蓖麻提取液對甜菜夜蛾幼蟲解毒酶活性的影響

化麗丹, 蔣杰賢, 季香云*, 萬年峰, 張 浩, 楊益眾

(1. 上海市農業科學院生態環境保護研究所, 上海 201403; 2. 江蘇省泰州出入境檢驗檢疫局, 泰州 225300; 揚州大學園藝與植物保護學院, 揚州 225009)

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蓖麻提取液對甜菜夜蛾幼蟲解毒酶活性的影響

化麗丹1,2, 蔣杰賢1, 季香云1*, 萬年峰1, 張 浩1, 楊益眾3

(1. 上海市農業科學院生態環境保護研究所, 上海 201403; 2. 江蘇省泰州出入境檢驗檢疫局, 泰州 225300; 揚州大學園藝與植物保護學院, 揚州 225009)

為探討植物提取液對甜菜夜蛾解毒酶系活性的影響效應,采用浸漬法測定了不同濃度蓖麻堿 (3.80、1.90、0.95、0.48和0.24 g/L)對甜菜夜蛾幼蟲堿性磷酸酯酶(AKP)、酸性磷酸酯酶(ACP)和谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)活性的影響。結果表明：與清水對照組相比,不同濃度處理48 h和72 h對AKP的抑制作用均達到顯著水平,而3.80 g/L處理24 h即可顯著抑制AKP活性;與對照組相比,不同濃度蓖麻堿處理72 h均會顯著降低其ACP活性,而濃度大于0.24 g/L時處理24 h和48 h即可顯著降低 ACP活性;蓖麻堿處理組GSTs活性在處理后24、48和72 h都顯著低于對照組,但不同濃度間無顯著差異;本研究揭示了蓖麻堿對這3種解毒酶均有較強的抑制作用,且抑制作用隨蓖麻堿濃度升高和作用時間延長而增強。

蓖麻堿; 甜菜夜蛾; 幼蟲; 解毒酶; 抑制作用

蓖麻Ricinuscommunis屬大戟科蓖麻屬植物,具有較強的殺蟲、殺菌作用,是制造生物農藥的重要來源[1-3]。蓖麻堿是蓖麻的主要毒素之一,具有較強的殺蟲活性,其對蚜蟲[4]、菜青蟲[5]、甜菜夜蛾[6]、小菜蛾[7]和金龜甲[8]等害蟲的殺蟲作用已有報道。甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)屬鱗翅目夜蛾科害蟲,主要為害大豆、棉花、玉米、十字花科蔬菜和茄科植物[9],利用蓖麻堿防治甜菜夜蛾的作用機制的相關研究還鮮見報道。

蓖麻堿作用于昆蟲的組織和器官,影響其解毒酶活性。酸性磷酸酯酶(ACP)、堿性磷酸酯酶(AKP)和谷胱甘肽S-轉移酶(GSH-S)是昆蟲體內重要的解毒代謝酶,在殺蟲劑及植物次生物質代謝中具有重要的作用[10-12]。本研究以甜菜夜蛾為對象,從生化水平探討蓖麻堿對甜菜夜蛾幼蟲體內解毒酶的影響,以期為進一步揭示蓖麻堿殺蟲機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試蟲源

甜菜夜蛾卵塊采自上海市奉賢區青村農業合作社的甘藍地,在人工氣候箱(28±1℃、L∥D=14 h∥10 h、RH=80%±5%)中用人工飼料連續飼養7～9代。在培養箱中飼養甜菜夜蛾化蛹后,將蛹放置到羽化籠中。等成蟲羽化后,用10%的蜂蜜水補充營養,雌、雄甜菜夜蛾成蟲交配產卵后,將卵塊孵化后的幼蟲飼養至2齡末用于試驗。

1.1.2 供試藥劑

蓖麻堿由華東理工大學分析與測試中心從蓖麻餅粕中提取、分離并純化,其有效成分含量≥99.8%。

1.2 試驗方法

1.2.1 試蟲處理方法

參照Ismail和Wright[13-14]的葉片藥劑浸漬法。取新鮮干凈的甘藍葉片,在不同濃度(3.80、1.90、0.95、0.48、0.24 g/L)的蓖麻堿溶液中分別浸漬10 s,室內自然晾干,放置于直徑為12 cm的潔凈培養皿中,將中性濾紙鋪于培養皿底部,每個培養皿接入大小一致的甜菜夜蛾2齡末幼蟲50頭,以清水作對照,每個處理和對照重復3次。分別于24、48、72 h后收集活蟲供酶源制備。

