櫻桃褐斑病病原菌生物學特性及品種抗性評價

孫 楊, 付全娟, 孫玉剛, 魏國琴, 楊興華

(山東省果樹研究所, 泰安 271000)

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櫻桃褐斑病病原菌生物學特性及品種抗性評價

孫 楊, 付全娟, 孫玉剛, 魏國琴, 楊興華

(山東省果樹研究所, 泰安 271000)

研究了櫻桃褐斑病病原菌的生物學特性,評價了39個櫻桃品種對褐斑病田間抗病能力。結果表明,燕麥培養基和PCDA培養基最適于病菌生長;該病菌在10～35℃均能生長,25℃為最適生長溫度;葡萄糖和蛋白胨是適宜病菌生長的碳、氮源;病菌有較廣的酸堿度適應范圍,在pH4～12均能生長,在pH7條件下生長速度最快;不同光照條件下,黑暗時菌絲生長速度最快;分生孢子在10～35℃均能萌發,最適溫度為25℃;在pH7時分生孢子萌發率最高。不同櫻桃品種對褐斑病的抗病性存在差異,39個品種中高抗品種6個,抗病品種12個,中抗品種9個,感病品種8個,高感品種4個,無免疫品種。

櫻桃褐斑病; 核果釘孢菌; 生物學特性; 抗病性

櫻桃Prunusavium營養豐富,酸甜適口,素有“春果第一枝”的美譽[1]。近年來,櫻桃種植規模逐年擴大,櫻桃褐斑病的發生呈明顯加重趨勢,在山東[2]、陜西[3]、四川[4]等櫻桃主產區均有發生,嚴重制約櫻桃產業的發展,成為櫻桃生產上亟待解決的問題[5]。

櫻桃褐斑病發生嚴重時,多個病斑愈合,病斑干化造成葉片穿孔、提早脫落,光合效率下降,樹勢衰弱,抗寒性降低,導致翌年產量下降[6]。櫻桃褐斑病的病原菌為核果釘孢菌Passaloracircumscissa[7]。目前,國內外對櫻桃品種抗病性評價的文獻報道較少,而病原菌的生物學特性尚無研究報道,本研究對分離的核果釘孢菌,開展生物學特性研究,并對39個櫻桃品種進行了田間抗病性評價,旨在為病害的發生規律和綜合防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

于山東省果樹研究所天平湖實驗基地櫻桃園內采集病葉,用單孢分離法分離、純化菌株后,保存于山東省果樹研究所中心實驗室,備用。

1.1.2 供試培養基

櫻桃葉煎汁葡萄糖培養基(FcheDA)、燕麥培養基(OA)、玉米粉培養基(CMA)、櫻桃葉煎汁培養基(FcheA)、馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)、馬鈴薯蔗糖培養基(PSA)、馬鈴薯胡蘿卜葡萄糖培養基(PCDA)、V8培養基(V8汁200 g、CaCO33.0 g、瓊脂20.0 g、蒸餾水1 000 mL)、胡蘿卜葡萄糖培養基(CDA)、查氏培養基(Czapek)。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌生物學特性研究

1.2.1.1 不同培養基對菌絲生長的影響

以FcheDA、OA、CMA、FcheA、PDA、PSA、PCDA、V8、CDA、查氏10種培養基作為培養基質。將供試菌株在PDA平板培養15 d后,在菌落邊緣用無菌打孔器切取直徑5 mm的菌餅,接種到直徑9 cm的培養基平板中央,每皿放置1個菌餅(下同)。每處理3次重復。于25℃恒溫培養30 d,用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.1.2 不同碳源、氮源對菌絲生長的影響

以Czapek培養基為基礎培養基,將蔗糖分別用等量的葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、半乳糖、木糖置換,以無碳源的Czapek培養基為對照;將KNO3分別替換為蛋白胨、NaNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4、牛肉浸膏、酵母浸膏,以無氮源的Czapek為對照,將菌餅接種到不同碳、氮源培養基,每處理3次重復。于25℃恒溫培養30 d,用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.1.3 pH對菌絲生長的影響

用1 mol/L的HCl和NaOH將PDA培養基的pH調節至4、5、6、7、8、9、10、11、12共10個梯度。分別接種5 mm病原菌菌餅后25℃條件下恒溫培養30 d。用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.1.4 溫度對菌絲生長的影響

設定5、10、15、20、25、30、35℃共7個溫度梯度。在供試的PDA培養基上接種直徑5 mm的病原菌菌餅,在培養箱中連續培養30 d。每處理3次重復。用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.1.5 光照對菌絲生長的影響

設連續光照、L∥D=12 h∥12 h、連續黑暗3個處理。供試培養基為PDA培養基,將直徑5 mm的菌餅,接種于PDA培養基平板中央,25℃恒溫培養箱中培養30 d,十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.1.6 分生孢子懸液的制備

