利用豆制品廢水發酵枯萎病拮抗菌Pb-4條件研究

郭珺 武愛蓮 閆敏 龐金梅 焦曉燕

（山西省農業科學院農業環境與資源研究所 土壤環境與養分資源山西省重點實驗室，太原 030031）

利用豆制品廢水發酵枯萎病拮抗菌Pb-4條件研究

郭珺 武愛蓮 閆敏 龐金梅 焦曉燕

（山西省農業科學院農業環境與資源研究所 土壤環境與養分資源山西省重點實驗室，太原 030031）

利用豆制品生產過程中的廢水（黃漿水）對枯萎病拮抗菌Pb-4菌株的發酵培養基及其發酵條件進行優化。通過單因素試驗篩選Pb-4菌株黃漿水培養基中的碳源；設置因素水平為L18（35）正交試驗，對Pb-4菌株黃漿水培養基中最佳碳源和無機鹽成分進行篩選和優化，確定發酵培養基配方；通過響應面優化試驗對Pb-4菌株的發酵溫度、pH和接種量進行優化。結果顯示，通過篩選確定玉米粉為黃漿水培養基的最佳碳源；優化后的發酵培養基配方為：1 000 mL黃漿水中添加玉米粉 30 g、（NH4）2SO42 g、MgSO41.5 g、CaCO31.5 g和FeSO40.3 g；優化后的發酵條件為：溫度 36.3℃、pH7.4、接種量 5%、搖瓶培養40 h。在此優化條件下，發酵菌數可達42.8×108CFU/mL、最大生物量OD660值為0.393，與預測理論最大值0.390 2相吻合。優化后的發酵培養基能夠替代蛋白胨、酵母粉和葡萄糖等常規培養基，具有簡單、廉價和環保等特點，可作為微生物菌劑規模化生產的原料。

黃漿水；解淀粉芽孢桿菌；番茄枯萎病菌；拮抗菌株；發酵條件優化

隨著設施農業的快速發展，連作及大量使用化肥農藥，使設施土壤養分失衡，土壤酸化，土傳病害頻繁發生，嚴重制約了設施生產的可持續發展［1］。目前，主要通過生物、農業和工程三種調控措施進行設施土壤的改良。在生物途徑中，有益微生物通過各種間接或直接的方式抑制植物病原菌繁殖，減輕土傳病害的發生，緩解連作障礙等設施土壤質量問題［2］。針對設施生產中土壤修復、植病防控已有多種應用微生物生產的制劑，如CN100999667公開了一種設施菜地土壤改良劑及其制備方法與應用，強調作為土壤改良劑，菌劑中菌種的配比和固體菌劑載體的配比，菌劑單獨發酵活菌數為1×108CFU/ mL［3］。CN101948771A公開了防病促生植物內生解淀粉芽孢桿菌及其應用，強調在牛肉膏、酵母膏和葡萄糖培養液中可獲得菌數（2-4）×108CFU/mL的發酵液，含2種抗菌物質，菌液稀釋50倍處理水稻種子，對水稻惡苗病溫室防效達到84.6%以上［4］。上述兩種制劑中，前者發酵液菌數偏低，用量和成本必然會加大；后者處理種子時使用的菌液濃度也較高，用量和成本也較高。如果能將發酵菌液的活菌數和活性提高，減少使用量，降低生產成本，將大大節約能源和資源，利國利民。