1.2.2 酶源的制備

取供試幼蟲置于玻璃勻漿器中,按3齡10頭/mL,4齡4頭/mL(緩沖溶液大致為試蟲體重9倍),加入預冷緩沖液,其中谷胱甘肽S-轉移酶的制備用0.04 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液;酸性磷酸酯酶(ACP)的制備用0.2 mol/L pH 4.6醋酸緩沖液;堿性磷酸酯酶(AKP)的制備用0.05 mol/L pH 10.0 碳酸鈉緩沖液,冰浴下勻漿,勻漿液倒入離心管內,4℃下8 000 r/min離心10 min,上清液即為酶液,置于-20℃冰箱待用[15-17]。

1.2.3 酶活性測定[10]

1.2.3.1 酸性磷酸酯酶(ACP)和堿性磷酸酯酶(AKP)活性測定

酸性和堿性磷酸酯酶分解磷酸苯二鈉,產生游離酚和磷酸,酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用,經鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物,根據紅色深淺測定酶活性的高低[18]。試驗采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行。在37℃條件下,以每克甜菜夜蛾幼蟲組織勻漿與基質作用15 min產生1 mg酚為一個酶活力單位,每個處理重復3次。

酸性磷酸酶(ACP)計算公式：

酸性磷酸酶活性(U/g)=測定管吸光度/標準管吸光度×標準管含酚的量(0.003 mg)/所加樣本的蛋白克數；

堿性磷酸酶(AKP)計算公式：

堿性磷酸酶活性(U/g)=(測定孔吸光度-空白孔吸光度)/(標準孔吸光度-空白孔吸光度)×酚標準品濃度(0.1 mg/mL)/待測樣本蛋白濃度(g/mL)。

1.2.3.2 谷胱甘肽S-轉移酶(GST)活性測定

谷胱甘肽S-轉移酶具有催化還原型谷胱甘肽與1-氯-2,4-二硝基苯結合的能力,在一定反應時間內,其活性高低與反應前后底物濃度的變化呈線性關系。通過谷胱甘肽濃度的高低來反映谷胱甘肽S-轉移酶活性的大小,谷胱甘肽濃度降低越多,則谷胱甘肽S-轉移酶活性越大,反之則小。活性測定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進行。以每克甜菜夜蛾組織勻漿在37℃反應1 min后,扣除非酶促反應,使反應體系中GSH濃度降低為1 μmol/L為一個酶活力單位。每個處理重復3次。谷胱甘肽-S轉移酶計算公式：

組織中的GST活力(U/mg)=

(對照管OD值-測定管OD值)/(標準管OD值-

空白管OD值)×標準濃度×稀釋倍數/

反應時間/(取樣量×蛋白濃度)。

1.2.4 蛋白質含量測定方法

蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍G250法[19]。

1.3 數據處理

數據經Excel2007整理后,用SPSS16.0軟件,用Tukey’sHSD多重比較法比較不同濃度蓖麻提取液處理的甜菜夜蛾在處理后不同時間內解毒酶活性在5%水平上的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 蓖麻堿對甜菜夜蛾幼蟲體內堿性磷酸酯酶活性的影響

由表1可知,蓖麻堿對甜菜夜蛾幼蟲體內堿性磷酸酯酶具有較強的抑制作用,且蓖麻堿濃度越高,其對堿性磷酸酯酶的抑制作用越強。蓖麻堿作用于甜菜夜蛾時間越長,對幼蟲體內的堿性磷酸酯酶抑制作用也越強。蓖麻堿濃度低于1.90g/L時,其處理24h對幼蟲體內堿性磷酸酯酶的抑制作用不顯著,但5種濃度處理48h和72h對幼蟲體內的堿性磷酸酯酶的抑制作用均達到顯著水平。

表1 蓖麻堿對甜菜夜蛾幼蟲體內堿性磷酸酯酶活性的影響1)

Table 1 Effect of ricinine on the activity of AKP inSpodopteraexigualarvae

處理濃度/g·L-1Concentration堿性磷酸酯酶活性/U·g-1 Activityofalkalinephosphatase24h48h72h3.80(0.135±0.027)bA(0.039±0.008)bB(0.003±0.0062)cC1.90(0.141±0.057)abA(0.044±0.022)bB(0.003±0.0010)bcC0.95(0.142±0.043)abA(0.046±0.014)bB(0.004±0.0020)bC0.48(0.156±0.024)aA(0.050±0.019)bB(0.005±0.0033)bC0.24(0.160±0.018)aA(0.054±0.021)bB(0.006±0.0024)bC0(CK)(0.174±0.012)aA(0.155±0.040)aA(0.159±0.0030)aA

1) 表中數據為平均數±標準誤;同列數據標有不同小寫字母表示差異顯著,同行數據不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。 The data were presented as mean±SE. The data in same column followed with different lowercase letters were significantly different, and the data in same row followed with different capital letters were significantly different (Tukey’s HSD test,P<0.05),The same apllies below.

