兩種板栗重要蛀果象甲鑒別研究

肖云麗, 張 帆, 徐艷霞, 鐘玉林

(經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室,大別山特色資源開發湖北省協同創新中心,黃岡師范學院生命科學學院, 黃岡 438000)

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兩種板栗重要蛀果象甲鑒別研究

肖云麗, 張 帆, 徐艷霞, 鐘玉林*

(經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室,大別山特色資源開發湖北省協同創新中心,黃岡師范學院生命科學學院, 黃岡 438000)

栗雪片象NiphadescastaneaChao和栗實象CurculiodavidiFairmaire幼蟲形態相似,均蛀食板栗果實,是嚴重影響板栗產量或質量的重要害蟲。為快速準確地鑒別這兩種害蟲,采用野外調查法和室內飼養法,對兩種蛀果象甲的形態學和生態學特性進行了觀察描述;同時對基于線粒體COⅠ基因片段的DNA條形碼序列進行了提取擴增與分析。結果表明:栗雪片象和栗實象在成蟲形態、為害特性和生活習性上差異明顯; DNA條形碼序列(COⅠ基因5′端684 bp)可作為兩種板栗蛀果象甲鑒定的分子標記,兩者具有明顯的堿基差異,遺傳距離達18.9%～19.6%,在系統發育關系上,栗雪片象與Molytinae亞科的Niphadomimussp. 聚為一支,栗實象與Curculio屬3個種聚為一支。研究結果可為兩種板栗蛀果象甲幼蟲的鑒別提供可靠依據,為象甲科昆蟲的進一步研究提供形態、生態和分子證據。

板栗雪片象; 栗實象; 形態特征; 為害特性; 生活習性; DNA條形碼序列; COⅠ基因

板栗CastaneamollissimaBlume為山毛櫸科栗屬植物,是我國栽培最早的經濟樹種和重要干果之一,主要生長或栽培于山地、丘陵地帶,地理環境復雜,植食性昆蟲的種類也非常豐富。近年來,不少學者對我國各地板栗害蟲進行了調查研究,共計10目118科818種[1-3]。其中蛀果象甲栗雪片象NiphadescastaneaChao和栗實象CurculiodavidiFairmaire廣泛分布于我國各板栗生產區,在長期的進化過程中,其形態、生理和生態習性等與寄主植物板栗高度適應,在栗果膨脹期和栗果成熟期前后以特定的方式致使板栗提前落果,蛀食栗果并滋病腐爛,在不少板栗產區猖獗為害,成為嚴重影響板栗產量和質量的重要害蟲[4-5]。如在湖北省羅田縣栗園,栗實象和栗雪片象致栗果被害率達20%～60%[5-6]。

栗雪片象和栗實象隸屬鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae。象甲科是動物界最大的科之一,世界已記載5萬種,分布遍及全球[7],主要為害花木果樹,幼蟲鉆入植物的根、莖、葉或谷粒、豆類中蛀食,是經濟作物上的大害蟲,但幼蟲均體色單一,乳白色或黃白色,軀體通常呈“C”形彎曲,難以鑒別。栗雪片象和栗實象常共同分布于我國板栗生產區,幼蟲均蛀食栗果,本研究主要對這兩種板栗蛀果象甲的成蟲、幼蟲的形態學和生活習性進行了詳細描述,同時基于COⅠ基因片段序列,對兩種蛀果象甲的DNA條形碼序列進行了比較分析,研究結果可望為兩種板栗蛀果象甲的快速、準確鑒定提供技術支持,為形態和分子系統發育研究提供更多證據,具有一定的理論意義和實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

栗雪片象和栗實象成蟲于發生期在栗園通過搜捕法獲得。于栗果膨脹期撿拾板栗落果,解剖獲取板栗雪片象幼蟲(落果撿回室內飼養獲取部分成蟲);于板栗采收后撿拾出果幼蟲,獲取栗實象幼蟲(帶回室內飼養獲取部分成蟲)。幼蟲樣品浸泡在100%乙醇中常溫保存用于DNA提取備用。所有照片均由佳能單反相機(Canon EOS 70D)拍攝。

1.2 方法

1.2.1 昆蟲基因組的DNA提取

樣品預處理:將無水乙醇浸制幼蟲標本置于裝有無菌水的離心管中浸泡3 h,其間更換無菌水3次,更換前用超聲波清洗器清除表面污物,每次30 s。

按DNA提取試劑盒E.Z.N.A.Insect DNA Kit試劑盒操作方法提取栗雪片象和栗實象幼蟲(取胸腹部3～4 mm長表皮)基因組DNA。

1.2.2 DNA條形碼片段PCR擴增與測序

以動物DNA條形碼通用引物LCO1490:5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′為上游引物,HCO2198:5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′為下游引物,擴增DNA條形碼COⅠ基因5′ 端片段[8],引物由武漢金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR擴增采用50 μL反應體系:PremixTaq25 μL,模板DNA 3 μL,上下游引物各1.5 μL,加ddH2O至50 μL。PCR反應程序設定為:94℃預變性2 min;94℃變性30 s,58℃退火40 s,72℃延伸2 min,反應重復1次,35個循環;72℃延伸10 min后4℃(或10℃)保存。擴增產物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,將檢測合格的樣品送交上海生工生物公司武漢分公司進行雙向測序。

