垂序商陸及勝紅薊提取物對降香黃檀炭疽病菌的抑菌機理研究

周潔塵, 周國英, 劉君昂, 何苑皞, 董文統

(中南林業科技大學,森林有害生物防控湖南省重點實驗室;經濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室, 長沙 410004)

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垂序商陸及勝紅薊提取物對降香黃檀炭疽病菌的抑菌機理研究

周潔塵, 周國英, 劉君昂*, 何苑皞, 董文統

(中南林業科技大學,森林有害生物防控湖南省重點實驗室;經濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室, 長沙 410004)

通過測定垂序商陸與勝紅薊乙酸乙酯提取物處理后的降香黃檀炭疽病菌內丙二醛含量、蛋白質含量以及4種酶活性,來初步判斷垂序商陸與勝紅薊提取物對炭疽病菌的作用機理。結果表明:兩種提取物都能在一定程度上破壞炭疽病病原菌膜系統,垂序商陸處理組丙二醛含量在56 h后顯著提高,勝紅薊處理組則緩慢增加,略高于對照組;垂序商陸處理組菌體內蛋白質含量先增加,32 h后急劇降低,勝紅薊處理組蛋白質含量從初期開始就少于對照組;兩種提取物都能影響菌體的保護性酶活性,兩處理組SOD活力都呈現先增高后降低的趨勢,CAT活力高于對照組。兩組SDH、LDH活力都小于對照組,而垂序商陸處理組SDH、LDH活力小于勝紅薊處理組。初步說明兩種植物提取物可通過影響病原菌的代謝系統和生理過程來發揮其抑菌作用。

植物提取物; 降香黃檀; 炭疽病菌; 抑菌機理

由膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides引起的炭疽病作為降香黃檀Dalbergiaodorifera的最主要病害之一,在海南發生嚴重,常常大面積暴發,尤其是在降香黃檀人工純林中。炭疽病菌可以導致植株葉片穿孔或逐漸干枯,甚至脫落,嚴重影響了植株的光合作用,從而影響到降香黃檀芯材的形成,造成極大的經濟損失[1-3]。目前國內對降香黃檀炭疽病主要靠經驗采用化學藥劑進行防治,常用藥劑有多菌靈、代森錳鋅、甲基硫菌靈、中生菌素、吡唑醚菌酯與代森聯的混劑、百菌清等[4-7]。針對降香黃檀炭疽病生物源藥劑的研究較少,尤其是研究植物提取物對病原菌的抑菌機理。而植物源殺菌劑的作用機理研究大多數是直接將植物提取物作用于病原菌,測定其對菌絲生長以及孢子產生的抑制程度。垂序商陸Phytolaccaamericana及勝紅薊Ageratumconyzoides乙酸乙酯提取物對降香黃檀炭疽病菌均有一定的抑菌作用[8],目前國內外尚無報道垂序商陸及勝紅薊對降香黃檀炭疽病菌的抑菌機理。

在前期的研究中,本實驗室從13種海南入侵植物中篩選到2種對降香黃檀炭疽病菌有良好抑菌效果的植物垂序商陸和勝紅薊,并在研究了2種植物提取物處理下病原菌菌絲生長過程、菌絲形態變化等的基礎上[8],通過將垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物直接作用于降香黃檀炭疽病菌,測定了病原菌生理指標以及代謝途徑中關鍵酶系統,從病原菌代謝等方面來研究垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物的抑菌機理,這對垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物在生物防治領域中的應用具有重要的指導意義,為我國研發新的生物農藥提供支持,豐富我國生物農藥領域的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種:為本實驗室從海南省澄邁國營林場的降香黃檀炭疽病病葉中分離的膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides。

供試植物:勝紅薊、垂序商陸采自海南省澄邁國營林場。

1.2 方法

1.2.1 垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物的制備

將垂序商陸與勝紅薊洗凈后置于干燥通風處陰干至恒重,放入粉碎機中粉碎,過40目篩。得到粉末置于40℃烘箱中24 h后密封保存。

采用冷浸法進行垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物的制備[9],以乙酸乙酯作為提取溶劑,固液比為1∶10,室溫下浸泡3次,每次間隔時間3 d,收集3次濾液進行旋轉蒸發,干燥得到粗提物。加入適量無水乙醇溶解,再加蒸餾水,使乙醇濃度為10%,粗提物濃度為100 mg/mL。置于冰箱內冷藏備用。

