蘇云金芽胞桿菌—開放的基因組與多種功能

王 奎, 束長龍, 李一梅, 張 杰*

(1. 中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193; 2. 東北農業大學生命科學學院, 哈爾濱 150030)

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蘇云金芽胞桿菌—開放的基因組與多種功能

王 奎1,2, 束長龍1, 李一梅1, 張 杰1*

(1. 中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193; 2. 東北農業大學生命科學學院, 哈爾濱 150030)

蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)作為微生物殺蟲劑,被廣泛應用于農業、林業和衛生害蟲的防治;而利用Bt殺蟲基因研制的轉基因植物,也在全球植物害蟲防治中發揮了重要作用。近年來,隨著科學技術的發展與社會需求的拓展,Bt新的功能被不斷發掘出來。這些新的功能包括抗線蟲、抗病殺菌、促進植物生長、環境修復等。本文從Bt的泛基因組結構及其遺傳學特性分析入手,在詳細介紹了近來Bt殺蟲基因發掘進展的同時,分析了泛基因組與Bt新的功能之間可能存在的關系,旨在為我國Bt資源的研究與應用提供參考。

蘇云金芽胞桿菌; 泛基因組; 殺蟲基因; 抗菌作用; 促進植物生長; 環境修復

蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)是革蘭氏陽性的昆蟲病原細菌[1],可產生芽胞及多種殺蟲活性物質,在害蟲防治方面的研究與應用一直是人們關注的熱點。其產生的殺蟲蛋白對多種昆蟲都具有殺蟲活性,例如鱗翅目、鞘翅目、雙翅目昆蟲[2-4]等。目前,Bt不僅作為微生物殺蟲劑被廣泛開發應用,其編碼的殺蟲蛋白基因還被成功地用作轉基因抗蟲植物開發[5-7],在蟲害控制中發揮了巨大作用。因此,分離與鑒定Bt菌株是當前害蟲防治領域的一項重要工作[8-9]。

隨著研究的深入,除了殺蟲活性之外,Bt的多種新功能特性也逐漸被關注和發現。這些新功能包括對植物和動物致病微生物的拮抗作用[10]、合成納米殺蟲材料[11]、抗癌細胞活性[12-13]、促植物生長活性[14]以及重金屬和其他化學品污染的生物修復[15]等,雖然Bt的新功能研究起步較晚,相對較弱,但已經展示了良好的前景。本文結合比較基因組數據,探討Bt功能性的遺傳學基礎對基因組結構、Bt殺蟲蛋白以及近期探索的Bt的多種新功能的影響,旨在多角度對Bt及其潛在應用前景進行綜述分析,為國內學者的科研與生產實踐提供參考。

1 Bt具有開放型的泛基因組結構

新一代測序和組學技術,包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學的發展加深了我們對芽胞桿菌種群以及不同Bt亞種和菌株之間基因組多樣性的認識與理解。到目前為止,GenBank中已登錄了87個Bt菌株(包括35個完成基因組和52個草圖基因組)的全部和部分基因組序列。

“泛基因組”(pan-genome) 是2005年Tettelin等人首次提出的可以用來描述菌株特征的概念,表示一個物種全部的基因組成,主要由三部分組成:核心基因(core gene)、非必需基因(dispensable gene)以及菌株特有基因(strain-specific gene)[16]。根據物種的泛基因組大小與菌株數目的關系,將物種的泛基因組分為開放型泛基因組(open)和閉合型泛基因組(close)。開放型泛基因組是指,隨著測序的基因組數目的增加,物種的泛基因組大小也不斷增加。閉合型的泛基因組是指,隨著測序的基因組數目增加,物種的泛基因組大小增加到一定程度后不再增加[17]。

為了探索Bt的泛基因組特征,我們利用泛基因組自動化分析軟件(pan-genome analysis pipeline,PGAP)[18]對NCBI中已有基因組完成圖數據的14株Bt菌株的染色體和質粒分別進行泛基因組分析。通過GF(gene family)方法對這14株Bt菌株染色體上的76 480個功能基因進行鑒定,結果顯示共鑒定出了10 498個基因家族,圖1為不同保守程度的基因家族數量的比較結果,其中,特有基因家族共4 097個(圖1,黃色圖柱),占總基因家族數量的39.06%;菌株核心基因家族共3 114個(圖1,紅色圖柱),占總基因家族數量的29.66%;非必需基因家族共3 287個(圖1,綠色圖柱),占總基因家族數量的31.31%。菌株特有基因通常是細菌進化過程中新產生的基因,而從圖1中可以看出,Bt染色體基因組中特有基因所占比例最高。

進一步利用泛基因組數據分析軟件(Pan-Genome Profile Analyze Tool,PanGP)分析泛基因組大小與菌株數目之間的關系。圖2分別是14株Bt菌株質粒和染色體的泛基因組特征圖。

圖1 不同保守程度家族數量比較Fig.1 The comparison of the numbers of gene families with different conservation levels