2.2 蓖麻堿對甜菜夜蛾幼蟲體內酸性磷酸酯酶活性的影響

由表2可知,蓖麻堿對甜菜夜蛾幼蟲體內酸性磷酸酯酶具有較強的抑制作用,且這種抑制作用隨蓖麻堿濃度升高和蓖麻堿作用時間延長而增強。與清水對照組相比,不同濃度蓖麻堿處理24 h和48 h,除0.24 g/L蓖麻堿對酸性磷酸酯酶的抑制作用不顯著外,其他4種濃度處理均對酸性磷酸酯酶的活性有顯著抑制作用;5種蓖麻堿濃度處理72 h對幼蟲體內的酸性磷酸酯酶的抑制作用都達到顯著水平。

表2 蓖麻堿對甜菜夜蛾幼蟲體內酸性磷酸酯酶活性的影響

Table 2 Effect of ricinine on the activity of ACP inSpodopteraexigualarvae

處理濃度/g·L-1Concentration酸性磷酸酯酶活性/×102U·g-1 Activityofacidphosphatase24h48h72h3.80(0.302±0.001)cA(0.200±0.010)cB(0.025±0.001)cC1.90(0.402±0.002)cA(0.220±0.001)cB(0.031±0.001)cC0.95(0.535±0.002)bcA(0.430±0.001)bA(0.041±0.001)cB0.48(0.620±0.001)bA(0.450±0.004)bA(0.054±0.003)cB0.24(0.930±0.001)aA(0.840±0.001)aA(0.067±0.001)bB0(CK)(0.970±0.002)aA(0.920±0.001)aA(0.860±0.001)aA

2.3 蓖麻堿對甜菜夜蛾幼蟲體內谷胱甘肽S-轉移酶活性的影響

由表3可知,谷胱甘肽S-轉移酶活性隨蓖麻堿濃度增大而降低,不同濃度蓖麻堿處理24、48和72 h,甜菜夜蛾幼蟲體內谷胱甘肽S-轉移酶活性均顯著低于對照。相同濃度處理下,隨著作用時間延長蓖麻堿對谷胱甘肽S-轉移酶活性的抑制作用也增強,表現為谷胱甘肽S-轉移酶活性降低。但5種蓖麻堿濃度處理無顯著差異。

表3 蓖麻堿對甜菜夜蛾幼蟲體內谷胱甘肽S-轉移酶活性的影響

Table 3 Effect of ricinine on the activity of GSTs inSpodopteraexigualarvae

處理濃度/g·L-1Concentration谷胱甘肽S-轉移酶活性/U·g-1 ActivityofglutathioneS-transferase24h48h72h3.80(1.970±0.188)bA(0.855±0.144)bB(0.365±0.234)bC1.90(1.990±0.361)bA(0.991±0.098)bB(0.620±0.054)bC0.95(2.074±0.106)bA(1.050±0.332)bB(1.140±0.216)bB0.48(2.454±0.120)bA(1.201±0.106)bB(1.170±0.083)bB0.24(2.977±0.335)bA(1.495±0.156)bB(1.190±0.159)bC0(CK)(18.580±0.181)aA(17.820±0.045)aA(19.550±0.285)aA

3 小結與討論

昆蟲解毒酶系的誘導作用是對內源和外源有毒物質的一種適應。各種外源化合物誘導昆蟲的解毒酶系活性,這保證了昆蟲在受到化學環境壓力作用下迅速作出反應,從而存活下來。昆蟲體內解毒酶主要包括各種酯酶(羧酸酯酶、磷酸酯酶等)、谷胱甘肽S-轉移酶及微粒體多功能氧化酶系[20]。

昆蟲體內解毒酶系活性的變化,是昆蟲對化學藥劑敏感性產生變化的重要原因之一,也是衡量植物抗蟲性的重要指標之一[21]。研究表明,殺蟲劑經過滲透、運輸、分配到達昆蟲體內后,一部分被體內解毒酶轉化分解,另一部分到達作用位點殺滅害蟲[22]。谷胱甘肽S-轉移酶、磷酸酯酶是昆蟲體內重要的解毒酶系,在對外源化合物的解毒代謝和對殺蟲劑的抗性機制中起著重要的作用[23],解毒酶的活性變化可能改變其對殺蟲劑的敏感型[24]。

