馬鈴薯干腐病優(yōu)勢(shì)病原菌Fusariumsambucinum分子檢測(cè)技術(shù)的建立

魏 巍, 趙冬梅, 張 岱, 楊志輝, 朱杰華

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 保定 071000)

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馬鈴薯干腐病優(yōu)勢(shì)病原菌Fusariumsambucinum分子檢測(cè)技術(shù)的建立

魏 巍#, 趙冬梅#, 張 岱, 楊志輝, 朱杰華*

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 保定 071000)

馬鈴薯干腐病是馬鈴薯最重要的貯藏期病害之一,現(xiàn)已成為馬鈴薯貯藏期爛窖的重要原因。實(shí)現(xiàn)病原菌的快速檢測(cè)對(duì)病害診斷和科學(xué)防控具有重要的實(shí)踐意義。本研究基于鐮刀菌翻譯延伸因子序列設(shè)計(jì)了一對(duì)檢測(cè)接骨木鐮刀菌Fusariumsambucinum的特異引物Fs-F/Fs-R。該特異引物可從接骨木鐮刀菌中獲得309 bp的特異性擴(kuò)增片段,而其他種類鐮刀菌及馬鈴薯重要病害病原菌中均無此片段,說明該引物具有專一性。該體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明,最低能檢測(cè)到的接骨木鐮刀菌基因組DNA濃度為70 pg/μL。該引物也適用于發(fā)病馬鈴薯塊莖中接骨木鐮刀菌的快速檢測(cè)。

馬鈴薯干腐病; 鐮刀菌; 分子檢測(cè); 接骨木鐮刀菌

由多種鐮刀菌引起的馬鈴薯干腐病是馬鈴薯貯藏期重要病害之一,其常年發(fā)病率為10%～30%[1],最高可達(dá)60%以上[2],現(xiàn)已成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸。因此,尋找快速、準(zhǔn)確的干腐病菌的分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)干腐病的診斷和科學(xué)防治具有重要意義。形態(tài)學(xué)鑒定是傳統(tǒng)的鐮刀菌鑒定方法,然而,由于鐮刀菌的分類系統(tǒng)繁多復(fù)雜,并且溫濕度、光照、pH等環(huán)境條件的改變都會(huì)導(dǎo)致其培養(yǎng)性狀發(fā)生明顯變化[3],加之形態(tài)鑒定本身比較耗時(shí)耗力,因此,鐮刀菌的鑒定面臨著巨大挑戰(zhàn)。近年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,特別是GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中真菌序列的不斷豐富為鐮刀菌的準(zhǔn)確、快速鑒定開辟了新的方向。

國內(nèi)外關(guān)于馬鈴薯干腐病菌的分子檢測(cè)研究較少。2006年,Atallah等[4]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)引起馬鈴薯塊莖腐爛的5種病原菌進(jìn)行了檢測(cè)和定量,文中利用β-微管蛋白(β-tubulin)基因設(shè)計(jì)了一對(duì)檢測(cè)接骨木鐮刀菌F.sambucinum的引物,該引物可以成功檢測(cè)到該菌,但也可擴(kuò)增出燕麥鐮刀菌F.avenaceum、黃色鐮刀菌F.culmorum、禾谷鐮刀菌F.graminearum和銳頂鐮刀菌F.acuminatum等病原菌。2005年,Cullen等[5]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和PCR-酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的方法對(duì)引起馬鈴薯干腐病的F.avenaceum、深藍(lán)鐮刀菌F.coeruleum、F.culmorum和硫色鐮刀菌F.sulphureum進(jìn)行了分子檢測(cè),通過ITS序列比對(duì),利用其中具有差異的區(qū)域設(shè)計(jì)了針對(duì)F.coeruleum和F.sulphureum的特異性引物。而對(duì)于F.avenaceum和F.culmorum,由于ITS序列在這兩個(gè)種間的差異不大,因此不能用該片段設(shè)計(jì)引物,為此,Cullen等分別利用Turner等[6]和Nicholson等[7]針對(duì)F.avenaceum和F.culmorum設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果均成功地檢測(cè)到相應(yīng)的鐮刀菌。2013年,李瑞琴等[8]通過ITS序列比對(duì),設(shè)計(jì)了針對(duì)F.sambucinum和F.solani的特異性引物,并檢測(cè)了這兩種病原菌在連作馬鈴薯根際的動(dòng)態(tài)變化。