由于質粒被認為是細菌外源基因的重要來源,首先利用PanGP軟件對質粒泛基因組及核心基因組大小與被測基因組數目的關系曲線進行非線性擬合分析(圖2a),得到泛基因組大小與被測基因組數目的函數關系式為y=816.2x0.71-283.36(y表示質粒的泛基因組大小,x表示被測基因組數目),表明隨著被測基因組數目的不斷增加,泛基因組大小基本呈現線性增加的狀態。而核心基因組大小與基因組數目的函數關系式為y=5 303.03e-2.26x+0.94(y表示質粒的核心基因組大小,x表示被測基因組數目),根據擬合的關系式發現,質粒上幾乎不存在核心基因組。

染色體是細菌的主要遺傳物質,進一步對Bt染色體上泛基因組及核心基因組大小與被測基因組數目的關系曲線進行非線性擬合分析(圖2b),得到泛基因組大小與被測基因組數目的函數關系式是y=1 802.16x0.52+3 229.48(y表示染色體的泛基因組大小,x表示被測基因組數目),表明隨著被測基因組數目的不斷增加,泛基因組大小基本呈現線性增加的狀態。而核心基因組大小與基因組數目的函數關系式為y=2 487.19e-0.4x+3 213.38(y表示染色體的核心基因組大小,x表示被測基因組數目),根據擬合的關系式發現,當被測菌株數目不斷增加時,染色體上核心基因組數目會最終基本穩定在3 213個左右,鑒于Bt質粒上幾乎不存在核心基因(圖2a),說明Bt菌株共同包含的核心基因數目在3 213個左右。

綜上所述,Bt的質粒和染色體基因組均不保守,具有開放性,而正是質粒和染色體的這種開放性引起了Bt菌株的功能多樣性。目前研究主要集中在Bt殺蟲相關的功能方面,而其他功能研究較少。泛基因組相關研究的結果顯示了Bt在其他方面的潛能,因此進一步深入挖掘Bt新的功能,對充分發掘和利用Bt菌株資源具有重要的意義。

圖2 14株Bt菌株質粒和染色體的泛基因組特征圖Fig.2 Pan-genome analysis of plasmid and chromosome genes of 14 Bt strains

2 Bt抗蟲功能的研究與應用

2.1 Bt殺蟲基因

作為昆蟲病原微生物,Bt的主要殺蟲物質是在芽胞形成階段產生的伴胞晶體,也稱為δ-內毒素或殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs),分為兩個家族:Cry和Cyt蛋白[19]。另一類殺蟲蛋白是在Bt營養生長期分泌的(vegetative insecticidal proteins,Vip)[20]。Crickmore等提出以殺蟲蛋白編碼的氨基酸序列相似性為規則對發現的各類殺蟲蛋白進行命名(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)[21]。目前的命名規則將Cry蛋白分為4個等級,分別以45%、78%和95%的氨基酸序列一致性為分界。根據這個數據庫最新更新的數據(2017年5月),目前在全球不同地區分離得到的Bt菌株中識別并命名的殺蟲蛋白基因有975個,包括789個cry基因(cry1～cry74),38個cyt基因(cyt1～cyt3),以及142個vip基因(vip1～vip4)。

目前發現 Bt菌株對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等害蟲,甚至螨蟲和線蟲都具有毒殺活性[22-23]。這些殺蟲活性是由殺蟲蛋白決定的。不同殺蟲蛋白的殺蟲譜不同,例如Cry1蛋白家族分為14個亞族(Cry1A～N),包括280個蛋白,其中大部分對鱗翅目昆蟲有活性[2,24],來自該家族的Cry1B和Cry1I蛋白也對鞘翅目昆蟲有活性[25];Cry2蛋白家族分為2個亞族,包括85個蛋白,其中大部分對鱗翅目或雙翅目有活性[3-4];Cry3蛋白家族分為3個亞族,包含19個蛋白,其中大部分對鞘翅目昆蟲有活性[26]。此外,在過去20年間,有研究發現有一些Cry蛋白,例如Cry5、Cry6、Cry12、Cry13、Cry14、Cry21和Cry55會對植物和動物線蟲有活性[27-28]。目前已經發現的38個不同的Cyt蛋白的活性主要針對雙翅目昆蟲,尤其是蚊子和蚋[29-30]。Vip1和Vip2活性主要針對某些鞘翅目昆蟲[31-32],以及半翅目刺吸害蟲棉蚜Aphisgossypii[33]。而Vip3主要對鱗翅目有活性[34]。此外,還有一類分泌期殺蟲蛋白(secreted insecticidal protein,Sip)對某些鞘翅目昆蟲有活性[35-36]。并且有部分Cry蛋白,也稱抗癌晶體蛋白(parasporin,PS),具有特異地殺滅癌細胞的活性,在抗腫瘤方面表現出一定的潛力[12-13]。

目前,針對半翅目刺吸式昆蟲的殺蟲基因的篩選與克隆是殺蟲基因研究的熱點,目前研究人員已經證實了Cry15與Cry51類蛋白對盲蝽的殺蟲活性[37-38],中國農業科學院植物保護研究所也篩選到對稻飛虱具有高活性的殺蟲蛋白[39],相關研究對進一步篩選出對刺吸式害蟲有效的Bt殺蟲蛋白具有重要的指導意義。

