低濃度Bt殺蟲蛋白連續刺激對甜菜夜蛾飛翔力的影響

蔡文宸, 蘇宏華, 陳 玲, 周 浩, 楊益眾

(揚州大學園藝與植物保護學院, 揚州 225009)

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低濃度Bt殺蟲蛋白連續刺激對甜菜夜蛾飛翔力的影響

蔡文宸, 蘇宏華, 陳 玲, 周 浩, 楊益眾*

(揚州大學園藝與植物保護學院, 揚州 225009)

以人工飼料中添加低濃度的Cry1Ac 殺蟲蛋白(0、5、10、20 μg/g)飼養甜菜夜蛾5個世代,探討低濃度殺蟲蛋白連續刺激對該蟲處女蛾與產卵蛾飛行速度、飛行時間與飛行距離的影響。結果表明,甜菜夜蛾對低濃度Bt毒素的響應經過了敏感期、逐步適應期到最終適應甚至反彈幾個階段:在F1代,對照組的飛行距離顯著長于最高濃度處理組。F2、F3代,低濃度處理(5～10 μg/g)后的甜菜夜蛾飛行力開始增強,高濃度殺蟲蛋白處理組(20 μg/g)的飛行力仍低于對照,不同處理在飛行時間與飛行距離上差異顯著。在F4代,處女蛾的飛行力開始回升,特別是低濃度處理(5 μg/g)的飛行時間和飛行距離顯著高于對照,也顯著或極顯著高于其他2個濃度處理,各處理在飛行時間和飛行距離上達到顯著差異。到了F5代,所有處理的飛行力均大于對照,其飛行速度、飛行時間與飛行距離3個指標在各處理間均達到顯著差異。研究同時發現,無論是處女蛾,還是產卵雌蛾,對低濃度Cry1Ac 殺蟲蛋白的響應基本一致。文章認為,闡述毒蛋白對昆蟲飛行的影響需要研究多個世代。

Cry1Ac殺蟲蛋白; 甜菜夜蛾; 飛翔力; 響應

甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner屬鱗翅目夜蛾科,是一種間歇暴發性的多食性害蟲[1]。20世紀80年代以前,該害蟲僅在我國的局部地區零星發生,且以為害蔬菜作物為主。但自80年代中期以后特別是進入90年代,它在棉花等作物上的發生日趨嚴重,21世紀以來已成為棉花、芝麻、蔬菜等作物上的一種主要害蟲[2-3]。王生元等報道江蘇姜堰市自從1992年在棉花上發現甜菜夜蛾后,發生量逐年增加,1995年、1996年連續兩年大發生,第3、4代百株棉花蟲量超過100頭,嚴重的田塊達1 000頭,對棉花產量造成的損失一般20%～30%,嚴重田塊達50%以上[4]。河北省植保總站1999年曾報道,轉基因抗蟲棉田甜菜夜蛾發生為害十分嚴重,有些田塊百株蟲量高達100多頭,葉片被啃食成花葉[5]。而該蟲也是一種間歇性遷飛的食葉性害蟲[6]。甜菜夜蛾的遷飛頻次以及發生為害加重的程度與轉基因棉花的大面積推廣應用之間是否存在一定的聯系值得探討。

關于甜菜夜蛾飛行力與Bt毒素濃度的關系,前人已做過一些研究。陳建研究發現,在一定濃度范圍內,甜菜夜蛾的飛行能力隨著飼料中Bt毒素濃度的升高而升高,超過一定的濃度范圍,飛行力便顯著下降[7]；還有研究結果進一步指出,當甜菜夜蛾人工飼料中Cry1Ac 殺蟲蛋白的濃度在25～50 μg/g時,甜菜夜蛾的飛行能力呈上升趨勢,并在50 μg/g時飛行距離和飛行時間均達到最大,但與對照差異不顯著。但當濃度升高到100 μg /g,甚至200 μg/g時,雌蛾的飛行距離、飛行時間和飛行速度均較對照顯著下降[8]。