事實(shí)上,雖然前人將ITS序列用于鐮刀菌分類研究并取得了一定的結(jié)果,但關(guān)于ITS是否真正適用于鐮刀菌的分類鑒定仍存在許多爭(zhēng)議。Yli-Mattila等[9]用通用引物擴(kuò)增梨孢鐮刀菌F.poae、F.langsethiae、擬枝孢鐮刀菌F.sporotrichioides和九州鐮刀菌F.kyushuense的ITS、IGS、β-tubulin片段,UP-PCR雜交的結(jié)果表明:ITS不能完全地區(qū)分

這4個(gè)種,而β-tubulin可用于種水平上的鑒定,IGS在亞種水平具有多樣性。在這之后,Kvas等[10]對(duì)鐮刀菌遺傳演化多樣性的研究進(jìn)行了概述,認(rèn)為一些鐮刀菌,尤其是有性態(tài)屬于赤霉屬的鐮刀菌,其ITS2區(qū)域存在非同源拷貝,致使其不能真實(shí)準(zhǔn)確地用于鐮刀菌分類,而28S rRNA、線粒體小亞基(mtSSU)、β-tubulin、組蛋白3、鈣調(diào)蛋白和翻譯延伸因子(TEF-1α)可以用來鑒定鐮刀菌。其他研究也論證了TEF-1α是在種的水平上信息量很高的單拷貝基因,利用TEF-1α基因序列設(shè)計(jì)得到的引物非常適用于鐮刀菌屬種的鑒定[11-12]。

本研究利用鐮刀菌屬TEF-1α序列設(shè)計(jì)特異性引物,可為馬鈴薯干腐病菌的優(yōu)勢(shì)種群F.sambucinum的準(zhǔn)確鑒定和快速檢測(cè)提供技術(shù)和方法。對(duì)病害進(jìn)行快速檢測(cè)可及時(shí)淘汰病薯,對(duì)于減少因干腐病造成的損失具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究中供試菌株種名、寄主、來源相關(guān)信息見表1。

表1 供試菌株信息

Table 1 Characteristics of the strains in this study

菌株編號(hào)Number菌株種類Species采集地點(diǎn)Location寄主Host采集年份YearHW11-4接骨木鐮刀菌F.sambucinum河北承德Chengde,Hebei馬鈴薯2011HW11-6接骨木鐮刀菌F.sambucinum河北承德Chengde,Hebei馬鈴薯2011HW11-10接骨木鐮刀菌F.sambucinum河北承德Chengde,Hebei馬鈴薯2011HW11-13接骨木鐮刀菌F.sambucinum河北承德Chengde,Hebei馬鈴薯2011HW11-15接骨木鐮刀菌F.sambucinum河北承德Chengde,Hebei馬鈴薯2011HW11-17接骨木鐮刀菌F.sambucinum河北承德Chengde,Hebei馬鈴薯2011HW11-21銳頂鐮刀菌F.acuminatum河北承德Chengde,Hebei馬鈴薯2011HW11-9尖孢鐮刀菌F.oxysporum河北承德Chengde,Hebei馬鈴薯2011HW11-1芬芳鐮刀菌F.redolens河北承德Chengde,Hebei馬鈴薯2011HW11-2木賊鐮刀菌F.equiseti河北承德Chengde,Hebei馬鈴薯2011HW11-25禾谷鐮刀菌F.graminearum河北保定Baoding,Hebei馬鈴薯2011HB11-5串珠鐮刀菌F.moniliforme河北保定Baoding,Hebei馬鈴薯2011HL10-6層出鐮刀菌F.proliferatum河北廊坊Langfang,Hebei馬鈴薯2010HWC-7茄鏈格孢Alternariasolani河北承德Chengde,Hebei馬鈴薯2010NG10-5致病疫霉Phytophthorainfestans寧夏固原Guyuan,Ningxia馬鈴薯2010NM09-6立枯絲核菌Rhizoctoniasolani內(nèi)蒙古烏蘭察布Wulanchabu,InnerMongolia馬鈴薯2009