2.2 Bt的殺線蟲功能

迄今已有多項研究測試了Bt菌株對多種不同線蟲的活性,包括自由生活線蟲(Caenorhabditiselegans)[40-41];動物寄生線蟲(Ascarissuum、Haemonchuscontortus、Trichostrongyluscolubriformis和Ostertagiacircumcincta)[27,42];植物寄生線蟲(北方根結線蟲Meloidogynehapla)[43-44]等。研究發現,有些Bt菌株可以感染線蟲的消化系統,并且萌發和增殖[28]。此外,Bt產生的一些其他物質,如蘇云金素[45],幾丁質酶[46],金屬蛋白酶[22],羊毛硫抗生素、腸毒素、溶血素以及一些由轉錄調節因子PlcR控制的蛋白酶等[28,47]也具有殺線蟲活性。

在大多數對線蟲高效Bt菌株報道中,對線蟲表現出殺蟲效果的Cry蛋白/芽胞的濃度均較低,這為將來Bt菌株應用為生物殺線蟲劑帶來了希望。然而,目前世界上還沒有商業化的Bt殺線蟲劑。Bt殺線蟲產品劑型和使用技術的探索將是研究熱點之一,這將為實現殺線蟲Bt產品的登記和商業化奠定基礎。

2.3 轉基因抗蟲作物

由于轉基因作物在社會經濟和生態環境方面的優勢,在過去20年間,全球轉基因作物的種植面積大幅增加,在2016年已達到1.851億hm2[7]。其中抗除草劑和抗蟲是應用最為廣泛的兩大性狀,而抗蟲性狀的基因來源主要是Bt殺蟲基因。2016年,Bt轉基因作物的全球種植面積約為9 850萬hm2(7 540萬hm2重組Bt /抗除草劑作物和2 310萬hm2Bt轉基因作物),這些Bt轉基因作物中包含一種或多種不同的抗鱗翅目和/或鞘翅目害蟲的cry基因[7]。

自1996年以來,共有289種Bt轉基因作物品系被批準用于商業化種植(ISAAA’s GM Approval Database 2017)。常用到的基因包括cry1A、cry1Ab、cry1A.105、cry1Ab-Ac、cry1Ac、cry1F、cry2Ab、cry1C、cry9C、cry2Ae、vip3A、cry3A、cry3Bb1、cry34Ab1和cry35Ab1這15種,其中cry1Ab、cry1F、cry2Ab、cry3A和cry34Ab1-cry35Ab1是最常用到的基因。有些Bt轉基因作物中會包含多個cry或vip基因(2個或3個),這種基因疊加的方法可以延遲害蟲對Bt轉基因作物的抗性,這其中還有一些品系可以同時抗鱗翅目和鞘翅目害蟲。

2.4 利用Bt合成殺蟲納米材料

金屬納米粒子(metal nanoparticals, NPs)由于其高級的理化特性及其在不同行業中的廣泛應用而引起人們的深切關注。NPs可以通過各種生物系統,例如細菌、真菌、植物提取物和其他生物產品進行綠色合成[48]。這種利用微生物合成的NPs具有顯著的優點,如清潔、無毒、環保等。

而近來的一些研究也已經證明Bt菌株具有產NPs的能力,如銀[49]和鈷[50]。2010年,Jain等首次報道了通過Bt胞晶混合物合成銀納米粒子的研究,顯示出合成的高效性和綠色無污染的優勢[49]。其合成的銀納米粒子平均粒徑約為15 nm,具有混合(立方和六邊形)結構,對多種多抗藥性的人類病原菌具有高毒性,包括大腸桿菌Escherichiacoli、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus。由于部分細菌含有將金屬離子還原成納米粒子的還原酶,人們推測Bt菌株可能也含有用于納米粒子生物合成的還原酶。隨后,Marimuthu等成功使用一株Bt菌株合成了鈷納米粒子,并探索了該合成產物對害蟲的殺蟲活性,例如,該鈷納米粒子對瘧疾媒介亞相按蚊Anophelessubpictus和登革熱媒介埃及伊蚊Aedesaegypti(雙翅目:蚊科)幼蟲具有高活性,LC50值分別為3.59 mg/L 和2.87 mg/L[50]。

Bt合成的NPs及其在殺蟲活性方面的效果,為進一步提高Bt殺蟲劑的功效提供了新的思路,進一步的研究工作可圍繞NPs的合成工藝、成本及其對環境的影響方面開展。

3 Bt抗病功能的研究與應用

3.1 Bt的抗真菌功能

真菌是引起植物病害的一類重要病原物,會對農業生產造成巨大損失。目前,生物防治中通常是使用各種微生物合成的抗真菌化合物,例如抗生素、脂肽、鐵載體、揮發性有機化合物、次級代謝產物和細胞壁降解酶等來控制真菌。

幾丁質酶被認為是Bt菌株中檢測到的最重要的抗真菌活性成分之一。盧偉等對995株Bt菌株的幾丁質酶及其基因的檢測結果證明幾丁質酶普遍存在于Bt菌株中,同時篩選出了19株對小麥赤霉病菌效果較好的Bt菌株[51]。此后多項研究發現產幾丁質酶的Bt菌株對多種真菌具有高活性,例如引起萵苣滴蟲病的小核盤菌Sclerotiniaminor和核盤菌S.sclerotiorum[52],輪枝鐮孢菌Fusariumverticillioides等[53]。