在長江流域,甜菜夜蛾為害棉花是一個連續的過程。自棉花現蕾至成熟吐絮均可發生為害,其中第3、4代是主害代,而大發生年份,第2代、第5代也可造成棉花產量的損失[9]。有研究指出,轉基因棉花葉片中的Bt毒素含量呈動態下降趨勢,在棉花生長中后期含量較低[10]。為此,本文以較低濃度的Bt殺蟲蛋白連續人工飼養甜菜夜蛾5個世代,探討經低濃度Bt殺蟲蛋白多代刺激后該害蟲飛行能力的變化,為預測轉基因棉田甜菜夜蛾的大發生提供理論依據,也為轉基因棉花的長期安全種植與棉田害蟲的綜合治理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源、人工飼料配方與飼養條件

所用甜菜夜蛾蟲源和人工飼料配方均由中國農業科學院植物保護研究所提供。

飼養條件的控制:所有試驗均在恒溫培養箱中進行。溫度設定為(26±1)℃,相對濕度60%～75%,光周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2 含有不同濃度CrylAc殺蟲蛋白人工飼料的配制

吸取一定量、已商業化的CrylAc殺蟲蛋白溶液稀釋后置于1 mL離心管中放入冰盒中備用,稱取1 000 g的室溫正常人工飼料置于保鮮盒中,用移液槍吸取一定量的Cry1Ac溶液加入保鮮盒中并用玻璃棒迅速攪拌,配制成含Cry1Ac殺蟲蛋白濃度為5、10、20 μg/g的飼料,以未加入Cry1Ac殺蟲蛋白的飼料作為對照。

1.3 甜菜夜蛾飛行力的測定

1.3.1 甜菜夜蛾的飼養

將孵化12 h后的幼蟲接至保鮮盒中(19 cm×13 cm×6 cm),每盒20～30頭。用含 Cry1Ac 毒蛋白濃度分別為 0(對照)、5、10和20 μg /g 的飼料飼喂至化蛹,每天或隔天更換飼料。以第一代各處理成蟲所產的卵作為下一代各處理的蟲源,以此類推,連續飼養5個世代[11]。待測蟲態為剛產卵的雌蛾(產卵蛾)和同日齡未交配的處女蛾。

1.3.2 甜菜夜蛾飛行力的測定

測試前,先在指形管中用乙醚輕度麻醉大小較為一致的甜菜夜蛾,然后用毛筆輕刷甜菜夜蛾胸腹部交界處,去除毛和鱗片,再將小銅絲環用 502膠粘接在蟲體上。測試時,將小銅絲環連接于飛行磨(佳多科工貿有限責任公司研發,型號:FXM-D)的吊臂上。室內測試溫度保持在26℃左右,相對濕度約70%。測試時間8 h(23:00-07:00)。用飛行距離、飛行時間和平均速度來描述成蟲的飛行能力[12]。每處理測試成蟲20頭,重復3次。

1.4 試驗數據的統計與分析

相關數據均表示為平均數±標準差,采用Excel 2003,DPS v7.05等軟件進行處理分析。單因素方差分析各參數的變化,LSD法進行差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 取食不同濃度Cry1Ac對甜菜夜蛾處女蛾飛行能力的影響

不同濃度的Cry1Ac殺蟲蛋白對甜菜夜蛾處女蛾飛行力的影響隨世代的不同而不同。研究發現,甜菜夜蛾對Bt毒素的響應經過了敏感、逐步適應，到最終適應甚至反彈等幾個階段。F1代,對照組的飛行能力大多強于各處理組。其中,飛行距離在處理間達到顯著差異(df=3,F=10.66,P=0.003 6)(表1)。說明Bt毒素的短期刺激抑制了甜菜夜蛾的飛行;F2、F3代,甜菜夜蛾對Bt毒素的響應從開始適應到逐步適應,且低濃度處理(5～10 μg /g)的飛行力有增強趨勢。尤其是F2代,最低濃度處理(5 μg /g)的飛行時間與對照沒有顯著差異,較低濃度處理(5～10 μg /g)的飛行距離與對照也沒有顯著差異;但隨著殺蟲蛋白濃度的增加(20 μg /g),飛行力仍較對照顯著下降。不同處理在飛行時間和飛行距離上差異顯著(F2代:飛行時間:df=3,F=10.36,P=0.004;飛行距離:df=3,F=9.33,P=0.005 4)。F4、F5代,甜菜夜蛾對Bt毒素的響應從完全適應到刺激反彈。在F4代,處理組甜菜夜蛾的飛行力開始上升,特別是低濃度處理(5 μg /g)的飛行時間和飛行距離顯著高于對照,也顯著或極顯著高于其他2個濃度處理,各處理在飛行時間和飛行距離上差異顯著(飛行時間:df=3,F=7.18,P=0.011 7;飛行距離:df=3,F=11.14,P=0.003 2)。到了F5代,所有處理組的飛行指標均大于對照,處理間達到了顯著差異(平均速度:df=3,F=4.28,P=0.044 5;飛行時間:df=3,F=4.32,P=0.043 6;飛行距離:df=3,F=4.25,P=0.045 3)。這表明經多代刺激后,低濃度Cry1Ac殺蟲蛋白對甜菜夜蛾飛行的影響出現了正效應。