1.2 菌絲基因組DNA的提取

取少量培養(yǎng)好的菌絲,采用CTAB法[13]提取DNA,加適量滅菌超純水(含20 μg/mL RNase)溶解DNA,37℃處理1 h后,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 馬鈴薯發(fā)病組織DNA的快速提取

馬鈴薯塊莖發(fā)病組織DNA提取采用改進(jìn)的玻璃珠振蕩法[14]:用滅菌解剖刀切取接種接骨木鐮刀菌后發(fā)病馬鈴薯塊莖的病健交界處,放入1.5 mL離心管中,加入適量石英砂,再加入500～800 μL微量粗提取緩沖液TE,用臺(tái)鉆充分研磨,將離心管在漩渦儀上大于2 000 r/min振蕩5 min。常溫下,14 000 r/min離心10 min,吸取上清液直接用于PCR擴(kuò)增,或?qū)⒑蠨NA的上清液保存于-20℃條件下備用。

1.4 特異引物設(shè)計(jì)

從GenBank中下載鐮刀菌屬TEF-1α基因的所有序列。用ClustalX 1.81[15]對(duì)下載序列進(jìn)行比對(duì),并用BioEdit 7.0.1[13]進(jìn)行人工調(diào)整,通過DAMBE 4.2.13[16]保留一條堿基完全相同而名稱不同的序列作為該單倍型的代表序列,最終所有保留的單倍型構(gòu)成鐮刀菌屬TEF-1α序列的數(shù)據(jù)組。對(duì)該數(shù)據(jù)組進(jìn)行分析,找出各個(gè)種內(nèi)保守而種間差異較大的變異區(qū),設(shè)計(jì)接骨木鐮刀菌的特異引物,并用GenBank中primer-BLAST檢測(cè)引物的特異性。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.5 引物特異性檢測(cè)

用特異性引物Fs-F/Fs-R對(duì)接骨木鐮刀菌、其他鐮刀菌以及馬鈴薯重要病害病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以ddH2O為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系為25 μL,其中,DNA模板1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃ 4 min;94℃ 40 s,61℃ 40 s,72℃ 20 s,28個(gè)循環(huán);72℃ 7 min;4℃保存。擴(kuò)增完畢,取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.6 引物靈敏度檢測(cè)

使用紫外分光光度計(jì)測(cè)量接骨木鐮刀菌基因組DNA濃度,采用10倍梯度稀釋法,將提取的基因組DNA從700 ng/μL逐級(jí)稀釋為70 fg/μL 8個(gè)不同濃度梯度。應(yīng)用特異性引物Fs-F/Fs-R,利用1.5中的PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)程序,以稀釋的各個(gè)濃度的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,確定該P(yáng)CR體系能檢測(cè)到接骨木鐮刀菌的最低濃度。

1.7 馬鈴薯發(fā)病組織的快速檢測(cè)

馬鈴薯干腐病的人工接種參考Choiseul等[17]的傷口接種法。將大小一致的健康馬鈴薯薯塊先后用自來水和無菌水清洗干凈之后用75%乙醇表面消毒,自然晾干待用。用直徑5 mm的打孔器在薯塊上打取3 mm深的3個(gè)小孔,將在PDA平板上培養(yǎng)7 d、直徑為5 mm的HW11-4菌餅接種于小孔中,再將原薯塊組織輕輕塞回。共接種10個(gè)薯塊,另接種無菌PDA培養(yǎng)基圓片為對(duì)照。接種薯塊置于保濕裝置內(nèi),25℃恒溫培養(yǎng)。