Bt還可以通過產生豐原素類環脂肽和揮發性化合物發揮抑菌功能。Bt-CMB26菌株中純化出的一種脂肽對植物病原真菌膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides、大腸桿菌E.coli和卷心菜粉蝶(紋白蝶Pierisrapaecrucivora)具有有效的活性[54]。而Bt-TB72菌株產生的揮發性化合物(包括2-壬酮、β-苯乙胺、2-癸酮和百里酚等)不僅可以分別抑制膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides菌絲在PDA平板上的生長,還可以抑制對芒果的感染[55]。此外,Bt可以通過誘導植物系統抗性的方式提高植物的抗真菌能力,例如,Bt-199菌株可以通過增加植物總酚(1.7倍)和防御相關酶,包括多酚氧化酶(1.3倍)、苯丙氨酸裂解酶(1.8倍)和過氧物酶(1.4倍)的含量,誘導番茄對尖孢鐮刀菌F.oxysporum產生抗性[10]。

在目前Bt的應用中,抗真菌的能力沒有得到重視,相關產品也未見報道,Bt在抗真菌方面的應用潛力值得關注。

3.2 Bt的抗細菌功能

病原細菌可以引起動植物病害,影響人類的生產生活。有研究發現Bt可以通過降解N-酰基高絲氨酸內酯(AHL)來干擾細菌群體感應的信號[56]或以產生細菌素[57]的方式發揮抑菌活性。因此,抗細菌活性物質是Bt的又一重要資源。

Bt菌株產生的AHL降解酶(AiiA)可以抑制植物病原細菌的活性,例如歐文氏桿菌Erwiniacarotovora[56],進一步研究表明AiiA的抑菌活性是通過群體感應信號猝滅來實現的[58]。在應用研究上,Bt(營養細胞)與其他細菌(檸檬酸農桿菌Citrobacterfarmer和阿維鏈霉菌Streptomycesavermectinius)或真菌(宛氏擬青霉菌Paecilomycesvariotii、木霉TPJS-1TrichodermaparareeseiTPJ-S-1和綠色木霉TVJ-S-1T.virideTVJ-S-1)拮抗劑的混合使用能夠顯著提高它們對納加辣椒[59]、番茄[60]和桉樹[61]中青枯菌Ralstoniasolanacearum的活性。

細菌素是在穩定期通過核糖體合成的分子量在3～12 kDa之間的小型耐熱抗菌肽,它們主要影響其他細菌的生長和(或)活力[62]。Bt產生的細菌素對不同植物病原細菌具有抑菌活性,例如灰霉菌Botrytiscinerea[57]等。此外,部分學者的研究結果表明Bt產生的細菌素可能成為人或動物病原菌的抗生素替代品與安全的食品防腐劑[62-63]。

4 Bt促進植物生長與環境修復功能

4.1 Bt的促生長功能

通常,對植物生長和發育具有有益影響的細菌被稱為植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)[64]。有些Bt菌株能夠在植物根系定殖,并在非生物脅迫條件下產生一些促進植物生長的代謝物,包括ACC脫氨酶、吲哚-3-乙酸(IAA)、脯氨酸和磷酸溶解酶等。目前研究結果顯示Bt具有多種不同的促植物生長的機制,在農業生產中這些Bt菌株可以作為生物肥料單獨使用或與其他微生物群體混合使用[65]。

Bai等證實當Bt-NEB17菌株與慢生型大豆根瘤菌Bradyrhizobiumjaponicum共同接種到大豆植株后,能顯著提高大豆的結瘤數、生長速率和產量[66]。Mishra等證實與單獨接種豆科根瘤菌-PR1Rhizobiumleguminosarum-PR1相比,其與產吲哚-3-乙酸(IAA)的Bt-KR1菌株的共接種可以顯著促進紅豌豆和小扁豆的生長[64]。

Armada等研究表明,當Bt單獨使用或與叢枝菌根真菌(AMF)混合使用時,可顯著提高苗的生長速度、生物量(超過20%)以及植物芽中的微量營養元素的含量,還可以通過增加抗氧化酶(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶)的活性和降低植物脂質(丙二醛)的氧化性損傷來顯著降低氧化脅迫[65]。此外,Bt和AMF的混合使用還可以通過增加營養物質含量和相對含水量,以及降低氣孔導度、電解質滲出率、脯氨酸含量和抗壞血酸過氧化物酶的活性,從而顯著提高干旱條件下白車軸草Trifoliumrepens緩解水分脅迫的能力[67]。Bt細菌素對Bt的促生長也很重要,在水分脅迫條件下,細菌素thuricin-17與B.japonicum-SB1的共使用可以顯著提高植物生物量(17%)、根系生物量(37%)、根瘤生物量(55%)、根脫落酸含量(30%)和總氮量(17%)[14]。

上述研究結果顯示Bt具有作為微生物肥料的巨大應用潛力,然而,目前在生物肥料市場上也沒有商品化的Bt微生物肥料。與其他微生物肥料相比,Bt不僅促進植物生長,而且可以對土壤中線蟲及地下害蟲具有殺滅活性,具有多重功效,因此進一步探索Bt微生物肥料的應用對目前國家倡導的“減肥、減藥”具有重要的意義。

