用安捷倫（Agilent 1260）高效液相色譜法5c18-250a柱恒溫設置為35℃。流動相為：水和乙腈，體積比為70∶30且流速控制在0.8 mL/min，檢測分析物質在361 nm處檢測。

2 結果

2.1 啟動子特征分析

確定挑選的7個啟動子片段區域，并 使 用 原核 生 物 啟 動 子 預 測 軟 件BPROM（http://www. softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=program s&subgroup=gfindb）評測啟動子區域。使用軟件均預測到-10區和-35區啟動子核心序列的存在，該網站上標明利用該軟件預測的啟動子-10區和-35區的準確率在80%左右。并給出了相應的 LDF（Linear discriminant function）預測得分，啟動子預測的-35區和-10區，及相應的間隔堿基數分布信息，LDF預測得分，詳見表3。

表3 啟動子特性分析

2.2 重組質粒的構建

PCR擴增啟動子片段PibpA、PcbpA、PdnaJ、PhtpG、Pdnak、PgrpE、PcobA，gfp基因，獲得的片段電泳圖譜如圖 1 所示。片段的長度分別為512 bp、977 bp、568 bp、539 bp、588 bp、710 bp、980 bp和717 bp。

圖1 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

將啟動子片段與gfp片段overlap連接后切膠回收純化后，與線性化載體用Gibson assembly方法組裝（圖2）后轉化到大腸桿菌DH5α，涂于LB抗性平板，挑選單菌落進行PCR驗證，PCR驗證正確的送蘇州金唯智公司進行測序，測序正確的質粒按照方法1.2.2構建含不同啟動子強度和gfp報告基因的脫氮假單胞重組菌。

2.3 GFP熒光檢測結果分析

在脫氮假單胞菌中以gfp為報告基因評價各啟動子的表達強度，質粒構建完成后獲得7株重組菌 株 PibpA-gfp、PcbpA-gfp、Pdnak-gfp、PdnaJ-gfp、PhtpG-gfp、PgrpE-gfp、PcobA-gfp。并使用多功能熒光酶標儀檢測培養細胞的熒光強度。啟動子強度由測定得到的RFU/OD600值來表征。其中Pdnak-gfp、PhtpG-gfp和PdnaJ-gfp的熒光實驗結果表明其含有的啟動子表達強度較高。圖3中A、C、E顯示，3株重組菌呈線性增長直到發酵28 h達到穩定期，RFU/OD600在對數中后期達到最大值。帶有啟動子Pdnak的菌株RFU和RFU/OD600的值明顯高于其他兩株菌。同時，將上述3株高熒光值菌株用熒光顯微鏡觀察，結果顯示重組菌株Pdnak-gfp有較強的熒光強度。酶標儀檢測和顯微鏡鏡檢結果（圖3-B、D、F）表明，重組菌的熒光強度大小為Pdnak＞ PhtpG＞ PdnaJ，以最大RFU/OD600的值為標準，重組菌Pdnak約為PhtpG、PdnaJ構建的重組菌的1.5倍和18倍。

圖2 重組質粒構建示意圖

2.4 cobA過表達菌株的構建

使用強啟動子PdnaK構建cobA的過表達重組菌。PCR擴增cobA片段，并與線性化載體pBHR1-PDnaK通過Gibson assembly獲得重組質粒pBHR1-PdnaK-cobA。然后轉化到大腸桿菌DH5α，涂于LB抗性平板，挑選單菌落進行PCR驗證，經驗證正確的進行測序。使用三親本轉化法，將構建得到的重組載體pBHR1-PdnaK-cobA導入到脫氮假單胞菌，驗證正確的轉化子被命名為重組菌P. denitrifican pBHR1- PdnaK- cobA。

2.5 重組菌搖瓶發酵結果

在脫氮假單胞菌中使用篩選得到的強啟動子Pdnak提高維生素B12合成途徑相關基因cobA的表達。對構建得到的工程菌株P. denitrificans-Pdnak-cobA進行發酵測定其維生素B12產量，對照組為野生型脫氮假單胞菌。用高效液相色譜測定維生素B12產量，結果如圖4所示，含有過表達質粒Pdnak-cobA的重組菌，維生素B12產量為75.5 mg/L，野生型菌株維生素B12產量為54.1 mg/L，明顯高于野生型菌株21.5 mg/L。

圖3 重組菌的酶標儀檢測結果和鏡檢結果

3 討論

核心啟動子是一個含有兩個保守序列即-35區和-10區的DNA序列，它是指一個RNA聚合酶全酶和轉錄起始點的結合位點［16］。按照控制轉錄水平的高低，啟動子可以分為強啟動子和弱啟動子；從啟動子誘導機制上分類，啟動子可以分為組成型啟動子、誘導型啟動子、時期特異性啟動子及自誘導啟動子［17］。通常，強組成型的啟動子可用于表達質粒載體的構建，以及在工程菌中代替目標基因自身的啟動子［18-20］。雖然使用在線預測軟件預測出了啟動子-35區和-10區的序列，但其表達強度仍然需要進一步的實驗驗證。為了確保啟動子強度檢測結果的準確性，本研究利用連續多功能酶標儀和熒光顯微鏡進行啟動子強度的檢測。