用滅菌解剖刀切取接種接骨木鐮刀菌后發(fā)病馬鈴薯塊莖的病健交界處,提取DNA,以健康塊莖及接種無菌水的塊莖為對(duì)照,利用1.5建立的檢測(cè)體系,對(duì)馬鈴薯干腐病發(fā)病組織進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 接骨木鐮刀菌特異引物的確定

從GenBank上共下載鐮刀菌屬TEF-1α序列2 468條,對(duì)其進(jìn)行比對(duì)、刪除重復(fù)序列、人工調(diào)整,最終剩余632條。分析找出了接骨木鐮刀菌種內(nèi)保守而與其他鐮刀菌種間差異較大的序列區(qū)域,設(shè)計(jì)了種專一性的引物對(duì)Fs-F/Fs-R(Fs-F:5′-GACCCAAATCTAAGCTCGCC-3′;Fs-R:5′-GAAGGGCATGTCGCTCAAG-3′)。該引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為309 bp。用GenBank中primer-BLAST檢測(cè)引物的特異性,發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的引物序列僅能與GenBank中接骨木鐮刀菌的TEF-1α序列完全匹配,表明引物Fs-F/Fs-R是特異的。

2.2 引物Fs-F/Fs-R特異性檢測(cè)

利用特異性引物Fs-F/Fs-R對(duì)接骨木鐮刀菌、本研究分離的另外3種干腐病菌、其他作物上的鐮刀菌、馬鈴薯晚疫病菌、黑痣病菌及早疫病菌進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明:該引物從接骨木鐮刀菌中均可擴(kuò)增出309 bp的特異性條帶,而其他菌株和ddH2O對(duì)照均未擴(kuò)增出任何條帶(圖1),表明該引物具有很高的特異性,能夠用于接骨木鐮刀菌的快速分子鑒定。

2.3 引物Fs-F/Fs-R對(duì)接骨木鐮刀菌分子檢測(cè)的靈敏度

供試接骨木鐮刀菌基因組DNA的濃度為700 ng/μL。通過10倍梯度稀釋法稀釋DNA,得到8個(gè)濃度梯度,即700 ng/μL、70 ng/μL、7 ng/μL、700 pg/μL、70 pg/μL、7 pg/μL、700 fg/μL和70 fg/μL。利用1.5中的PCR體系和程序檢測(cè)特異引物擴(kuò)增的靈敏度。結(jié)果表明,該P(yáng)CR反應(yīng)能檢測(cè)的最低DNA濃度為70 pg/μL(圖2)。

圖1 引物Fs-F/Fs-R對(duì)接骨木鐮刀菌的特異性檢測(cè)Fig.1 The specificity of the primer pair Fs-F/Fs-R to Fusarium sambucinum

圖2 特異性引物Fs-F/Fs-R對(duì)接骨木鐮刀菌DNA的靈敏度檢測(cè)Fig.2 Sensitivity detection of Fusarium sambucinum specific primers Fs-F/Fs-R with different dilutions of template DNA

2.4 發(fā)病薯塊中病原菌的分子檢測(cè)

人工接種接骨木鐮刀菌后,對(duì)發(fā)病薯塊進(jìn)行PCR擴(kuò)增。被侵染的薯塊組織中可以檢測(cè)到接骨木鐮刀菌,在309 bp處出現(xiàn)特異性條帶,而健康薯塊和接種無菌水的薯塊中均無該特異性條帶(圖3),證明該方法可以準(zhǔn)確地檢測(cè)出引起馬鈴薯干腐病的接骨木鐮刀菌。

