5種倉儲豆象的分子鑒定和檢測

劉昌燕, 李 莉, 焦春海, 萬正煌

(湖北省農業科學院糧食作物研究所, 糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室, 武漢 430064)

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5種倉儲豆象的分子鑒定和檢測

劉昌燕, 李 莉, 焦春海, 萬正煌*

(湖北省農業科學院糧食作物研究所, 糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室, 武漢 430064)

本研究以在檢疫中經常被截獲的5種豆象為研究對象,通過對GenBank中5種豆象mtDNA COⅠ序列的查詢,并進行序列比對,共設計了30對引物,通過篩選獲得5對能分別鑒定5種豆象的特異引物,并用50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL 8個不同濃度系列的豆象DNA模板來檢測靈敏度,結果表明,豌豆象和四紋豆象特異引物對的靈敏度為0.1 ng/μL,蠶豆象、菜豆象和綠豆象特異引物對的靈敏度為0.5 ng/μL。該方法可用于快速準確地鑒定5種豆象,對于豆象類害蟲的檢測監測具有重要意義。

豆象科; mtDNA COⅠ基因; 特異引物; 分子鑒定

豆象是豆象科昆蟲的總稱,分布于除南極之外的各大陸,尤其以亞洲的熱帶區以及中美和南美地區數量最多[1]。豆象科昆蟲目前全世界記錄約1 400種,分屬于58個屬[2]。該科昆蟲大約有84%的種類取食豆科植物種子,成為栽培豆科植物的一類重要害蟲[3]。1997年浙江寧海曾發生蠶豆象大規模為害,為害率高的達到80%以上,經濟損失嚴重[4]。綠豆象嚴重為害綠豆、豇豆、鷹嘴豆、蠶豆和豌豆等多種豆類[5-6],主要在倉內蛀食儲藏的豆粒,造成的損失達30%以上[7]。我國共記載有18種儲藏物中豆象科昆蟲,其中綠豆象Callosobruchuschinensis、蠶豆象Bruchusrufimanus和豌豆象Bruchuspisorum為我國主要的儲藏豆類害蟲;而菜豆象Acanthoscelidesobtectus和四紋豆象Callosobruchusmaculatus為我國規定禁止入境的檢疫性害蟲[8]。

目前口岸檢驗檢疫部門對豆象科昆蟲的鑒定主要以成蟲的外部形態特征作為鑒定依據,但本研究涉及的5種豆象個體微小(約2～5 mm),且寄主范圍、生活習性和種間外部形態極為相似,給種類鑒定工作帶來了極大的困難[1,9]。同時,豆象能夠以卵、幼蟲、蛹、成蟲隨寄主果實和運輸工具等進行遠距離人為傳播,且主要以卵、幼蟲、蛹等非成蟲形態為主,需將其飼養至成蟲才能進行種類鑒定,整個檢疫鑒定過程長達數周,不適應口岸快速檢驗檢疫的要求,且容易混淆誤檢,無法適應實際工作的需要。我國在進口貨物上截獲的豆象不單單存在于豆類上,在玉米、小麥、棉花等貨物中也存在,極大地增加了檢疫的難度[2]。因此,尋找一種正確快速的鑒定方法對口岸檢驗檢疫具有十分重要的指導意義。

分子標記是實現分子鑒定的重要技術手段,目前已應用于昆蟲近緣種、地理種群的鑒別。細胞色素C氧化酶含有13個亞基,其中細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)是細胞色素氧化酶的重要組成部分,編碼該亞基的基因片段不同位置的進化速率有所不同,通過選取該基因的適宜基因片段進行測序和序列分析,進而在DNA水平上對物種進行正確地識別鑒定,已成為生物分類學研究的發展方向[10-11]。相比于其他分子標記技術,由于其具有統一性和標準性而成為生物分類學研究中應用最為廣泛的分子手段之一[12-13]。目前,COⅠ基因已用于鱗翅目、膜翅目、半翅目等物種鑒定,并對基于形態學的物種分類進行了驗證或修正[14-15]。

本研究以在檢疫中經常被截獲的5種豆象為研究對象,設計了以COⅠ為目標基因的特異性引物并對其特異性進行驗證,旨在建立豆象類害蟲快速分子鑒定技術,為有效截阻豆象類害蟲的傳入及進一步擴散,保障我國豆類安全生產提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