豆制品廢水（黃漿水）中富含氮、磷、鉀等營養成分，如不經處理直接排出，對環境具有潛在影響［5］。據調查，太原市年排黃漿水大約在4.3萬t以上，而每噸黃漿水如進行處理需投資3元左右（不包括排污工程和設備投資）。目前，國內相關發明專利提到黃漿水主要應用于生產飼料、飲料、白酒、醬油、維生素B12、酒精、乳酸、谷氨酸、核黃素和蝦青素等領域，發酵用菌株有乳酸菌、酵母菌和白地霉等。如CN200610045614.7公開了利用黃漿水培養富含蝦青素的紅發夫酵母的方法，利用獲得的細胞及從中提取的蝦青素制備飼料添加劑［6］。因此，有效利用黃漿水中的營養成分生產微生物菌劑，既可降低菌劑生產成本，又是解決廢水再利用的一項既經濟又環保的措施。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）屬芽孢桿菌屬，是一種與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）親緣性較高的細菌。其作為植物根際有益微生物，通過分泌拮抗物質和營養競爭，在促進植物生長、防治病害方面發揮著多種有益的作用［7-9］。大量研究表明，一些芽孢桿菌可以產生對植物病原真菌有抑制作用的抗菌物質，主要包括低分子量的抗生素如肽類、脂肽類、細菌素以及高分子量蛋白質類抗菌物質等［7，10-12］，具有的廣譜抗菌功能，為其在農業上的應用提供了巨大的可能。目前對解淀粉芽孢桿菌的發酵條件優化的研究很多［8-13］，而本研究旨在利用黃漿水，對一株具有促生抑菌功能的解淀粉芽孢桿菌Pb-4的發酵條件進行優化，為今后該解淀粉芽孢桿菌的工業化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 Pb-4菌株：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）由本課題組前期篩選對番茄枯萎病菌具有較好抑制效果，于營養瓊脂（NA）培養基斜面保存。fq菌株：番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersiici）由本課題組分離自日光溫室自然發病株，于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基斜面保存。

1.1.2 制備培養基試劑與材料 蛋白胨，酵母粉，葡萄糖，黃漿水，玉米粉等。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 將保存的Pb-4菌株斜面接種于種子培養基（0.5% 蛋白胨，0.5% 酵母粉，1.5%葡萄糖，pH 7.0-7.2）中，180 r/min、28℃ 搖床培養24 h，備用。

1.2.2 供試黃漿水化學特性 實驗選用工藝穩定的山西老字號“六味齋”豆制品加工廠的黃漿水，經15 min煮沸、八層紗布過濾后，相關成分與1.2.1中種子培養基進行比較，結果見表1。N含量采用全自動凱氏定氮儀測定；P含量采用釩鉬黃法紫外分光光度計測定；K含量采用火焰光度計測定［14］。

表1 黃漿水與種子培養基成分比較（mg·L-1）

從表1中可以看出，黃漿水與細菌基礎培養基的成分比較接近，可以作為解淀粉芽孢桿菌Pb-4液體發酵的水相，可不添加氮（N）、磷（P）、鉀（K），需調節pH值，添加適量的碳源和無機鹽。

1.2.3 黃漿水發酵培養基組分的單因素篩選 將黃漿水煮沸后過濾，去除濾渣，分別加入1.5%的不同碳源（葡萄糖、蔗糖、白砂糖、麥芽糖、玉米粉），分裝后1×105Pa滅菌20 min，備用。初始培養條件為：pH 7.0，250 mL三角瓶中的裝液量為100 mL，接種量3%，于180 r/min、28℃條件下搖瓶培養48 h。以不添加碳源的黃漿水作對照，測定培養24 h和48 h時添加不同碳源處理Pb-4 菌株活菌數，并檢測抑菌活性。在滅菌后的培養皿中加入1 mL fq菌液，隨后將冷卻至約45℃熔融態的PDA固體培養基倒入平板，搖勻，待凝固后，用濾紙片蘸取不同碳源培養的Pb-4菌液20 μL，以對角線方向貼于含fq菌液的PDA平板上，同時將蘸有無菌培養液的濾紙片貼于平板中心作為對照CK，28℃培養。觀察并記錄抑菌圈直徑，檢測不同碳源培養的Pb-4對fq的抑菌活性［15，16］。每個處理重復 3 次。從而篩選最佳碳源。

1.2.4 芽孢產生時間測定 活化Pb-4 菌株，按3%接種量接種于最佳碳源黃漿水液體培養基中，28℃振蕩培養，從24 h開始，每2 h取菌液涂片進行芽孢染色，觀察芽孢生成情況，計數每個視野中無芽孢菌體數、有芽孢菌體數、離體芽孢數［17］，每次4個重復。

1.2.5 黃漿水培養液中無機鹽成分優化選擇 為了進一步優化提高培養物的效價，設置因素水平為L18（35）正交試驗，對黃漿水培養液中最佳碳源用量和無機鹽添加比例進行優化［18］。正交實驗各因素及水平見表 2。

表2 正交試驗因素水平設置

1.2.6 菌體生長量的測定 以660 nm菌液的吸光度（OD660）表示菌體的生物量。菌液10 000 r/min離心10 min，取上清，以不接種的培養基作對照，在1 cm比色杯中于分光光度計上測定OD660。