1.2.3 序列數據分析

利用SeqMan軟件對序列進行拼接和校正,結合Chromas 2.4軟件查看測序峰圖,進行人工修改,去掉前后峰圖不穩定的序列,保存為Fasta格式。在GenBank中進行Blast搜索比對,驗證是否為目標序列,并下載同源序列和外群序列。

利用MAGE 6.0 程序對DNA序列進行比對、遺傳距離分析和基于鄰接法(NJ)進行系統發育關系分析。

2 結果

2.1 兩種板栗蛀果象甲的形態學與生態學特性

2.1.1 栗雪片象形態學與生態學特性

形態特征:成蟲(圖1a)體長7.0～10.5 mm,暗褐色,被黃白色鱗片。頭部和喙散布粗刻點,喙黑色,較粗,喙與體長之比約為0.25∶1;觸角著生于喙端部1/3處,紅褐色,膝狀,11節,柄節約為觸角總長的1/2,末端3節棒狀。前胸黑色,寬略大于長,兩側拱圓,前后緣略突出,密被珠狀瘤,中間前半端有明顯的隆線。鞘翅淺黑褐色,密被黃白色鱗片,在基部2/3形成黃白色小斑點、端部1/3形成黃白色大斑;行紋窄淺,密具刻點,行間3、5、7各有一行較大的瘤。腹部和足密被黃白色毛狀鱗片,腿節端部1/3處鱗片密集成環,腿節后端1/3有一鈍齒。成熟幼蟲(圖1c～d)體長8.0～12.5 mm,乳白色,略呈C形彎曲。

主要為害時期及方式:栗仁形成期至膨大期;幼蟲蛀食果柄處栗苞致幼果脫落(圖1b,e),影響板栗產量。

生活習性:成蟲5月底開始在花絮、嫩芽和栗葉背面取食,后取食幼嫩栗苞或果柄,并產卵于栗苞上;成蟲具有假死習性,受到驚擾后立即落地不動,飛行能力較差,只能做短距離飛行。幼蟲先沿果柄蛀入栗苞內,蛀食栗苞并進一步蛀食栗仁,使其內充滿顆粒狀蟲糞,幼蟲在栗苞或栗果內(搗碎種皮呈絮狀)越冬化蛹(圖1b～d);1年1代。

圖1 栗雪片象Fig.1 Niphades castanea

2.1.2 栗實象形態學與生態學特性

形態特征:成蟲(圖2a～b)體長6.9～9.2 mm,體黑褐色。雌蟲喙與體長之比約為90∶82,雄蟲約為51∶72;觸角著生于喙基部1/2處(雄性)或1/3處(雌性),膝狀,11節,柄節約為觸角長的3/7,末端3節膨大呈球棒狀。前胸背板寬略大于長,被稀疏白色短毛,后緣外側具1條白色鱗片帶。鞘翅基部和外緣2/5處各具1條白色鱗片短橫帶,翅2/3處具1條白色鱗片長橫帶,從鞘翅縫基部至1/2處或延至后緣端部具1條不連續的縱向白色鱗片帶;腹板黑褐色,密被白色鱗片;足細而長,密被白色鱗毛,腿節近末端具1個寬而尖的齒,與脛節相扣夾持苞刺。幼蟲體長8.0～12.0 mm,乳白色,C形彎曲(圖2c)。

主要為害時期及方式:栗仁膨大期至成熟期前后;幼蟲蛀食栗仁和引發病菌感染(圖2c),影響板栗產量和質量。

生活習性:在羅田栗園,成蟲于7月底開始出現,一直持續到9月底板栗晚熟品種采收之后,具有假死習性,受到驚擾后立即落地不動,飛行能力較差,只能做短距離飛行。產卵時先用口器刺破栗苞與種皮后(圖2b),產卵1～3粒于栗仁內,幼蟲孵化后一直在取食栗仁,使栗果內充滿顆粒狀蟲糞,導致板栗失去食用價值,待幼蟲成熟后再破洞鉆出并入土越冬化蛹(圖2c～e);1～2年1代。