本研究所用的昆蟲樣品、來源和寄主見表1。所有蟲源樣品均用體式顯微鏡進行鑒定,以確定種類。用于分子生物學試驗的豆象標本用100%乙醇浸泡并保存于-20℃冰箱。

表1 5種豆象來源及寄主

Table 1 Sources and hosts of five bean weevils

昆蟲樣品Sample來源Source寄主Host綠豆象Callosobruchuschinensis北京門頭溝綠豆Vignaradiata豌豆象Bruchuspisorum湖北武漢豌豆Pisumsativum蠶豆象Bruchusrufimanus湖北武漢蠶豆Viciafaba四紋豆象Callosobruchusmaculatus重慶永川綠豆Vignaradiata菜豆象Acanthoscelidesobtectus云南曲靖菜豆Phaseolusvulgaris

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、DL1000 DNA Marker、Tris、EDTA、SDS均購自TaKaRa公司。膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司,其他生化試劑均為國產分析純。

1.3 基因組DNA的提取

豆象基因組DNA的提取參照Sunnuck等[16]的鹽析法并稍作改進。將單頭豆象于1.5 mL離心管中研磨粉碎,加入300 μL TENS (50 mmol/L Tris, pH 7.5, 400 mmol/L NaCl, 20 mmol/L EDTA, 0.5% SDS)和100 μg/mL蛋白酶K,于37℃水浴4 h,加入85 μL 5 mol/L NaCl劇烈振蕩15 s;14 000 r/min離心5 min, 取上清液,加入等體積無水乙醇沉淀DNA,12 000 r/min離心5 min, 用70%乙醇洗滌沉淀2次,沉淀充分干燥后,加入30 μL蒸餾水溶解DNA,-20℃保存備用。

1.4 特異引物對的設計

通過GenBank中登錄的豌豆象(EF570097)、四紋豆象(AY625417)、蠶豆象(AY997313)、菜豆象(KF157281)和綠豆象(AY625416)的mtDNA CO Ⅰ序列,用DNAMAN軟件對目標種的mtDNA CO Ⅰ序列進行比對分析,根據分析結果,針對目的基因序列人工設計特異引物,并用Primer 5對引物進行評估,檢查引物Tm值、GC%、錯配、二聚體和發夾結構等,并用GenBank中的BLAST程序檢查同源序列[17]。本研究共設計了30對引物,通過篩選獲得能分別特異鑒定5種豆象的特異引物5對(表2),引物篩選的原則是所有引物在所設計的PCR反應體系和反應條件下能特異地鑒定出某一種豆象。引物由武漢擎科生物技術有限公司合成。

1.5 PCR擴增

分別以單頭豆象的基因組DNA為模板,用表2的特異性引物進行PCR擴增,以水作陰性對照。PCR反應體系(25 μL):10×buffer(含Mg2+)2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL、10 μmol/L引物(上、下游引物)各1.0 μL、2.5 U/μLTaq酶 0.2 μL、基因組DNA 1 μL,ddH2O 16.8 μL。PCR反應條件:95℃預變性5 min;95℃變性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸1 min,35個循環;72℃ 10 min;4℃保存。取5 μL PCR產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,溴化乙錠(EB)染色,在凝膠成像系統中觀察并成像分析。

表2 引物序列及擴增產物

Table 2 Primer sequences and amplification products

引物 Primer豆象種類 Species序列5'-3' Sequence目標片段長度/bp LengthBp1Bp2Cm1Cm2Br1Br2Ao1Ao2Cc1Cc2豌豆象Bruchuspisorum四紋豆象Callosobruchusmaculatus蠶豆象Bruchusrufimanus菜豆象Acanthoscelidesobtectus綠豆象CallosobruchuschinensisAGTTGGGGGTTTAACTGGTGTATGTTAAACCTGTAAATAATGGGGGTCCCTACTGGAATTAAAGTAAAAGTAACTCCGGTAAAAAGGAGTGGGAGGATTGACTGGTGTTAGTTAATCCTGTAAATAATGAACATGATAGCTATCGGATTAACCTAAAAATATAGTAATAAATTGGGAGTACCAACCGGAATCAAAGTAAGTGACACCAGTAAAAAGAGGA166276167432274

1.6 PCR產物回收測序

PCR產物采用天根瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行切膠回收純化,回收純化后的PCR產物由武漢擎科生物科技有限公司進行測序。

1.7 特異引物對的靈敏度檢測

供試豆象的基因組DNA用蒸餾水進行系列稀釋,得到基因組DNA濃度分別為:50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL。分別取每種稀釋液1 μL為模板(水為陰性對照),用上述5對特異性引物分別對5種豆象的基因組DNA進行PCR擴增,PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測。