1.2.7 響應面優化試驗 利用1.2.5中的最佳培養基，根據Box-Benhnken設計原理，設置3因素3水平的響應面分析試驗。以培養溫度、pH和接種量為自變量，以菌體生物量為響應值進行培養條件的響應面優化試驗［19、20］。

1.2.8 驗證試驗 利用1.2.5中的最佳培養基和1.2.7優化的最佳培養條件進行驗證試驗，確定最終優化結果。

1.2.9 數據處理 用Design-Expert分析軟件進行多元二次回歸模型方程的建立，并作出響應面圖，進一步通過數據優化程序，求得當響應面值最大時，培養條件各因素的最優水平。

2 結果

2.1 黃漿水中添加不同碳源對Pb-4抑菌活性、活菌數和芽孢形成的影響

在黃漿水中分別添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、白砂糖和玉米粉5種不同碳源，測定活菌數，并檢測抑菌效果，結果見表3。與其它碳水化合物相比，添加玉米粉不僅菌數多，抑菌效果好，芽孢形成率也較高，說明玉米粉中所含有的其它營養物質，有利于Pb-4菌株的快速繁殖與生長。為此，在黃漿水液體培養基中選擇玉米粉為最佳碳源。

表3 不同碳源對Pb-4發酵的影響

2.2 Pb-4菌芽孢的產生時間確定

由于芽孢生成量決定產品的最終質量，因此利用黃漿水玉米粉培養基對Pb-4菌培養時間與芽孢生成的關系進行了研究。結果見圖1。Pb-4菌搖瓶培養30 h時芽孢開始生成，40 h時含芽孢菌體達到最多，之后隨著芽孢的脫落，離體芽孢數逐漸增加，54 h后沒有芽孢菌體存在。

2.3 黃漿水玉米粉培養液中無機鹽成分優化選擇

為了進一步優化提高培養物的效價，設置了因素水平為L18（35）正交試驗（表2），對黃漿水玉米粉培養液中玉米粉及無機鹽成分進行優化，確定液體培養基配方，結果見表4、表5。優化后的Pb-4菌培養基組成：1 000 mL黃漿水中添加玉米粉30 g、（NH4）2SO42 g、MgSO41.5 g、CaCO31.5 g和FeSO40.3 g。發酵菌數可達38.4×108CFU/mL。

2.4 響應面優化試驗

根據Box-Benhnken設計原理，設置3因素3水平的響應面分析試驗。以培養溫度、pH和接種量為自變量，以菌體生物量為響應值進行響應面試驗。選擇培養基pH為7.0±5，培養溫度（35±5）℃、接種量（5±2）%和菌株生物量（OD660）進行響應面實驗設計優化，見表6；測定數據見表7。

圖1 黃漿水玉米粉培養基對Pb-4菌芽孢生成的影響

表4 培養基配方正交試驗結果

表5 正交試驗方差分析結果

表6 響應面設計因素與水平

表7 Box-Benhnken響應面實驗設計及結果

對實驗結果進行分析，得到三元二次回歸方程如下：Y=0.17237-0.00433A-0.01028B-0.0387C-0.021 86A2-0.03219B2-0.02981C2-0.00041AB -0.00011AC-0.00108BC。對結果進行方差分析，見表 8 所示。繪制響應面曲線見圖2。

通過解析分析，由RSM預測Pb-4菌株最佳培養條件為：溫度 36.29℃；pH 7.38；接種量 5%時，其理論最大生物量OD660值為0.3902。

表8 Box-Behnken 響應面實驗方差分析結果

2.5 驗證結果

利用2.3中的最佳培養基配方和2.4中的最佳培養條件，進行了5次搖瓶培養實驗，測定OD660平均值為0.393±0.008 7，說明在精確操作的條件下，該實驗條件具有較好的重復性，與預測的理論最大生物量相吻合，同時測定了發酵菌數平均值為（42.8±0.2）×108CFU/mL，確定解淀粉芽孢桿菌Pb-4菌株優化后的發酵培養基配方為：1 000 mL黃漿水中添加玉米粉 30 g、（NH4）2SO42 g、MgSO41.5 g、CaCO31.5 g和FeSO40.3 g；優化后的發酵條件為：溫度 36.3℃、pH7.4、接種量 5%、搖瓶培養40 h。