3 討論

TEF-1α是在種水平上信息量很高的單拷貝基因,適用于鐮刀菌種的鑒定[11-12]。本研究基于鐮刀菌TEF-1α序列設(shè)計(jì)的接骨木鐮刀菌的特異引物Fs-F/Fs-R,通過普通PCR對(duì)接骨木鐮刀菌基因組DNA檢測(cè)的最低濃度為70 pg/μL。這比陳恩發(fā)[18]利用普通PCR檢測(cè)接骨木鐮刀菌的靈敏度(196.35 pg/μL)高,但比實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度(19.635 pg/μL)稍低。在引物設(shè)計(jì)時(shí)發(fā)現(xiàn),與接骨木鐮刀菌親緣關(guān)系最近的是F.venenatum。

圖3 發(fā)病薯塊中接骨木鐮刀菌的分子檢測(cè)Fig.3 Molecular detection of Fusarium sambucinum from tubers inoculated artificially

1995年,Nirenberg[19]報(bào)道了在馬鈴薯上分離得到了F.venenatum,本研究設(shè)計(jì)的引物恰好選取在這兩種鐮刀菌的差異區(qū),并且F.venenatum主要危害大麥和小麥[20],因此,近緣種F.venenatum對(duì)馬鈴薯上接骨木鐮刀菌的檢測(cè)無影響。

陳恩發(fā)[18]根據(jù)不同鐮刀菌TEF-1α序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,該引物可檢測(cè)出馬鈴薯干腐病主要致病菌,擴(kuò)增片段為147～170 bp,但文中僅提供了接骨木鐮刀菌的擴(kuò)增片段為168 bp,而對(duì)供試的尖孢鐮刀菌、銳頂鐮刀菌、木賊鐮刀菌和燕麥鐮刀菌并未說明擴(kuò)增片段,也未敘述上述4種鐮刀菌的具體檢測(cè)結(jié)果。此外,同一對(duì)引物對(duì)5個(gè)鐮刀菌種類擴(kuò)增僅存在23 bp的差異,無論是利用普通PCR還是實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行檢測(cè),均會(huì)因?yàn)槠尾町愡^小而不能很好地分辨各個(gè)種類。同樣,Atallah等[4]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)5種干腐病菌進(jìn)行了檢測(cè)和定量,利用β-微管蛋白基因設(shè)計(jì)了一對(duì)檢測(cè)接骨木鐮刀菌的引物,可以成功檢測(cè)到該菌,但同時(shí)該引物也可擴(kuò)增出其他4種鐮刀菌。由于不同種類的鐮刀菌的生物學(xué)特性和對(duì)藥劑的敏感性不同,因此針對(duì)不同鐮刀菌所制定的防治方案也不完全相同,不能準(zhǔn)確區(qū)分每種鐮刀菌,就不能為干腐病防治提供科學(xué)的理論依據(jù)。本研究建立的分子檢測(cè)方法能特異地檢測(cè)接骨木鐮刀菌,而其他干腐病菌不能被檢出。因此,本試驗(yàn)建立的分子檢測(cè)技術(shù)可以經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)到接骨木鐮刀菌,為病害的診斷及科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Molecular identification of dominant pathogenFusariumsambucinumcausing potato dry rot

Wei Wei, Zhao Dongmei, Zhang Dai, Yang Zhihui, Zhu Jiehua

(CollegeofPlantProtection,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071000,China)

Potato dry rot, caused by variousFusariumspp., is one of the most important storage diseases of potato. This disease became a main reason of rotten potatoes in the storage cavern. Rapid detection of the pathogen has the important practical significance for disease diagnosis and scientific prevention and control. In this study, based on the translation elongation factor-1 alpha (TEF-1α) sequences ofFusarium, a specific pair of primers Fs-F/Fs-R forF.sambucinumwas designed. Using Fs-F/Fs-R, PCR product with the length of 309 bp was amplified only fromF.sambucinum, but not otherFusariumspp. and pathogens causing potato important diseases. The detection sensitivity for genomic DNA was 70 pg/μL.This method can be used to detectF.sambucinumin potato tubers.

potato dry rot;Fusarium; molecular detection;Fusariumsambucinum

2016-09-03

2016-11-18

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-10-P12)

S 435.32

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.021

* 通信作者 E-mail:zhujiehua356@126.com

#并列第一作者