1.2.2 降香黃檀炭疽病菌菌體上清液的制備

準備一定量加有30 mL已滅菌PD培養基的三角瓶,接入降香黃檀炭疽病菌。于28℃,160 r/min振蕩培養6 d后,分別加入垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物使終濃度分別為3.413 mg/mL和5.849 mg/mL[8],以不加藥為對照,繼續培養,在2、4、6、8、10、12 h后以及之后的每隔12 h取出一個三角瓶。稱取一定量菌絲,在-20℃冰箱中冷凍過夜后加入5倍體積的0.01 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)以及適量石英砂,在液氮下研磨成漿。在4℃、5 000 r/min的條件下離心10 min,取上清液,在-20℃條件下冷凍保存。

1.2.3 垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物對炭疽病菌內丙二醛含量的影響測定

丙二醛(MDA)含量是常用的衡量膜脂過氧化程度的一個非常重要的生理指標,可以與硫代巴比妥酸(TBA)反應生成紅棕色的三甲川(3,5,5-三甲基惡唑-2,4-二酮)。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法測定[10]。

取2 mL上清液與2 mL 0.67%硫代巴比妥酸混合,100℃水浴煮沸30 min,冷卻后離心,測定上清液分別在波長450、532、600 nm處的吸光度值,每處理重復3次。三甲川最大的吸收波長在532 nm。但由于測定丙二醛含量的過程中易受多種物質干擾,最主要的是可溶性糖,所以為了消除糖類物質對反應的干擾,丙二醛濃度按下述公式計算:C(μmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450。

1.2.4 垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物對炭疽病菌內蛋白質含量的影響測定

為研究垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物對降香黃檀炭疽菌內蛋白質含量及合成是否有影響,采用考馬斯亮藍G-250比色法[11]對2、4、6、8、10、12 h后以及之后每隔12 h的菌體進行蛋白質含量的測定。

標準曲線繪制:試驗采用牛血清蛋白(BSA)作用標準蛋白。準確稱取10 mg BSA,用少量的去離子水溶解后定容至10 mL,制成濃度為1.00 mg/mL的原液。分別取1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mL原液于不同具塞試管中,再分別加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL去離子水使總體積為1.0 mL。分別在各試管中加入5.0 mL配好的考馬斯亮藍G-250反應液,振蕩均勻后放置2 min,然后在595 nm處測定吸光值,以去離子水加反應液為空白對照。重復試驗3次,以蛋白質濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

菌體蛋白含量的測定:準確吸取0.1 mL各處理樣品,分別置于10 mL具塞試管中,然后加入5 mL考馬斯亮藍G-250反應液,振蕩混勻后放置2 min,然后在595 nm處測定吸光值,再根據標準曲線查得菌體上清液中蛋白質濃度,重復試驗3次,求得平均每克菌體中蛋白質含量。

1.2.5 垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物對炭疽病菌各類酶活力的影響測定

分別測定垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物處理的降香黃檀炭疽病病原菌體內的超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、琥珀酸脫氫酶(SDH)以及乳酸脫氫酶(LDH)活力[12-15]。利用已制備好的菌體上清液,按照試劑盒操作步驟分別測定4種酶的活力,各進行3次試驗。SOD、CAT、SDH以及LDH活力測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。

2 結果與分析

2.1 垂序商陸及勝紅薊提取物對炭疽病菌體內丙二醛含量的影響

圖1為垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物處理后的降香黃檀炭疽病菌內丙二醛含量隨時間變化情況。從圖1可以看出,與對照組相比垂序商陸乙酸乙酯提取物處理組丙二醛含量在56 h前基本無變化,56 h后丙二醛含量大幅增加,在68 h時丙二醛含量達到最大,為2.041 μmol/L。這說明在56 h前降香黃檀炭疽病菌細胞膜脂過氧化程度不高,對垂序商陸乙酸乙酯提取物具有較好的耐受力,56 h后膜脂過氧化嚴重,膜系統遭到破壞。而勝紅薊乙酸乙酯提取物處理組的丙二醛含量隨時間的推移緩慢增加,這說明降香黃檀炭疽病菌對勝紅薊乙酸乙酯提取物具有一定的耐受力,但初期就開始受到影響。