從櫻桃園采集具有典型癥狀的新鮮病葉,放入裝有冰袋的保鮮盒中帶回實驗室,用自來水將表面沖洗干凈后用滅菌的去離子水沖洗3遍,保濕。在10×4.5倍解剖鏡(Nikon)下用滅菌的解剖刀將分生孢子堆挑下,用無菌水配成孢子懸浮液,然后在10×10的低倍鏡(Leica)下檢查孢子數,用無菌水調節至20個孢子/視野。

1.2.1.7 溫度對分生孢子萌發的影響

采用凹載玻片萌發法,將調節好濃度的孢子懸液滴于載玻片上,將其放入墊有濕濾紙的培養皿內,分別置于5、10、15、20、25、30、35℃的培養箱內保濕培養,每處理3次重復,12 h后計數孢子總數和萌發孢子數,計算孢子萌發率。

1.2.1.8 pH對分生孢子萌發的影響

用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調節無菌水pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,配制孢子懸浮液,采用凹玻片萌發法,置于25℃條件下保濕培養,每處理3次重復,12 h后測定孢子萌發率。

1.2.2 品種抗病性評價

1.2.2.1 調查品種

櫻桃樹為位于山東省果樹研究所天平湖實驗基地內6年生嫁接品種,株行距為2 m×4.5 m,樹勢中庸。共調查39個品種。

1.2.2.2 調查方法

每個品種選擇3株長勢一致的植株,每株東南西北4個方向取200片葉,調查葉斑病發病情況并進行分級(表1),計算病情指數。

表1 櫻桃褐斑病葉部病斑分級標準

Table 1 The classification standards for cherry leaf spot

病級Grade分級標準Standard0無病斑1葉片病斑較少,病斑面積占整個葉面積的1%～10%3病斑較多,病斑面積占整個葉面積的11%～20%5病斑較多,病斑面積占整個葉面積的21%～30%7病斑多,病斑面積占整個葉面積的31%～50%9病斑多或融合成大斑,病斑面積占整個葉面積的50%以上

相對抗病指數=鑒定品種病情指數/對照品種病情指數(以病情指數最高的品種為對照品種)。

褐斑病發病程度按以下標準:“+”表示偶爾發生;“++”表示經常或局部發生;“+++”表示普遍發生;“++++”表示嚴重發生;“+++++”表示特別嚴重發生。

抗病性按以下標準:“xxxxx”表示抗病性高;“xxxx”表示抗病性較高;“xxx”表示抗病性一般;“xx”表示較感病;“x”表示易感病。

以病情指數為基礎,采用相對抗病性評價其抗病程度,根據相對抗病指數進行抗性劃分。抗性水平分為:免疫(I)為1.00、高抗(HR)為0.80～0.99、抗病(R)為0.70～0.79、中抗(MR)為0.50～0.69、感病(S)為0.30～0.49、高感(HS)為0～0.29。

1.2.3 數據分析方法

采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析。處理間差異顯著性分析(P<0.05)采用Duncan’s新復極差法。

2 結果與分析

2.1 病菌生物學特性

2.1.1 不同培養基對菌絲生長的影響

病原菌在不同培養基上均能生長,在燕麥培養基、PCDA培養基上生長速度最快,其次為PDA、查氏培養基,在玉米粉培養基、V8汁培養基上生長速度最慢(圖1)。

圖1 不同培養基上菌絲生長情況Fig.1 Effects of culture media on mycelial growth

2.1.2 不同pH對菌絲生長的影響

病原菌在pH 4～12的情況下均能生長,在pH為4時生長最慢,在pH為7時生長最快,在pH為6～9時均適合菌絲生長(圖2)。

圖2 不同pH條件下菌絲生長情況Fig.2 Effects of pH on mycelial growth

2.1.3 不同碳源對菌絲生長的影響

病原菌適宜碳源為葡萄糖、麥芽糖、蔗糖,最適碳源為葡萄糖、麥芽糖,不適宜碳源為甘露醇、木糖(圖3)。

圖3 不同碳源條件下菌絲生長情況Fig.3 Effects of carbon sources on mycelial growth

2.1.4 不同氮源對菌絲生長的影響

病原菌適宜氮源為牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏,最適氮源為牛肉浸膏、蛋白胨,在硫酸銨培養基中生長最為緩慢(圖4)。在無氮源生長條件下，菌絲生長稀疏，只有單根菌絲向外生長速度快，因此不作為最佳培養條件。