4.2 Bt的環境修復功能

重金屬、殺蟲劑、除草劑和石油衍生物被認為是目前影響環境和人類健康的主要因素。這些化合物容易在食物鏈中累積,進而會對更高的營養級造成危害[68]。有研究顯示,部分Bt菌株可以通過對有毒的重金屬進行積聚、降解或礦化作用,從而有效地清除一些有毒污染物。目前已經有過基于Bt的針對砷、鎘、鉛、銅、鎳、鋅、鉻、汞和鈾等重金屬的生物修復劑的報道。此外,Bt菌株還表現出在殺蟲劑和除草劑方面的修復能力,例如毒死蜱[69]、三苯基錫(有機錫除草劑)、二苯錫和單苯錫[68]等。在石油污染物修復方面Bt也表現出較好的潛力,例如柴油[15]、有機廢物(類黑精[70])以及塑化劑材料(鄰苯二甲酸二甲酯[71])。

Bt在污染物修復方面的潛力對其研究與應用將有一定的促進作用,進一步要對Bt在實際環境中修復污染物的效率及影響因素等方面進行研究,為Bt進一步在環境修復方面的應用奠定基礎。

5 展望

Bt殺蟲劑及表達其殺蟲蛋白的轉基因作物在過去的幾十年里已經為蟲害的綠色防控發揮了重要作用。我國當前農業生產工作中,由于化學農藥的過量使用面臨著巨大的環境壓力,“十三五”期間,我國啟動了“化學肥料和農藥減施增效綜合技術研發”試點專項,圍繞化學肥料和農藥減施增效方面開展了系統的研究。Bt殺蟲劑將圍繞篩選、改造高毒殺蟲微生物株系,優化生產工藝,并進一步深入研究Bt殺蟲劑與化學殺蟲劑的協同作用及其在延緩化學殺蟲劑抗性方面的作用等方面,為國家“減肥減藥”戰略提供解決方案。

隨著Bt在抗病殺菌、促植物生長以及環境修復方面作用的挖掘,Bt的研究領域進一步得到拓展,然而相關領域的研究尚未進入應用階段。泛基因組分析表明,Bt屬于開放型的泛基因組,具有強大的接受新基因的能力,不同菌株間的基因組成差別極大,這些遺傳分析數據表明Bt在功能方面具有強大的多樣性。因此進一步挖掘Bt新功能并探索推進其在新領域的應用,對促進Bt資源高效利用將有重要意義。

[1] Raymond B, Johnston P R, Nielsenleroux C, et al.Bacillusthuringiensis: An impotent pathogen?[J]. Trends in Microbiology, 2010, 18(5): 189-194.

[2] Song Fuping, Zhang Jie, Gu Aixing, et al. Identification ofcry1I-type genes fromBacillusthuringiensisstrains and characterization of a novelcry1I-type gene [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(9): 5207-5211.

[3] 李長友, 張杰, 宋福平, 等. 蘇云金芽孢桿菌B-Pr-88菌株中cry2Ab4基因的表達和殺蟲活性研究[J]. 生物工程學報, 2007, 23(4): 634-638.

[4] Shu Changlong, Zhang Jie, Chen Guihua, et al. Use of a pooled clone method to isolate a novelBacillusthuringiensis, Cry2A toxin with activity againstOstriniafurnacalis[J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2013, 114(1): 31-33.

[5] Sanchis V. From microbial sprays to insect-resistant transgenic plants: History of the biopesticideBacillusthuringiensis[J]. Agronomy for Sustainable Development,2011,31(1):217-231.

[6] Bravo A, Likitvivatanavong S, Gill S S, et al.Bacillusthuringiensis: A story of a successful bioinsecticide [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2011, 41(7): 423-431.

[7] James C. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2016 ISAAA Brief No 52 [R]. ISAAA: Ithaca, NY, 2016.

[8] 束長龍,谷少華,竇黎明,等.對小地老虎具有殺蟲毒力的蘇云金芽孢桿菌菌株的分離及鑒定[J].植物保護,2007,33(5):41-44.

[9] 劉東明, 束長龍, 宋福平, 等. 北京植物園蘇云金芽胞桿菌菌株的分離鑒定[J]. 植物保護, 2012, 38(1): 65-70.

[10]Akram W, Mahboob A, Javed A A.Bacillusthuringiensisstrain 199 can induce systemic resistance in tomato againstFusariumwilt [J].European Journal of Microbiology & Immunology,2013,3(4):275-280.

[11]Singh M, Kumar P, Patel S, et al. Production of polyhydroxyalkanoate co-polymer byBacillusthuringiensis[J]. Indian Journal of Microbiology, 2013, 53(1): 77-83.

[12]Katayama H, Yokota H, Akao T, et al. Parasporin-1, a novel cytotoxic protein to human cells from non-insecticidal parasporal inclusions ofBacillusthuringiensis[J]. Journal of Biochemistry, 2005, 137(1): 17-25.

[13]Brasseur K, Auger P, Asselin E, et al. Parasporin-2 from a newBacillusthuringiensis4R2 strain induces caspases activation and apoptosis in human cancer cells[J]. PLoS ONE, 2015, 10(8): e0135106.