2.2 兩種板栗蛀果象甲COⅠ基因序列分析

2.2.1 目標序列的確定

兩種象甲的COⅠ基因的測序結果經拼接校對后,最后獲得5′端684 bp的片段序列,將校對序列在GenBank進行BLAST檢索,結果顯示,栗雪片象與同亞科Molytinae中Niphadomimussp.相似性達85%,栗實象與同屬的葉脈象Curculiovenosus、歐洲栗象C.elephas和錫金象C.sikkimensis相似性達89%～90%,可以確認試驗所得基因片段為目標序列。所有序列均提交至GenBank數據庫中,其中板栗雪片象的Accession登錄號為KX774484、KX774485、KX774486,分別來自LT15026、LT15027、LT15028幼蟲樣本;栗實象的Accession登錄號為KX774487、KX774488,分別來自LT15035、LT15036幼蟲樣本。

2.2.2 遺傳距離與系統發育分析

以步甲科達步甲Damastermirabilissimus和星步甲Calosomasp.為外群,利用MAGE6.0對兩種象甲的目標序列與GenBank數據庫中BLAST檢索所得的同源序列(表1)構建遺傳距離表(表2),并基于鄰接法(經Kimura-2距離校正,執行Bootstrap 1 000次)構建系統發育樹(圖3)。

圖2 栗實象Fig.2 Curculio davidi

物種Species科Family亞科SubfamilyGenBank登錄號GenBankaccessionno.NiphadescastaneaLT15026CurculionidaeMolytinae試驗獲取NiphadescastaneaLT15027CurculionidaeMolytinae試驗獲取NiphadescastaneaLT15028CurculionidaeMolytinae試驗獲取CurculiodavidiLT15035CurculionidaeCurculioninae試驗獲取C.davidiLT15036CurculionidaeCurculioninae試驗獲取Niphadomimussp.6VG-2014CurculionidaeMolytinaeKJ427737.1Niphadomimussp.3VG-2014CurculionidaeMolytinaeKJ427734.1Niphadomimussp.1VG-2014CurculionidaeMolytinaeKJ427749.1Artipussp.1AMV2011aCurculionidaeEntiminaeHQ891429.1CurculioelephasCurculionidaeCurculioninaeKM450966.1CurculiovenosusCurculionidaeCurculioninaeKM442627.1CurculiosikkimensisCurculionidaeCurculioninaeKC135935.1Lachnopussp.GZ12CurculionidaeEntiminaeKT350633.1Lachnopussp.4AMV2011dCurculionidaeEntiminaeHQ891469.1LachnopusseiniCurculionidaeEntiminaeHQ891465.1Baridinaesp.1ACP-2013CurculionidaeBaridinaeKF946344.1EucryptorrhynchusbrandtiCurculionidaeCryptorrhychinaeKR088970.1DamastermirabilissimusCarabidaeCarabinaeGQ344500.1Calosomasp.BYU-CO241CarabidaeCarabinaeGU176340.1

結果顯示,栗雪片象種內遺傳距離為0～0.3%,栗實象種內遺傳距離為0.2%,兩者種間遺傳距離為18.9%～19.6%,具有明顯的種間差異。板栗雪片象與Molytinae亞科的Niphadomimussp. 聚為一支,遺傳距離為17.0%～17.6%;4種Curculio象甲聚為一支,栗實象與Curculioelephas、C.venosus和C.sikkimensis的遺傳距離分別為12.1%～12.3%、10.7%～10.8%和12.1%～12.3%。

表2 基于COⅠ基因片段序列的種間遺傳距離

Table 2 Species genetic distances based on COⅠ gene segment sequences

12345678910111213141516171.Lachnopussp.GZ122.Baridinaesp.1ACP-20130.1993.Lachnopusseini0.1490.1934.Artipussp.1AMV2011a0.1720.1970.1475.Calosomasp.BYU-CO2410.2400.2270.2030.2126.Damastermirabilissimus0.2290.2350.2160.2020.1257.Curculioelephas0.2160.1640.2080.2120.2370.2618.Curculiovenosus0.2120.1580.1750.1890.2440.2550.1219.Curculiosikkimensis0.2180.1530.1930.2020.2430.2530.1460.12310.Niphadomimussp.1VG-20140.2000.1940.1980.1950.2320.2400.1800.1780.18611.Niphadomimussp.3VG-20140.2080.1780.1890.1820.2420.2390.1900.1720.1840.10712.Niphadomimussp.6VG-20140.2340.1840.2080.2030.2460.2710.2090.2050.2130.1310.11813.NiphadescastaneaLT150260.2000.1760.2140.1960.2550.2590.2080.2040.1900.1740.1760.17414.NiphadescastaneaLT150270.2000.1760.2140.1960.2550.2590.2080.2040.1900.1740.1760.1740.00015.NiphadescastaneaLT150280.1980.1720.2090.1940.2530.2570.2060.2040.1880.1720.1760.1700.0030.00316.CurculiodavidiLT150350.2180.1350.1720.1840.2370.2290.1210.1070.1210.1740.1920.1900.1940.1940.18917.CurculiodavidiLT150360.2200.1370.1740.1860.2390.2310.1230.1030.1230.1760.1940.1830.1960.1960.1910.002