圖1 垂序商陸及勝紅薊提取物對炭疽病菌體內丙二醛含量的影響Fig.1 Effects of Phytolacca americana and Ageratum conyzoides extracts on the MDA content of Colletotrichum gloeosporioides

2.2 垂序商陸及勝紅薊提取物對炭疽病菌體內蛋白質含量的影響

圖3顯示,垂序商陸乙酸乙酯提取物處理后降香黃檀炭疽病菌體內蛋白質含量在32 h前呈不斷增加,32 h時蛋白質含量達5.311 mg/g,32 h后急劇下降然后又呈緩慢增加趨勢。初期蛋白質含量的升高可能是由于菌體進入惡劣環境,啟動了自身某些保護機制,保護性酶等大量合成,蛋白質合成增加,而后隨著膜脂氧化程度增加,細胞膜遭到破壞等原因導致蛋白質含量降低。勝紅薊乙酸乙酯提取物對降香黃檀炭疽病菌體內蛋白質含量與對照組相比整體呈現一定的抑制作用,可能的原因是提取物中含有某種抑制降香黃檀炭疽病菌體內蛋白質合成的成分。

圖2 蛋白質濃度測定標準曲線Fig.2 Standard curve of protein concentration

圖3 垂序商陸及勝紅薊提取物對炭疽病菌體內蛋白質含量的影響Fig.3 Effects of Phytolacca americana and Ageratum conyzoides extracts on protein concentration of Colletotrichum gloeosporioides

2.3 垂序商陸及勝紅薊提取物對炭疽病菌體內各類酶活力的影響

2.3.1 提取物對炭疽病菌體內超氧化物歧化酶活力的影響

超氧化物歧化酶在生物體內的水平高低是衰老與死亡的直觀指標。圖4顯示,對照組SOD活力相對較穩定,垂序商陸乙酸乙酯提取物處理后的降香黃檀炭疽病菌體內SOD活力呈現先升高后降低的趨勢,在培養32 h后達到峰值,達42.5 U/(g·min)。這說明微生物在提取物的逆境脅迫下,前期SOD增加從而保護菌體,消除新陳代謝產生的有害物質,但后期由于氧自由基的增加和膜脂過氧化的加重等原因最終導致酶含量的降低。勝紅薊乙酸乙酯提取物處理組也呈現相同的趨勢,但SOD活力在培養20 h后達到峰值,為39.6 U/(g·min),隨后開始下降并維持在較低的水平,僅4 U/(g·min)。

圖4 垂序商陸及勝紅薊提取物對炭疽病菌體內超氧化物歧化酶活力的影響Fig.4 Effects of Phytolacca americana and Ageratum conyzoides extracts on the SOD activity of Colletotrichum gloeosporioides

2.3.2 提取物對炭疽病菌體內過氧化氫酶活力的影響

過氧化氫酶是生物體防御系統的關鍵酶之一,催化細胞內過氧化氫的分解。圖5可以看出,對照組的CAT一直維持在較低水平,說明細胞內過氧化氫含量不多。垂序商陸乙酸乙酯提取物處理組菌體內的CAT水平不斷增加以保護細胞免受過氧化氫的毒害,說明在垂序商陸提取物的逆境脅迫下,微生物的過氧化氫含量增多,由于過氧化氫是超氧化歧化酶反應產物之一,所以這與氧自由基的增加和超氧化歧化酶水平的增高也有一定關系。勝紅薊乙酸乙酯提取物處理組菌體內CAT水平先升高后降低,在32 h時達到峰值,這可能是由于前期為消除新陳代謝產生的過氧化氫,CAT水平增高,但后期由于超氧化物歧化酶的逐漸降低以及膜脂過氧化嚴重等原因導致了CAT水平的降低。