表1 取食不同濃度Cry1Ac殺蟲蛋白的F1～F5代甜菜夜蛾處女蛾的飛行能力1)

Table 1 Flight performance ofSpodopteraexiguavirgin adult from first to fifth generations feeding different concentrations of diets with Bt toxin

代次Generation處理/μg·g-1Treatment飛行速度/km·h-1Averagespeed飛行時間/hFlighttime飛行距離/kmFlightdistanceF10(1.37±0.30)a(2.86±1.10)a(4.64±0.77)a5(1.02±0.01)a(2.52±0.82)a(2.91±0.25)b10(1.21±0.32)a(3.55±1.36)a(4.55±0.73)a20(1.12±0.31)a(2.44±0.59)a(2.59±0.32)bF20(1.26±0.08)a(3.48±0.79)a(5.13±1.02)a5(1.16±0.17)a(4.16±0.83)a(5.66±0.75)a10(1.87±0.97)a(1.38±0.55)b(4.37±1.09)a20(1.13±0.41)a(1.42±0.86)b(1.84±0.94)bF30(1.42±0.24)a(5.09±0.84)a(7.45±0.67)a5(1.11±0.10)a(3.52±0.66)b(4.74±0.96)bc10(1.12±0.23)a(4.06±0.75)ab(5.56±0.82)b20(1.12±0.17)a(3.09±0.67)b(3.86±0.89)cF40(1.00±0.23)a(2.68±0.45)b(2.97±0.78)b5(1.19±0.34)a(3.93±0.59)a(5.31±1.02)a10(1.02±0.20)a(2.32±0.99)b(2.13±1.10)bc20(0.88±0.05)a(1.53±0.38)b(1.14±0.75)cF50(0.97±0.33)b(0.96±0.65)b(1.18±0.69)b5(1.06±0.27)b(1.68±0.36)ab(2.32±0.50)a10(1.19±0.27)b(1.84±0.41)ab(2.06±0.40)ab20(1.80±0.38)a(2.36±0.46)a(2.54±0.43)a

1) 數字后不同小寫字母示同代、同列間差異顯著(P<0.05)。 Different lowercase letters in the same generation and same column indicate significant difference(P<0.05).

2.2 相同濃度Cry1Ac處理條件下產卵蛾和處女蛾飛行力比較

研究發現,同一世代取食同一濃度人工飼料的甜菜夜蛾處女蛾與已產卵雌蛾的平均飛行速度、飛行時間和飛行距離大多沒有顯著差異(表2)。由此說明,在研究不同濃度Cry1Ac處理對甜菜夜蛾飛行力的影響時,無論用產卵蛾還是處女蛾,對研究結論沒有太大影響。

3 結論與討論

甜菜夜蛾現已成為長江中下游地區棉花、蔬菜等作物上的重要害蟲,一旦暴發,對這些作物產量和品質的影響將是災難性的。它又是一種間歇性遷飛性害蟲,食料等條件將會影響該蟲的飛行時間與距離等。為此,本文模擬轉基因棉花葉片中的Cry1Ac含量,探討低濃度Cry1Ac殺蟲蛋白連續刺激后對甜菜夜蛾飛行力的影響。結果表明:低濃度Bt毒素對甜菜夜蛾飛行力的影響以及該蟲對毒蛋白的響應呈現多代效應,經歷了對Bt毒素敏感、逐步適應到最終適應幾個階段。一方面說明了低濃度Cry1Ac殺蟲蛋白對某種昆蟲的影響需要多個世代的連續觀測,另一方面也提示研究外在因素對昆蟲的影響僅做一、二個世代有時是不夠的。當然,需要做多少世代才能闡明昆蟲對某些因素的穩定響應還需要深入研究;同時,外在影響因子與昆蟲種類甚多,這方面的探討也需要做大量、長期的工作。