[14]Prudent M, Salon C, Souleimanov A, et al. Soybean is less impacted by water stress usingBradyrhizobiumjaponicumand thuricin-17 fromBacillusthuringiensis[J]. Agronomy for Sustainable Development, 2015, 35(2): 1-9.

[15]Kebria D Y, Khodadadi A, Ganjidoust H, et al. Isolation and characterization of a novel nativeBacillusstrain capable of degrading diesel fuel [J]. International Journal of Environmental Science and Technology, 2009, 6(3): 435-442.

[16]Tettelin H, Masignani V, Cieslewicz M J, et al. Genome analysis of multiple pathogenic isolates ofStreptococcusagalactiae: Implications for the microbial ‘pan-genome’[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2005, 102(39): 13950-13955.

[17]Medini D, Donati C, Tettelin H, et al. The microbial pan-genome[J]. Current Opinion in Genetics and Development, 2005, 15(6): 589-594.

[18]Zhao Yongbin, Wu Jiayan, Yang Junhui, et al. PGAP: pan-genomes analysis pipeline [J]. Bioinformatics, 2012, 28(3): 416-418.

[19]H?fte H, Whiteley H. Insecticidal crystal proteins ofBacillusthuringiensis[J]. Microbiological Reviews,1989,53(2):242-255.

[20]Estruch J J, Warren G W, Mullins M A, et al. Vip3A, a novelBacillusthuringiensisvegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93(11): 5389-5394.

[21]Crickmore N, Zeigler D R, Feitelson J, et al. Revision of the nomenclature for theBacillusthuringiensispesticidal crystal proteins[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998, 62(3): 807-813.

[22]Luo Xiaoxia, Chen Ling, Huang Qiong, et al.Bacillusthuringiensismetalloproteinase Bmp1 functions as a nematicidal virulence factor [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(2): 460-468.

[23]Dunstand-Guzmán E, Pea-Chora G, Hallal-Calleros C, et al. Acaricidal effect and histological damage induced byBacillusthuringiensis, protein extracts on the mitePsoroptescuniculi[J]. Parasites and Vectors, 2015, 8(1): 285-293.

[24]Xue Jing, Liang Gemei, Crickmore N, et al. Cloning and characterization of a novel Cry1A toxin fromBacillusthuringiensiswith high toxicity to the Asian corn borer and other lepidopteran insects [J]. FEMS Microbiology Letters,2008,280(1):95-101.

[25]Nazarian A, Jahangiri R, Jouzani G S, et al. Coleopteran-specific and putative novelcrygenes in Iranian nativeBacillusthuringiensiscollection [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2009, 102(2): 101-109.

[26]Sick A, Gaertner F, Wong A. Nucleotide sequence of a coleopteran-active toxin gene from a new isolate ofBacillusthuringiensissubsp.tolworthi[J]. Nucleic Acids Research, 1990, 18(5): 1305.

[27]Jr Urban J, Hu Yan, Miller M M, et al.Bacillusthuringiensis-derived Cry5B has potent anthelmintic activity againstAscarissuum[J]. PLoS Neglected Tropical Diseases, 2013, 7(6): e2263.

[28]Ruan Lifang, Crickmore N, Peng Donghai, et al. Are nematodes a missing link in the confounded ecology of the entomopathogenBacillusthuringiensis[J]. Trends in Microbiology, 2015, 23(6): 341-346.

[29]Bravo A, Gill S S, Soberón M. Mode of action ofBacillusthuringiensis, Cry and Cyt toxins and their potential for insect control [J]. Toxicon, 2007, 49(4): 423-435.

[30]Bendov E.Bacillusthuringiensissubsp.israelensisand its dipteran-specific toxins [J].Toxins,2014,6(4): 1222-1243.

[31]Warren G W, Koziel M G, Mullins M A, et al. Auxiliary proteins for enhancing the insecticidal activity of pesticidal proteins: US, US5770696 [P/OL]. 1998. http://xueshu.baidu.com/s?wd=paperuri%3A%28f5f4ce8e630c8551eb1d031432d4fdf1%29&filter=sc_long_sign&tn=SE_xueshusource_2kduw22v&sc_vurl=http%3A%2F%2Fwww.freepatentsonline.com%2F5770696.html&ie=utf-8&sc_us=4790129465868586729.

[32]Bi Yang, Zhang Yanrui, Shu Changlong, et al. Genomic sequencing identifies novelBacillusthuringiensis, Vip1/Vip2 binary and Cry8 toxins that have high toxicity to Scarabaeoidea larvae [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(2): 753-760.

[33]Sattar S, Maiti M K. Molecular characterization of a novel vegetative insecticidal protein fromBacillusthuringiensiseffective against sap-sucking insect pest [J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011, 21(9): 937-946.

[34]Chakroun M, Ferré J.Invivoandinvitrobinding of Vip3Aa toSpodopterafrugiperdamidgut and characterization of binding sites using 125I-radiolabeling [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(20): 6258-6265.

[35]Donovan W, Engleman J, Donovan J, et al. Discovery and characterization of Sip1A: A novel secreted protein fromBacillusthuringiensiswith activity against coleopteran larvae [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 72(4): 713-719.