圖4 重組菌過表達cobA基因后生產維生素B12發酵產量

細菌的代謝改造是進一步提高菌株生產性能的關鍵，為篩選得到可用于脫氮假單胞菌中代謝工程改造高表達的啟動子，對脫氮假單胞菌中某些編碼熱激蛋白和分子伴侶基因前含啟動子在內的非編碼序列用啟動子在線預測軟件進行分析，利用GFP報告基因表達的熒光值來表征啟動子的表達強度，并挑選高表達的啟動子應用于提高脫氮假單胞菌中維生素B12合成途徑相關基因的表達水平，以實現提高VB12產量的目的。本研究篩選得到Pdnak、PhtpG和PdnaJ在內的不同強度的啟動子，使用GFP報告基因篩選得到高表達的啟動子Pdnak，以最大RFU/OD600的值為標準，重組菌Pdnak約為PhtpG、PdnaJ的1.5倍和 18倍，同時結合熒光顯微鏡檢測結果均可知其高表達強度得到驗證。并使用篩選的最強啟動子 Pdnak構建含維生素B12合成途徑關鍵基因 cobA 的過表達菌株，同時以野生型菌株為對照組。發酵結果表明，脫氮假單胞菌pBHR1-Pdnak-cobA的維生素B12產量比野生型菌株高21.5 mg/L，實現了維生素B12產量的提高，為今后脫氮假單胞菌工業化大規模生產維生素B12提供可能性。如果今后想進一步優化脫氮假單胞菌生產維生素B12的能力，可以考慮通過啟動子優化與酶的天然組合、過表達、支路途徑敲除、發酵條件優化［21］等手段進一步提高維生素B12的產量。

4 結論

本研究通過選取脫氮假單胞菌中某些編碼熱激蛋白和分子伴侶基因前含啟動子在內的非編碼序列，并與報告基因GFP相連，經酶標儀檢測GFP的熒光值，篩選得到高表達的啟動子Pdnak，構建了含啟動子Pdnak及cobA基因的過表達載體，并成功轉入生產維生素B12的脫氮假單胞菌中。根據發酵結果顯示維生素B12產量明顯提高，同時證明篩選強啟動子用于關鍵基因的過表達能有效提高菌株產量。

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（責任編輯 狄艷紅）

Enhanced Production of Vitamin B12by Screening the Promoter in Pseudomonas denitrificans

WANG Ling-ling1Xia Miao-miao2DONG Hui-na2ZHU Bei-wei1ZHANG Da-wei1，2
（1. Dalian Polytechnic University，Dalian 116034；2. Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308）

Vitamin B12（VB12/Cobalamin）possesses several physiological functions and is widely used in pharmaceutical and food industries. Pseudomonas denitrificans is commonly employed in the production of VB12. In order to improve the VB12productivity by a strain，the high-expression promoters were screened and then used to express the gene synthetizing VB12. Via online prediction software，analyzing the promoters in promoters-included non-coding sequences that precede the genes encoding heat shock protein and molecular chaperone in P. denitrification，the non-encoding sequences of PibpA，PcbpA，PdnaJ，PhtpG，Pdnak，and PgrpEwere selected and ligated to GFP report gene encoding green fluorescent protein. Then the GFP fluorescence signal value was detected by enzyme standard instrument，further for obtaining the promoters with high-expression，the expression levels of promoters in the non-coding sequences preceding the genes encoding heat shock protein and molecular chaperone were evaluated，which then was applied for the overexpression of genes in the VB12synthetic pathways . Fluorescence experimental results showed that the expression of GFP fluorescence value for the non-coding sequence with the promoter Pdnakwas the highest. Subsequently，the strongest Pdnakpromoter was selected to construct the recombinant P. denitrificans overexpressing gene cobA in VB12synthesis pathway，and the fermentation results revealed that the VB12yield increased by 21.5mg/L compared with the control strain. Conclusively，screening high-expression promoter for overexpressing the key gene in VB12synthesis pathway is an effective approach for improving VB12production.

Pseudomonas denitrificans；strong promoter；cobA；vitamin B12；Gibson assembly

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0010

2017-01-16

天津市自然科學基金（16JCYBJC23500，15JCQNJC09500）

王玲玲，女，碩士研究生，研究方向：微生物代謝；E-mail：wanglingling1122@126.com

張大偉，男，博士，研究員，研究方向：蛋白質合成細胞工廠與微生物代謝；E-mail：zhang_dw@tib.cas.cn