圖5 垂序商陸及勝紅薊提取物對炭疽病菌體內過氧化氫酶活力的影響Fig.5 Effects of Phytolacca americana and Ageratum conyzoides extracts on the activity of CAT of Colletotrichum gloeosporioides

2.3.3 提取物對炭疽病菌體內琥珀酸脫氫酶活力的影響

琥珀酸脫氫酶是三羧酸(TCA)循環中的兩個重要氧化還原酶之一,以FAD作為其脫下電子的受體,可影響整個三羧酸循環的正常運作。圖6為垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物處理后的降香黃檀炭疽病菌內SDH活力隨時間的變化情況。結果顯示,空白對照組中病原菌體內的SDH活力在44 h前呈升高趨勢,隨后降低,菌體在經過一段時間的強呼吸作用后慢慢趨于平衡。而垂序商陸乙酸乙酯提取物處理組SDH活力遠遠小于對照組,并隨處理時間的延長而下降到較低水平,這可能是由于垂序商陸乙酸乙酯提取物抑制或破壞了病原菌菌絲體細胞內的SDH,使整個三羧酸循環停滯,從而抑制病原菌的生長。勝紅薊乙酸乙酯提取物處理組的SDH活力也小于對照組,并在初期有增高的趨勢,但很快就降低了,這說明勝紅薊乙酸乙酯提取物對SDH的抑制及破壞作用時間較長,且抑制效果差于垂序商陸乙酸乙酯提取物。

圖6 垂序商陸及勝紅薊提取物對炭疽病菌體內琥珀酸脫氫酶活力的影響Fig.6 Effects of Phytolacca americana and Ageratum conyzoides extracts on the activity of SDH of Colletotrichum gloeosporioides

2.3.4 提取物對炭疽病菌體內乳酸脫氫酶活力的影響

乳酸脫氫酶是糖酵解途徑中生物氧化的關鍵酶,能夠催化乳酸與丙酮酸相互轉化,圖7顯示,降香黃檀炭疽病菌在生長過程中,LDH活力隨培養時間的延長而緩慢降低。垂序商陸乙酸乙酯提取物處理組病原菌體內的LDH活力遠小于對照組,并隨時間推移下降到較低水平,這說明垂序商陸乙酸乙酯提取物可能通過抑制菌體內LDH的合成或者破壞菌體內LDH對菌體細胞的糖酵解途徑產生嚴重干擾。而勝紅薊乙酸乙酯提取物對菌體內的LDH影響程度低于垂序商陸乙酸乙酯提取物,這可能也是勝紅薊乙酸乙酯提取物抑菌活性差于垂序商陸乙酸乙酯提取物的原因之一。

圖7 垂序商陸及勝紅薊提取物對炭疽病菌體內乳酸脫氫酶活力的影響Fig.7 Effects of Phytolacca americana and Ageratum conyzoides extracts on the activity of LDH of Colletotrichum gloeosporioides

3 討論

生物體內丙二醛含量是衡量膜脂過氧化程度的一個非常重要的生理指標,是在逆境條件下發生膜脂過氧化反應的產物之一,其含量高低表示細胞膜脂過氧化程度和生物對逆境條件耐受能力的強弱。本試驗通過測定丙二醛含量發現兩種植物乙酸乙酯提取物都能在一定程度上破壞降香黃檀炭疽病菌的膜系統,從而在一定程度上導致蛋白質含量的變化。