圖4 不同氮源條件下菌絲生長情況Fig.4 Effects of nitrogen sources on mycelial growth

2.1.5 不同溫度對菌絲生長的影響

隨著溫度的上升,菌絲生長速度呈先加快后減慢的趨勢,病原菌適宜生長溫度為25～30℃,35℃生長速度明顯減緩(圖5)。

圖5 不同溫度條件下菌絲生長情況Fig.5 Effects of temperature on mycelial growth

2.1.6 不同光照條件對菌絲生長的影響

在黑暗條件下,菌絲生長速度最快,在全光照條件下,菌絲生長速度最慢,與黑暗和光暗交替條件下相比,差異達到顯著水平(P<0.05)(圖6)。

圖6 不同光照條件下菌絲生長情況Fig.6 Effects of illumination on mycelial growth

2.1.7 不同溫度對孢子萌發率的影響

在10～35℃孢子均可萌發,隨著溫度的上升萌發率呈先上升后下降的趨勢,在25℃時萌發率最高(圖7)。

圖7 不同溫度條件下孢子的萌發率Fig.7 Effects of temperature on conidial germination rate

2.1.8 不同pH對孢子萌發率的影響

隨著pH的升高,孢子萌發率呈先升高后降低的趨勢,在pH為7時,萌發率達到最高值,隨后下降,在pH為12時,萌發率最低(圖8)。

圖8 不同pH條件下孢子的萌發率Fig.8 Effects of pH on conidial germination rate

2.2 品種抗性評價

以病情指數為基礎,采用相對抗病性方法評價其抗病程度,根據相對抗性指數進行抗性劃分。39個櫻桃品種的病情指數為7.6～62.9,平均為25.2;相對抗病指數為0～0.88,平均為0.60。病情指數是反映櫻桃品種抗病性差異的重要指標,按照病情指數、相對抗性指數的大小,可將39個品種的抗病性分為6級,即免疫(I)、高抗(HR)、抗病(R)、中抗(MR)、感病(S)、高感(HS)。39個櫻桃品種中無免疫品種,高抗品種為‘秦櫻’、‘重慶烏皮’、‘格拉斯’、‘櫻姬’、‘紅清’、‘Sir Douglas’;抗病品種為‘早大果’、‘黑珍珠’、‘麗珠’、‘13-33’、‘魯玉’、‘秦林’、‘佳紅’、‘斯坦拉’、‘大地紅’、‘飴珠’、‘早露’、‘早紅珠’;中抗品種為‘拉賓斯’、‘C2’、‘紅蜜’、‘泰珠’、‘明珠’、‘先鋒’、‘薩米脫’、‘布魯克斯’、‘紅燈’;感病品種為‘美早’、‘彩玉’、‘C1’、‘雷尼’、‘晚紅珠’、‘紅艷’、‘岱玉’、‘桑提娜’;高感品種為‘意早’、‘吉美’、‘紅手球’、‘Red’(表2)。

表2 櫻桃品種特性及其對櫻桃褐斑病的抗性

Table 2 Investigation of cherry cultivar characteristics and resistance to cherry leaf spot

品種Variety地區Area果實形狀Shape果實顏色Color成熟時間Ripeningperiod病情指數Diseaseindex相對抗病指數Relativediseaseresistanceindex抗病性Diseaseresistance發病程度Morbiditydegree抗性評價Resistanceevaluation重慶烏皮中國圓形淺紅色5月上中旬7.60.88xxxxx+HR秦櫻中國心臟形紫紅色5月中旬7.70.88xxxxx+HR櫻姬日本心臟形紅色6月上旬7.70.88xxxxx+HRSirDouglas新西蘭寬心臟形紅色6月上旬8.70.86xxxxx+HR格拉斯俄羅斯寬心臟形紅色5月底8.70.86xxxxx+HR紅清日本心臟形紅色5月下旬9.10.86xxxxx+HR佳紅中國心臟形淺黃色5月底至6月初12.70.80xxxx++R早露中國寬心臟形紫紅色5月中旬12.70.80xxxx++R13-33中國寬心臟形黃色5月底至6月初13.80.78xxxx++R斯坦拉加拿大心臟形紫紅色6月上旬13.90.78xxxx++R黑珍珠中國寬心臟形紫紅色5月下旬14.20.77xxxx++R早紅珠中國寬心臟形紫紅色5月下旬14.20.77xxx+++R早大果烏克蘭寬心臟形深紅色5月中下旬15.80.75xxxx++R

續表2 Table 2(Continued)