3 討論

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種具有廣譜抑菌活性的細菌，能抑制尖孢鐮刀菌等多種植物病原真菌［11］。因此，在防治病原菌的微生物菌劑的研制方面，研究人員對解淀粉芽孢桿菌的研究越來越多。為了更好產業化發展，首先要對菌株的發酵條件進行研究。權春善等［11］確定解淀粉芽孢桿菌的培養條件為：以葡萄糖、NH4Cl、MgCl2、牛肉膏為培養基，最適培養 pH 值為 6.0、溫度為33℃；李娟等［13］確定解淀粉芽孢桿菌的培養條件為：以馬鈴薯、蔗糖、黃豆粉、MgCl2為培養基，發酵條件為溫度 30℃、初始 pH 5；劉京蘭等［15］確定解淀粉芽孢桿菌的培養條件為：以可溶性淀粉、胰蛋白胨、酵母粉、NaCl 為培養基，最佳培養條件：pH 6.0、28℃；梁昌聰等［20］確定解淀粉芽孢桿菌的培養條件為：以蔗糖、尿素、豆粕和多種無機鹽為培養基。上述研究結果表明不同菌株的最佳發酵條件不同，且解淀粉芽孢桿菌可利用各種不同的培養成分生長，但利用黃漿水發酵解淀粉芽孢桿菌的研究還未見報道。

本課題組的相關研究表明，解淀粉芽孢桿菌Pb-4菌株可以在土壤和植物體內定殖；其發酵液對多種植物土傳真菌性病害具有良好的防控效果和明顯的促生長作用［7］。Pb-4菌株發酵液的生產將廢棄物資源化利用，施用后可減少或替代化學農藥的使用，安全無毒，屬環境友好型制劑，符合生態農業和可持續農業發展的需求。下一步將繼續利用5 L全自動發酵罐進行發酵模擬實驗，對解淀粉芽孢桿菌Pb-4菌的發酵條件進行進一步的優化，并在1 t發酵罐中進行小試，以期早日實現產業化。

圖2 A（培養溫度）、B（pH）、C（接種量）交互響應曲面圖

4 結論

本文通過系統研究，了解掌握了利用豆制品黃漿水添加玉米粉，培養解淀粉芽孢桿菌Pb-4菌的優化培養基配方和發酵條件，優化后的發酵培養基配方：1 000 mL黃漿水中添加玉米粉 30 g、（NH4）2SO42 g、MgSO41.5 g、CaCO31.5 g和FeSO40.3 g；優化后的發酵條件為：溫度 36.3℃、pH 7.4、接種量 5%、搖瓶培養40 h，理論最大生物量OD660值為0.390 2，實測OD660值為0.393，發酵菌數可達42.8×108CFU/mL。優化的培養基的獨到之處是替代了蛋白胨、酵母粉、葡萄糖等常規培養基；其工藝簡單、廉價、環保，具有較好的應用前景。

［1］張乃明, 常曉冰, 秦太峰. 設施農業土壤特性與改良［M］. 北京：化學工業出版社, 2008.

［2］史靜, 張乃明, 包立. 我國設施農業土壤質量退化特征與調控研究進展［J］. 中國生態農業學報, 2013, 21（7）：787-794.

［3］劉兆輝. 一種設施菜地土壤改良劑及其制備方法與應用：中國, 200710013116. 9［P］. 2009-01-07.

［4］張淑梅. 防病促生植物內生解淀粉芽孢桿菌及其應用：中國, 201010264520. 5［P］. 2012-05-09.

［5］ 王洪波, 曹龍奎. 豆制品加工中黃漿水無害化處理技術研究［J］.農產品加工, 2007, 9（6）：33-35.

［6］孫玉梅. 利用黃漿水培養富含蝦青素的紅發夫酵母的方法：中國, 200610045614. 7［P］. 2008-05-07.

［7］郭珺, 武愛蓮, 閆敏, 等. 芽孢桿菌-菌株鑒定及其抑菌活性的研究［J］. 華北農學報, 2016, 24（2）：224-228.

［8］ 任爭光, 張志勇, 李丹, 等. 芽孢桿菌-產抗菌物質發酵條件初探［J］. 中國農學通報, 2007, 23（5）：321-325.

［9］ 魏紅, 劉素花, 宋慶豐, 等. 解淀粉芽孢桿菌產抗菌物質發酵工藝研究［J］. 中國農學通報, 2009, 25（11）：151-155.