表2 同一世代取食同一濃度Cry1Ac飼料后產卵蛾與處女蛾飛行力的比較1)

Table 2 Comparison of flight performance of virgin and egg-layingSpodopteraexiguaadults feeding the same concentration of diets with Bt toxin and in the same generation

世代Generation檢測指標Index對照CK產卵蛾Egg-layingadult處女蛾Virginadult5μg/g產卵蛾Egg-layingadult處女蛾Virginadult10μg/g產卵蛾Egg-layingadult處女蛾Virginadult20μg/g產卵蛾Egg-layingadult處女蛾VirginadultF1平均速度Averagespeed(1.93±0.61)a(1.37±0.30)a(0.74±0.16)b(1.02±0.01)a(1.17±0.31)a(1.21±0.32)a(0.88±0.06)a(1.12±0.31)a飛行時間Flighttime(4.63±0.24)a(2.86±1.10)a(3.69±0.67)a(2.52±0.82)a(2.42±0.35)a(3.55±1.36)a(2.21±0.86)a(2.44±0.59)a飛行距離Flightdistance(4.54±0.86)a(4.64±0.77)a(3.09±0.69)a(2.91±0.25)a(3.33±1.05)a(4.55±0.73)a(2.35±0.71)a(2.59±0.32)aF2平均速度Averagespeed(1.24±0.15)a(1.26±0.08)a(1.20±0.31)a(1.16±0.17)a(0.80±0.13)a(1.87±0.97)a(1.11±0.28)a(1.13±0.41)a飛行時間Flighttime(3.51±0.28)a(3.48±0.79)a(1.66±0.83)b(4.16±0.83)a(2.61±0.58)a(1.38±0.55)a(2.63±0.70)a(1.42±0.86)a飛行距離Flightdistance(4.68±0.31)a(5.13±1.02)a(2.40±0.86)b(5.66±0.75)a(2.83±0.63)a(4.37±1.09)a(3.29±0.19)a(1.84±0.94)aF3平均速度Averagespeed(1.43±0.23)a(1.42±0.24)a(0.95±0.35)a(1.11±0.10)a(1.08±0.53)a(1.12±0.23)a(1.05±0.03)a(1.12±0.17)a飛行時間Flighttime(4.49±0.61)a(5.09±0.84)a(3.88±0.86)a(3.52±0.66)a(2.74±0.68)a(4.06±0.75)a(2.20±0.30)a(3.09±0.67)a飛行距離Flightdistance(6.88±0.39)a(7.45±0.67)a(4.45±0.87)a(4.74±0.96)a(3.50±0.38)b(5.56±0.82)a(2.55±0.27)a(3.86±0.89)aF4平均速度Averagespeed(1.13±0.43)a(1.00±0.23)a(0.90±0.26)a(1.19±0.34)a(0.94±0.35)a(1.02±0.20)a(1.06±0.31)a(0.88±0.05)a飛行時間Flighttime(2.37±0.84)a(2.68±0.45)a(2.97±1.00)a(3.93±0.59)a(3.20±0.85)a2.32±0.99a(3.18±1.00)a(1.53±0.38)a飛行距離Flightdistance(2.01±0.81)a(2.97±0.78)a(3.59±0.41)a(5.31±1.02)a(3.78±0.64)a(2.13±1.10)a(3.82±0.79)a(1.14±0.75)bF5平均速度Averagespeed(1.16±0.18)a(0.97±0.33)a(1.18±0.33)a(1.06±0.27)a(1.21±0.32)a(1.19±0.27)a(1.59±0.25)a(1.80±0.38)a飛行時間Flighttime(1.82±0.53)a(0.96±0.65)a(1.99±0.82)a(1.68±0.36)a(2.24±0.19)a(1.84±0.41)a(2.56±0.79)a(2.36±0.46)a飛行距離Flightdistance(2.39±0.81)a(1.18±0.69)a(2.63±0.89)a(2.32±0.50)a(2.70±0.33)a(2.06±0.40)a(2.81±0.75)a(2.54±0.43)a

1) 數字后相同小寫字母示同代、同處理產卵蛾與處女蛾間無顯著差異(P>0.05)。 The same lowercase letters between egg-laying and virgin adults in the same generation and same treatment indicate no significant difference (P>0.05).