品種Variety地區Area果實形狀Shape果實顏色Color成熟時間Ripeningperiod病情指數Diseaseindex相對抗病指數Relativediseaseresistanceindex抗病性Diseaseresistance發病程度Morbiditydegree抗性評價Resistanceevaluation秦林美國寬心臟形紫紅色5月下旬16.00.75xxxx++R麗珠中國腎臟形紫紅色6月上旬16.10.74xxxx++R魯玉中國腎臟形紫紅色5月底至6月初17.70.72xxxx++R大地紅日本短心臟形紅色5月中下旬17.70.72xxxx++R飴珠中國寬心臟形黃底紅暈6月上旬18.90.70xxxx++R紅燈中國腎臟形紫紅色5月下旬20.30.68xxx+++MR明珠中國寬心臟形紅底黃暈5月下旬23.20.63xxx+++MR泰珠中國腎臟形紫紅色6月上旬23.40.63xxx+++MRC2中國心臟形紫紅色6月初23.60.62xxx+++MR先鋒美國腎臟形深紅色6月上中旬25.20.60xxx+++MR拉賓斯加拿大卵圓形紫紅色6月上中旬26.30.58xxx+++MR薩米脫美國心臟形紫紅色6月上旬26.40.58xxx+++MR紅蜜中國心臟形黃底紅暈5月下旬27.40.56xxx+++MR布魯克斯美國心臟形紅色5月下旬28.30.55xxx+++MR岱玉中國心臟形紫紅色6月初31.40.50xx++++S紅艷中國寬心臟形紅色5月下旬31.40.49xx++++S彩玉中國近圓形黃底紅暈5月底32.30.49xx++++S桑提娜加拿大心臟形紅色至紫紅色5月下旬34.30.45xx++++S晚紅珠中國寬心臟形紅色6月中旬34.30.45xx++++S美早美國腎臟形紫紅色5月下旬35.30.44xx++++SC1中國扁圓形紫紅色6月上旬35.70.43xx++++S雷尼美國寬心臟形黃底紅暈6月上旬38.10.39xx++++S吉美中國心臟形紫紅色6月上旬54.30.14x+++++HSRed新西蘭寬心臟形紫紅色6月上旬55.20.12x+++++HS紅手球日本短心臟形紅色6月上旬61.80.02x+++++HS意早法國短心臟形紫紅色5月底62.90xx++++HS

3 討論

尾孢菌屬真菌有許多是重要的植物病原真菌,且絕大多數具有很強的寄生性[8],人工培養和產孢條件難以確定,即使是分離后能在人工培養基上生長,其生長速度也非常緩慢,而且很難產生孢子,這制約了對尾孢屬真菌的系統研究。本研究中,核果釘孢菌最適宜的生長條件為25℃,黑暗,PCDA培養基,以葡萄糖為碳源。本文通過對櫻桃褐斑病菌生物學特性的研究,闡明了病菌生長和環境條件的關系,進一步明確了病害的發生規律,為病害的深入研究和防治提供了一定的理論基礎。

褐斑病是櫻桃生產中常見的病害,噴施化學藥劑是防治該病害的主要措施,但化學藥劑容易造成環境污染,且易導致病原菌產生抗藥性。選育抗病品種是病害防治的有效措施。品種抗性評價是抗病育種的基礎工作,為抗病育種提供理論支持。本研究中,不同櫻桃品種對褐斑病的抗性存在差異,按照病情指數、相對抗病指數可分為免疫、高抗、抗病、中抗、較感病、感病6個等級,在調查的39個品種中,‘秦櫻’、‘重慶烏皮’、格拉斯、‘櫻姬’、‘紅清’、‘Sir Douglas’為高抗品種,而‘意早’、‘吉美’、‘紅手球’、‘Red’為高感品種。病害抗性調查是評價品種抗病性的重要指標,但即使是在同等發病條件下,不同年份、不同地區以及不同樹勢,會使品種間存在相對抗性差異。在實際育種中,除篩選出優良的抗病品種、進行種間雜交外,還應進一步找出抗病品種的抗病基因,提升選育品種的抗性。

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(責任編輯：田 喆)

Identification of cherry cultivar resistance to leaf spot and biological characteristics ofPassaloracircumscissa

Sun Yang, Fu Quanjuan, Sun Yugang, Wei Guoqin, Yang Xinghua

(InstituteofShandongPomology,Tai’an271000,China)

The biological characteristics ofPassaloracircumscissaisolated from Tai’an and the resistance of 39 cherry varieties in the field were studied. The results showed that OA and PCDA were the optimum culture media for pathogen growth. The optimum temperature was 25℃ (10 to 35℃). Glucose and peptone were the optimum carbon and nitrogen sources. The pathogen adapted to a wide range of pH values, growing well from pH 4 to pH12, and the optimum pH value was 7. The mycelium grew faster in darkness. For germination of conidia, the optimum temperature and pH were 25℃ and 7, respectively. Different varieties exhibited different disease resistances, including six highly resistant varieties,12 resistant varieties, 9 moderately resistant varieties, 8 susceptible varieties, 4 highly susceptible varieties, and immune varieties were not found.

cherry leaf spot;Passaloracircumscissa; biological character; resistance

2016-10-19

2017-02-08

山東省自然科學基金培養基金(ZR2014CP017)

S 436.62

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.020

聯系方式 E-mail: sunyang_729@163.com