［10］ 葉云峰, 黎起秦, 袁高慶. 枯草芽孢桿菌菌株高產抗菌物質的培養基及發酵條件優化［J］. 微生物學通報, 2011, 38（9）：1339-1346.

［11］ 權春善, 王軍華, 徐洪濤, 等. 一株抗真菌解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其發酵條件的初步研究［J］. 微生物學報, 2006, 46（1）：7-12.

［12］ 吳艷, 陶晶, 趙思峰, 等. 芽孢桿菌組合-發酵條件優化及其效能研究［J］. 農業工程學報, 2008, 24（7）：204-208.

［13］ 李娟, 夏凱麗, 王遠宏, 等. 解淀粉芽孢桿菌-搖瓶發酵條件優化［J］. 生物技術通報, 2015, 31（12）：214-220.

［14］ 鮑士旦. 土壤農化分析［M］//第3版. 北京：中國農業出版社, 2000：30-171.

［15］劉京蘭, 薛雅蓉, 劉常宏. 內生解淀粉芽孢桿菌產 搖瓶發酵條件優化［J］. 微生物學通報, 2014, 41（1）：75-82.

［16］黃明媛, 顧文杰, 張發寶. 番茄青枯病拮抗菌篩選鑒定及其發酵條件初探［J］. 微生物學通報, 2011, 38（2）：214-220.

［17］Hoben HJ, Somasegaran P. Comparison of the pour, spread, and drop plate methods for enumeration of Rhizobium spp. in inoculants made from Presterilized peat［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1982, 44（5）：1246-1247.

［18］趙帥, 田長彥, 史應武, 等. 黃瓜枯萎病生防菌-產抗菌物質條件的優化及抑菌作用初探［J］. 微生物學通報, 2013, 40（5）：802-811.

［19］楊實權, 張喜成, 劉軍鋒, 等. 響應面法優化釀酒酵母產油脂條件［J］. 微生物學通報, 2010, 34（1）：91-95.

［20］梁昌聰, 郭立佳, 劉磊, 等. 響應面法優化解淀粉芽孢桿菌發酵培養基［J］. 生物技術通報, 2014, 30（8）：169-174.

（責任編輯 狄艷紅）

Fermentation Conditions of Antagonistic Bacterium Pb-4 Against Fusarium Wilt Using Soybean Processing Wastewater

GUO Jun WU Ai-lian YAN Min PANG Jin-mei JIAO Xiao-yan
（Institute of Agricultural Environment & Resources，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Soil Environment & Nutrient Resources of Shanxi Province，Taiyuan 030031）

The wastewater from soybean processing（yellow serofluid）was used to optimize the fermentation medium condition of antagonistic bacterium Pb-4 against fusarium wilt. The single factor experiments were conducted to screen the carbon source of Pb-4 strain in yellow serofluid medium. Orthogonal experiments L18（35）were designed to select the optimal carbon source and inorganic components for Pb-4 strain in yellow serofluid medium，and determine the optimal fermentation medium formulation. The fermentation temperature，pH and inoculation amount of Pb-4 strain were optimized by response surface method（RSM）. As results，the composition of the optimal medium was yellow serofluid 1 000 mL，corn flour as the optimal carbon source 30 g，（NH4）2SO42 g，MgSO41.5 g，CaCO31.5 g and FeSO40.3 g. The fermentation conditions after optimization were as：temperature 36.3℃，inoculum size 5%，pH 7.4 and incubation time 40 h. Under the optimized conditions，the number of fermented bacteria was up to 42.8×108CFU/mL，and the maximum biomass OD660was 0.393，which was in accord with the predicted value 0.390. In conclusion，the optimized medium can be as an effective substitute for traditional medium like peptone，yeast powder，glucose，etc.，moreover as it is simple，cost-efficient and environmentally friendly，thus it can be used as raw material for the scale production of microbial agents.

yellow serofluid；Bacillus amyloliquefaciens；Fusarium oxysporum f. sp. lycopersiici；antagonistic bacteria；fermentation condition optimization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0159

2017-03-03

山西省煤基重點科技攻關項目（FT201402-15），山西省專利推廣實施資助專項（20161016）

郭珺，女，碩士，副研究員，研究方向：農業微生物資源利用；E-mail：13935163790@163.com