[36]張金波,李海濤,劉榮梅,等.Bt菌株DQ89的sip基因的克隆、表達及殺蟲活性分析[J].中國生物防治學報,2015,31(4): 598-602.

[37]Baum J A, Sukuru U R, Penn S R, et al. Cotton plants expressing a hemipteran-activeBacillusthuringiensiscrystal protein impact the development and survival ofLygushesperus(Hemiptera: Miridae) nymphs [J]. Journal of Economic Entomology, 2012, 105(2): 616-624.

[38]張學雯, 束長龍, 陸宴輝, 等. 對綠盲蝽具有殺蟲活性Bt菌株的篩選及Cry15Aa蛋白活性的研究[J]. 植物保護, 2016, 42(3): 56-62.

[39]劉永磊. 蘇云金芽胞桿菌對灰飛虱高效殺蟲新基因的挖掘與功能研究[D]. 南京: 南京農業大學, 2015.

[40]Iatsenko I, Boichenko I, Sommer R J.BacillusthuringiensisDB27 produces two novel protoxins, Cry21Fa1 and Cry21Ha1, which act synergistically against nematodes[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2014, 80(10):3266-3275.

[41]Luo Hui, Xiong Jing, Zhou Qiaoni, et al. The effects ofBacillusthuringiensis, Cry6A on the survival, growth, reproduction, locomotion, and behavioral response ofCaenorhabditiselegans[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(23): 10135-10142.

[42]Kotze A C, O’Grady J, Gough J M, et al. Toxicity ofBacillusthuringiensisto parasitic and free-living life-stages of nematode parasites of livestock [J]. International Journal for Parasitology, 2005, 35(9): 1013-1022.

[43]Yu Ziquan, Xiong Jing, Zhou Qiaoni, et al. The diverse nematicidal properties and biocontrol efficacy ofBacillusthuringiensisCry6A against the root-knot nematodeMeloidogynehapla[J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2015, 125: 73-80.

[44]Zhang Fengjuan, Peng Donghai, Ye Xiaobo, et al.Invitrouptake of 140 kDaBacillusthuringiensisnematicidal crystal proteins by the second stage juvenile ofMeloidogynehapla[J]. PLoS ONE, 2012, 7(6): e38534.

[45]Devidas P, Rehberger L A. The effects of exotoxin (Thuringiensin) fromBacillusthuringiensisonMeloidogyneincognitaandCaenorhabditiselegans[J]. Plant and Soil, 1992,145(1): 115-120.

[46]Vu K D, Yan S, Tyagi R D, et al. Induced production of chitinase to enhance entomotoxicity ofBacillusthuringiensisemploying starch industry wastewater as a substrate[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(21): 5260-5269.

[47]Zhou Mengzhou, Yu Hai , Yin Xianhua, et al.LactobacilluszeaeprotectsCaenorhabditiselegansfrom enterotoxigenic escherichia coli-caused death by inhibiting enterotoxin gene expression of the pathogen [J]. PLoS ONE, 2014, 9(2): e89004.

[48]Juibari M, Abbasalizadeh S, Jouzani G, et al. Intensified biosynthesis of silver nanoparticles using a native extremophilicUreibacillusthermosphaericusstrain[J]. Materials Letters, 2011, 65(6): 1014-1017.

[49]Jain D, Kachhwaha S, Jain R, et al. Novel microbial route to synthesize silver nanoparticles using spore crystal mixture ofBacillusthuringiensis[J]. Indian Journal of Experimental Biology, 2010, 48(11): 1152-1156.

[50]Marimuthu S, Rahuman A A, Kirthi A V, et al. Eco-friendly microbial route to synthesize cobalt nanoparticles usingBacillusthuringiensisagainst malaria and dengue vectors [J]. Parasitology Research, 2013, 112(12): 4105-4112.

[51]盧偉, 趙秋敏, 陳艷玲, 等. 幾丁質酶在蘇云金芽胞桿菌中的分布及抑小麥赤霉菌菌株的篩選[J]. 南開大學學報(自然科學版), 2007，40(3): 97-101.

[52]Shrestha A, Sultana R, Chae J C, et al.Bacillusthuringiensis, C25 which is rich in cell wall degrading enzymes efficiently controls lettuce drop caused bySclerotiniaminor[J]. European Journal of Plant Pathology, 2015, 142(3): 577-589.

[53]Rocha L O, Tralamazza S M, Reis G M, et al. Correction: Multi-method approach for characterizing the interaction betweenFusariumverticillioidesandBacillusthuringiensissubsp.Kurstaki[J]. PLoS ONE, 2015, 10(10): e92189.

[54]Kim P I, Bai H, Bai D, et al. Purification and characterization of a lipopeptide produced byBacillusthuringiensisCMB26 [J]. Journal of Applied Microbiology, 2004, 97(5): 942-949.

[55]Zheng Min, Shi Jingying, Shi Jian, et al. Antimicrobial effects of volatiles produced by two antagonisticBacillus, strains on the anthracnose pathogen in postharvest mangos [J]. Biological Control, 2013, 65(2): 200-206.

[56]Dong Yihu, Zhang Xifen, Xu Jinling, et al. InsecticidalBacillusthuringiensissilencesErwiniacarotovoravirulence by a new form of microbial antagonism, signal interference [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70(2): 954-960.