劉進進等[3]研究報道,蓖麻堿藥液對甜菜夜蛾具有優良的毒殺效果,其死亡率與施藥時間呈正相關;謝宏峰等[25]發現蓖麻葉片粗提物對甜菜夜蛾幼蟲在一定濃度范圍內具有一定的拒食作用,濃度越大拒食作用越強;并且對甜菜夜蛾幼蟲還具有一定胃毒作用，毒殺作用隨著粗提物濃度提高而加強。萬年峰等[4]發現當歸和蓖麻提取液亞致死劑量對甜菜夜蛾生長發育和繁殖有一定的抑制作用,且亞致死劑量濃度越大,對甜菜夜蛾生長發育和繁殖影響越大。而在本研究中,甜菜夜蛾幼蟲體內谷胱甘肽S-轉移酶和磷酸酯酶活性隨蓖麻堿作用時間延長而逐漸下降,這可能是造成甜菜夜蛾在藥劑處理后死亡的主要原因。同時,蓖麻堿作用24 h對甜菜夜蛾幼蟲體內堿性磷酸酯酶的抑制作用不顯著,但作用48 h和72 h對其抑制作用非常顯著,這可能是因蓖麻堿到達蟲體后,部分被幼蟲體內的堿性磷酸酯酶轉化分解,但隨著蓖麻堿作用時間延長,幼蟲體內的堿性磷酸酯酶減少,而大部分蓖麻堿可以到達作用位點,對蟲體起到較強的毒殺作用,這也解釋了某些殺蟲劑對昆蟲的毒殺作用與其對昆蟲的作用時間呈正比的原因。不同解毒酶分解轉化有毒物質的能力有一定差別[24,26];甜菜夜蛾經5種濃度蓖麻堿處理后,其谷胱甘肽S-轉移酶活性都受到顯著抑制,而較高濃度處理后其堿性磷酸酯酶活性才受到顯著抑制。蓖麻堿處理后甜菜夜蛾體內解毒酶活性的變化,在一定程度上驗證了不同濃度的蓖麻堿藥液處理甜菜夜蛾后,隨著藥液濃度的增加和處理時間的延長,對甜菜夜蛾的生長發育和繁殖影響增大,在達到致死濃度劑量時,其死亡率隨著藥液濃度的增大和處理時間的延長,死亡率升高。

蓖麻堿濃度對解毒酶活性的影響較大,且其濃度越大對解毒酶活性的抑制能力越強。與清水對照組相比,0.24和0.48 g/L兩種濃度處理24 h對甜菜夜蛾堿性磷酸酯酶活性無顯著影響,但高于這兩種濃度處理24 h后顯著抑制其堿性磷酸酯酶活性。

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(責任編輯：田 喆)

Effect of ricinine on the activities of detoxifying enzymes inSpodopteraexigualarvae

Hua Lidan1,2, Jiang Jiexian1, Ji Xiangyun1, Wan Nianfeng1, Zhang Hao1, Yang Yizhong3

(1.InstituteofEco-EnvironmentProtection,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201403,China; 2.TaizhouEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Taizhou225300,China; 3.CollegeofHorticultureandPlantProtection,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

To investigate the effect of plant extracts on the detoxifying enzymes of noctuid, we used the dipping method to determine the effects of the five different concentrations of ricinine (3.80、1.90、0.95、0.48 and 0.24 g/L) on alkaline phosphatase (AKP), acid phosphatase (ACP) and glutathioneS-transferase (GSTs). The results indicated that compared to the control group (fresh water treatment), the treatment of ricinine significantly inhibited the activities of AKP at 48 and 72 h after; while the treatment of 3.80 g/L of ricinine could inhibit the activity of AKP at 24 h post treatment. The activities of ACP were also significantly inhibited in all five ricinine-treated groups at 72 h after treatment, while the treatments with concentrations higher than 0.24 g/L significantly inhibited the activity of ACP at 24 and 48 h after treatment. The activities of GSTs were all significantly inhibited in all treatments compared to that of the control, but no difference was found among treatments of different concentrations. These results indicated that ricinine had a strong inhibitory effect on the three enzymes tested and the inhibition were concentration- and time-dependent.

ricinine;Spodopteraexigua; larvae; detoxifying enzymes; inhibition effect

2016-11-29

2017-02-21

上海市科技興農推廣項目[滬農科推字(2016)第2-2-8號];上海市科技興農重點攻關項目[滬農科攻字(2016)第3-4-2號]

S 482.39

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.015

* 通信作者 E-mail：hwfy2002@163.com