江幸福等曾以含有較高劑量Bt毒素(25、50、100 μg/g等)的飼料飼養甜菜夜蛾,發現濃度低于50 μg/g處理甜菜夜蛾,其飛行力有增強趨勢,但當濃度達到一定水平后(100 μg/g和200 μg/g)則對飛行力有抑制作用[8]。Chen等曾系統測定過幾種不同轉基因棉花體內各生育期葉片中的Bt毒素含量,發現棉花苗期至現蕾期體內的Bt毒蛋白含量最高,花鈴期次之,吐絮期更低[10]。在長江黃河流域,甜菜夜蛾的發生主要是在棉花生長的中后期[13]。這也是本文設計較低濃度的Cry1Ac劑量處理甜菜夜蛾的依據。當然基因類型不同的棉花品種間Bt毒素的含量差異較大,這方面還有大量的問題需要探索。

張小麗等曾用轉Bt基因棉‘國抗22’及其親本對照‘泗棉3號’和轉Bt + CpTI基因棉‘SGK321’及其親本對照‘石遠321’的成熟葉片,連續飼養甜菜夜蛾種群3個世代。結果發現,隨著取食轉基因棉花時間的延長,甜菜夜蛾種群的趨勢指數(I值)越來越大。這說明轉基因棉花對甜菜夜蛾的刺激似乎存在累積效應[9]。本研究也發現,隨著含低濃度Bt毒素飼料飼養甜菜夜蛾代數的增加,飛行力也呈逐漸增強趨勢。由此可見低濃度的毒蛋白刺激對該害蟲種群增長的影響和對飛行力的影響有一致性。不過,經Bt毒素刺激后甜菜夜蛾1～5代的飛行力沒有按設計濃度與代次呈現出線性的升高或降低,以及及第5代對照種群的各參數比處理種群的相應參數要低,其機理還有待深入研究。

研究發現,大多數遷飛性昆蟲的飛翔力在卵巢發育中期最強,尤其是卵巢開始發育后的3～5 d。通過長距離遷飛(移),其卵巢發育逐步完成,并實施交尾與產卵[14]。本研究亦以處女蛾為材料,系統研究低濃度的Cry1Ac毒蛋白連續刺激對其飛翔力的影響。因此其結果更能反映遷飛性昆蟲的一些特征。本文也探討了產卵蛾與處女蛾在飛行時間與距離等方面對Cry1Ac毒蛋白的響應,結果表明,用處女蛾還是已經交配產卵的雌蟲測定其遷飛能力，兩者差異不甚明顯。由此說明，Cry1Ac毒蛋白對甜菜夜蛾遷飛性的影響與該蟲的成熟度關系不大。

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(責任編輯：田 喆)

Effects of low concentration of Bt toxin on flight ability ofSpodopteraexigua

Cai Wenchen, Su Honghua, Chen Ling, Zhou Hao, Yang Yizhong

(CollegeofHorticultureandPlantProtection,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

The effects of low concentration of Bt toxin on flight speed, flight time and flight distance of virgin and egg-laying adults were examined by adding Bt toxin to the artificial diets (0, 5, 10 and 20 μg/g) and feeding larvae with different diets for 5 generations. The results showed that, in F1generation, the flight distance of adult in CK group was significantly longer than in 20 μg/g treatment; in the F2and F3generations, flight performance was enhanced after fed with low concentration of Bt toxin (5-10 μg/g), while high concentration of Bt toxin (20 μg/g) inhibited flight of adults. In addition, there were significant differences in flight time and flight distance among different treatments. In F4generation, flight ability of virgin adult started to increase, especially for the treatment with low concentration of Bt toxin (5 μg/g), the flight time and flight distance were significantly higher than those of the control, and significantly and extremely significantly higher than those of the other two treatments. There were significant difference in flight time and flight distance among different treatments. In F5generation, after Bt treatments flight ability were all stronger compared to the control, and there were significant differences in flight speed, flight time and flight distance among all treatments. In this research, virgin and egg-laying females both had similar responses to low concentration of Bt toxin. The study indicates that exact influences of Bt toxin on insect flight should be investigated for multi-generations.

Cry1Ac toxin;Spodopteraexigua; flight ability; response

2016-08-22

2016-09-12

轉基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08012004,2016ZX08012004-010)

S 433.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.012

* 通信作者 E-mail:yzyang@yzu.edu.cn