[57]Chi E H, Jo S H, Ju Y M, et al. Isolation of novel leaf-inhabiting endophytic bacteria inArabidopsisthaliana, and their antagonistic effects on phytopathogens [J]. Plant Biotechnology Reports, 2015, 9(6): 451-458.

[58]Park S J, Park S Y, Ryu C M, et al. The role of AiiA, a quorum-quenching enzyme fromBacillusthuringiensis, on the rhizosphere competence [J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 18(9): 1518-1521.

[59]Bora L C, Kataki L, Talukdar K, et al. Molecular characterizations of microbial antagonists and development of bioformulations for management of bacterial wilt of Naga chilli (CapsicumchinensJacq.) in Assam [J]. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences, 2015, 3(2): 109-122.

[60]Elsharkawy M M, Mai N, Nishimura M, et al. Control of tomato bacterial wilt and root-knot diseases byBacillusthuringiensisCR-371 andStreptomycesavermectiniusNBRC14893[J]. Acta Agriculturae Scandinavica, 2015, 65(6): 575-580.

[61]Santiago T R, Grabowski C, Rossato M, et al. Biological control of eucalyptus bacterial wilt with rhizobacteria [J]. Biological Control, 2015, 80: 14-22.

[62]Nm F S, Casadosvázquez L E, Barbozacorona J E. Bacteriocins ofBacillusthuringiensis can expand the potential of this bacterium to other areas rather than limit its use only as microbial insecticide [J]. Canadian Journal of Microbiology, 2013, 59(8): 515-522.

[63]Barbozacorona J E, De l F N, Alvamurillo N, et al. Activity of bacteriocins synthesized byBacillusthuringiensisagainstStaphylococcusaureusisolates associated to bovine mastitis[J]. Veterinary Microbiology, 2009, 138 : 179-183.

[64]Mishra P K, Mishra S, Selvakumar G, et al. Coinoculation ofBacillusthuringiensis-KR1 withRhizobiumleguminosarumenhances plant growth and nodulation of pea (PisumsativumL.) and lentil (LensculinarisL.)[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2009, 25(5): 753-761.

[65]Armada E, Probanza A, Roldán A, et al. Native plant growth promoting bacteriaBacillusthuringiensis, and mixed or individual mycorrhizal species improved drought tolerance and oxidative metabolism inLavanduladentataplants [J]. Journal of Plant Physiology, 2016, 192: 1-12.

[66]Bai Yuming, Zhou Xiaomin, Smith D L. Enhanced soybean plant growth resulting from coinoculation ofBacillusstrains withBradyrhizobiumjaponicum[J]. Crop Science, 2003,43(5): 1774-1781.

[67]Ortiz N, Armada E, Duque E, et al. Contribution of arbuscular mycorrhizal fungi and/or bacteria to enhancing plant drought tolerance under natural soil conditions: effectiveness of autochthonous or allochthonous strains [J]. Journal of Plant Physiology, 2015, 174: 87-96.

[68]Huang Jie, Ye Jinshao, Ma Jiawen, et al. Triphenyltin biosorption, dephenylation pathway and cellular responses during triphenyltin biodegradation byBacillusthuringiensisand tea saponin [J]. Chemical Engineering Journal, 2014, 249: 167-173.

[69]Aceves-Diez A E, Estrada-Castaeda K J, Castaeda-Sandoval L M, Use ofBacillusthuringiensissupernatant from a fermentation process to improve bioremediation of chlorpyrifos in contaminated soils [J]. Journal of Environmental Management, 2015, 157: 213-219.

[70]Kumar P, Chandra R. Decolourisation and detoxification of synthetic molasses melanoidins by individual and mixed cultures ofBacillusspp.[J]. Bioresource Technology, 2006, 97(16): 2096-2102.

[71]Brar S K, Verma M, Tyagi R D, et al. Concurrent degradation of dimethyl phthalate (DMP) during production ofBacillusthuringiensisbased biopesticides [J]. Journal of Hazardous Materials, 2009, 171: 1016-1023.

(責任編輯：田 喆)

Bacillusthuringiensis—Open pan-genome and various functions

Wang Kui1,2, Shu Changlong1, Li Yimei1, Zhang Jie1

(1.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 2.CollegeofLifeScience,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

As an important biological insecticide,Bacillusthuringiensishas been widely used to control agricultural, forest and medical insect pests. Bt toxin genes have also been extensively used as gene source in genetically modified crops. In recent years, with the development of science, technology and social demands, some other new functions of Bt have been explored, including resistance to nematodes, antagonistic effects against plant pathogenic fungi and bacteria, plant growth-promoting activities, and environmental bioremediation. Based on the pan-genome analysis and genetic peculiarity of Bt, we reviewed recent advances in Bt insecticidal genes, and analyzed the relationship between pan-genome and various new functions of Bt, in order to provide a guide for the research and application of Bt in China.

Bacillusthuringiensis; pan-genome; insecticidal gene; antagonistic effect; plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR); environmental bioremediation

特約稿件InvitedPaper

2017-06-16

2017-06-19

國家重點研發計劃重點專項(SQ2017ZY060066-04)

Q 939.9

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.001

* 通信作者 E-mail: jzhang@ippcaas.cn