SOD是生物體中最重要的抗氧化酶,能夠催化超氧化物通過歧化反應轉化為O2和H2O2,消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質,保護細胞免受氧自由基的傷害并保持細胞膜的柔軟健康。CAT也是生物防御體系的關鍵酶之一,清除SOD的歧化產物H2O2分解成為分子氧和水,使得H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應生成非常有害的-OH,保護細胞免受毒害。國內外研究表明[16-18],生物體發病或生長不良初期,自由基大幅產生并引起氧化應激,影響蛋白質表達等調節、應答機制。而在自由基的誘導下,細胞會誘導性地增強抗氧化能力,一般會出現SOD水平增高現象。但隨著高濃度自由基對SOD的大量消耗以及機體的調節機制,SOD的生物合成能力很快回落到低水平,并與較高濃度的自由基保持新的動態平衡。本試驗中兩種植物提取物處理組中SOD活力的變化也出現與之相同的趨勢。SDH是三羧酸循環的關鍵酶之一,催化琥珀酸脫氫生成黃素腺嘌呤二核苷酸和延胡索酸,是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一,可以為細胞需氧和產能的呼吸鏈提供電子,其活性可以作為評價三羧酸循環運行程度的指標。而LDH作為糖酵解途徑中生物氧化的關鍵酶,催化乳酸與丙酮酸相互轉化,其變化可以影響整個糖酵解過程。本試驗中病原菌體內的丙二醛含量、保護性酶以及代謝關鍵酶都受到植物提取物的影響,可以初步判斷垂序商陸乙酸乙酯提取物和勝紅薊乙酸乙酯提取物對病原菌的抑菌作用方式。

不同植物殺菌有效成分對微生物的作用位點不同,抑制真菌菌絲生長、孢子的產生或萌發、附著胞形成及侵入絲的形成;干擾細菌細胞壁合成、抑制核復制和轉錄、抑制蛋白質的合成等。如張國珍等[19]從麻黃和細辛中提取的麻黃油和細辛油可抑制人參鏈格孢分生孢子和薏苡黑粉菌冬孢子萌發。楊幫[20]通過觀察美洲商陸提取物對柑橘綠霉病菌菌絲的作用過程,發現美洲商陸能明顯抑制綠霉病菌菌絲生長,產生畸形,分支間距縮短。本試驗初步探索了垂序商陸及勝紅薊乙酸乙酯提取物的抑菌機理,了解了這兩種提取物對降香黃檀炭疽病菌體內關鍵酶的影響,但對其具體的作用位點并未進行研究,今后有必要加深這方面的研究。

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(責任編輯：田 喆)

Antifungal mechanisms of the ethyl acetate extracts fromPhytolaccaamericanaandAgeratumconyzoidesagainstColletotrichumgloeosporioidesofDalbergiaodorifera

Zhou Jiechen, Zhou Guoying, Liu Jun’ang, He Yuanhao, Dong Wentong

(HunanProvincialKeyLaboratoryforControlofForestDiseasesandPests;KeyLaboratoryofCultivationandProtectionforNon-woodForestTreesofMinistryofEducation,CentralSouthUniversityofForestryandTechnology,Changsha410004,China)

To judge the action mechanism of ethyl acetate extracts fromPhytolaccaamericanaandAgeratumconyzoidesagainstColletotrichumgloeosporioides, the MAD content, protein content and the activity of 4 kinds of enzymes of the pathogen treated with the extracts were measured. The results showed that the membrane system of the pathogen could be partly destroyed by the extracts of 2 plants; the MDA content of the pathogen treated with the extract ofP.americanaincreased significantly 56 h later, and the MDA content of the pathogen treated with the extract ofA.conyzoidesincreased slowly, slightly higher than the control group. The protein content of the pathogen treated with the extract ofP.americanaincreased 32 h after treatment, and then decreased rapidly. The protein content of the pathogen treated with the extract ofA.conyzoideswas less than that of the control group from the beginning on. The activity of protective enzymes was affected by the extracts of both plants. The SOD activity tended to increase firstly and decrease subsequently, and the CAT activity of the two groups was higher than that of their control group. The SDH and LDH activity was inhibited by the extracts of both plants, while the inhibitory effect ofP.americanaextracts was stronger than that ofA.conyzoidesextracts. In addition, it was found that the two extracts could destroy the metabolic pathways and affect the physiological function of the pathogen, which might be the reason why the extracts could inhibitC.gloeosporioides.

plant extract;Dalbergiaodorifera;Colletotrichumgloeosporioides; antifungal mechanism

2016-06-29

2016-08-29

“十三五”國家重點研發計劃(2016YFD0600601-1)；國家林業公益性行業科研專項(201304402)

S 763.15

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.008

* 通信作者 E-mail:csuftfp@163.com