圖3 基于COⅠ基因片段的NJ樹(經Kimura-2距離校正)Fig.3 NJ tree based on COⅠ gene segment sequences (Kimura-2 distance correction)

3 結論與討論

栗雪片象和栗實象幼蟲形態相似,均蛀食板栗果實,但兩者在成蟲形態、為害和生態習性上具有明顯的差異。

栗雪片象:成蟲體暗褐色,喙粗短,鞘翅基部2/3具黃白色小斑點、端部1/3具黃白色大斑;成蟲早在開花期羽化出土,卵產于果柄處栗苞內,幼蟲孵化后蛀食果柄處栗苞,引發板栗提前落果,有些隨后進一步鉆破果皮進入栗仁取食,幼蟲在果柄處栗苞或栗仁內越冬。

栗實象:成蟲體黑褐色,喙細長,鞘翅基部、外緣2/5處和翅2/3處具3條白色橫帶;成蟲于栗仁膨大期羽化出土,產卵于栗仁內,幼蟲孵化后取食栗仁,幼蟲成熟后在堅硬果皮上蛀一圓形孔洞,鉆出入土越冬。

有研究表明,栗實象在早期為害栗果往往引起栗果脫落,而在晚期受害果則不脫落[9-11],根據栗實象的為害特性,即成蟲產卵于栗實內、幼蟲在栗實內取食,并未妨礙營養物質及水分從果柄向栗苞運輸,栗苞及栗苞內果實仍可膨大生長,且栗實象羽化出土相對較晚。因此,早先報道栗果提前脫落可能是由栗雪片象幼蟲為害引起的,栗實象幼蟲是否引發栗果早期脫落有待進一步研究證實。

板栗雪片象和栗實象DNA條形碼序列(COⅠ基因5′端684 bp)的遺傳距離高達18.9%～19.6%,堿基差異明顯。板栗雪片象與Molytinae亞科的Niphadomimussp. 聚為一支,遺傳距離為17.0%～17.6%;栗實象與同屬的3種聚為一支,遺傳距離為10.6%～12.1%,具有較近的親緣關系,但在GenBank數據庫中未發現與兩種象甲遺傳距離更小的序列。目前,全世界已知象甲科昆蟲5萬種[7],但BOLD數據庫中僅記載象甲科昆蟲2 571個已命名種的DNA條形碼COⅠ基因片段序列[12],有待大量開展象甲科昆蟲的DNA條形碼序列研究,為象甲科害蟲尤其是幼蟲的快速準確鑒定提供技術支持。

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[12]DNA barcode of life data[DB/OL].BOLD, 2016, http:∥www.boldsystems.org.

(責任編輯：田 喆)

Discrimination of two chestnut fruit borer weevils (Coleoptera: Curculionidae)

Xiao Yunli, Zhang Fan, Xu Yanxia, Zhong Yulin

(HubeiKeyLaboratoryofEconomicForestGermplasmImprovementandComprehensiveUtilizationofResources,HubeiCollaborativeInnovationCenterfortheCharacteristicResourcesExploitationofDabieMountains,CollegeofLifeSciences,HuanggangNormalUniversity,Huanggang438000,China)

The larvae of two weevils,NiphadescastaneaChao andCurculiodavidiFairmaire, are similar in morphology, and both bore and feed chestnut fruits, seriously affecting the yield and quality of chestnut production. To identify these two pests quickly and accurately, the morphological and ecological characteristics of the two fruit borer weevils were described based on the field survey and indoor breeding method; at the same time, the DNA barcode,i.e., mitochondrial COⅠ gene fragment sequence, was analyzed. Obvious differences existed in adult morphology, damage characters and living habits betweenN.castaneaandC.davidi; the DNA barcode sequence of COⅠ gene fragment, as a molecular marker, could discriminate the two chestnut fruit borer weevils, with obvious difference among the 684 bp COⅠ gene fragment, and the genetic distance reached 18.9%-19.6%. In the phylogenetic tree,N.castaneawas clustered withNiphadomimussp., andC.davidiwas clustered withC.elephas,C.venosusandC.sikkimensis. These data provide a tool for distinguishing the two chestnut fruit borer weevils, and the morphological, ecological, and molecular evidences help for the further study of curculionidae insects.

Niphadescastanea;Curculiodavidi; morphological character; damaging character; living habit; DNA barcode sequence; COⅠ gene

2016-09-20

2016-11-29

湖北省教育廳科學研究項目(D20152904);湖北省自然科學基金項目(2015CFA158);湖北省重點實驗室項目(2013000703);湖北省協同創新中心創新團隊項目(2015TD06)

S 433.5

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.019

* 通信作者 E-mail: swzyl@hgnu.edu.cn