2 結果與分析

2.1 引物特異性驗證

用設計的特異性引物對所有供試豆象的基因組DNA進行PCR擴增,其中Bp1/Bp2僅在豌豆象基因組DNA擴增出166 bp特異性條帶(圖1);Cm1/Cm2僅在四紋豆象基因組DNA中擴增出276 bp特異性條帶(圖2);Br1/Br2僅在蠶豆象基因組DNA中擴增出167 bp特異性條帶(圖3);Ao1/Ao2僅在菜豆象中擴增出432 bp特異性條帶(圖4);Cc1/Cc2僅在綠豆象中擴增出274 bp特異性條帶(圖5),其他豆象基因組DNA及水對照均無擴增片段。表明設計的引物在供試豆象范圍內具有特異性。

圖1 5種豆象的特異性檢測Fig.1 Detection of five bean weevils with specific primers

2.2 PCR產物測序驗證

分別對擴增出的PCR產物進行測序和序列分析,對產物的特異性進行進一步確認。經測序表明,豌豆象特異引物對擴增的PCR產物與原序列有5個堿基的差異,四紋豆象特異引物對擴增的PCR產物序列與原序列有4個堿基的差異,蠶豆象特異引物對擴增的PCR產物與原序列有9個堿基的差異,菜豆象特異引物對擴增的PCR產物與原序列有6個堿基的差異,綠豆象特異引物對擴增的PCR產物與原序列沒有堿基的差異,造成這些差異的原因可能是測序的差異或者不同地理種群間序列存在差異。

2.3 特異引物靈敏度檢測

PCR方法的檢測靈敏度分別用50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL等8種不同濃度的豆象DNA為模板來確定。由圖2可知,當模板濃度為0.05 ng/μL時,豌豆象和四紋豆象特異引物對均沒有擴增出特異性條帶,當模板濃度為0.1 ng/μL及以上時,均產生特異性條帶,而水對照即CK無擴增片段(圖2)。由此可知,應用本試驗的PCR鑒定方法可以檢測到濃度為0.1 ng/μL的豌豆象和四紋豆象基因組DNA,靈敏度非常高。從圖8～10可以看出,蠶豆象、菜豆象和綠豆象特異引物對的靈敏度為0.5 ng/μL。

圖2 特異引物的靈敏度檢測Fig.2 Sensitivity detection of specific primers for five bean weevils

3 討論

現代分子生物學技術尤其是分子標記技術為研究生物之間的進化關系開辟了新手段。PCR的廣泛應用以及基因測序的精確和簡便使分子系統分析達到空前的水平。許多研究者利用RFLP或RAPD標記分析物種或地理種群的遺傳多態性,并據此推導其親緣關系。如顧耕等[18]采用RAPD技術對生活在辣椒、番茄和煙草上的棉鈴蟲進行了寄主種群遺傳分化的研究。魏曉棠等[19]利用AFLP技術對我國4個地理種群的棉褐帶卷蛾進行遺傳結構分析,為不同地理種群的棉褐帶卷蛾的分類鑒定和遺傳變異分析提供參考依據。但RFLP需要篩選大量的限制酶,而RAPD需要篩選大量隨機引物。以核酸序列測定為基礎,擴增單一的穩定條帶,實現豆象的分子鑒定具有方便、穩定和可靠的優點。顧杰等[20-21]結合PCR和酶切技術,從分子水平對鷹嘴豆象和四紋豆象進行了快速檢測,鑒定靈敏度達10 ng/μL,并檢測了四紋豆象4個地理種群的Cytb和COⅠ基因序列,對不同地理種群間遺傳結構多態性進行了研究。本研究通過序列搜索比對,并對設計的相關引物進行篩選鑒定,獲得5對能特異鑒定5種豆象的特異性引物,靈敏度達0.5 ng/μL以上,且該方法具有不受豆象發育階段和環境條件的影響,對于非成蟲態的樣品及形態結構不完整的成蟲樣品,均能從基因序列上獲得準確、可靠的鑒定信息等優點。該技術操作簡便快捷,縮短了檢測時間,提高了工作效率。因此,該技術可以用于豆象的檢測鑒定工作,并在檢疫性害蟲的檢疫檢驗與檢測監測中具有重要應用價值。

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(責任編輯：楊明麗)

Molecular identification and detection of five bean weevils

Liu Changyan, Li Li, Jiao Chunhai, Wan Zhenghuang

(InstituteofFoodCrops,HubeiAcademyofAgriculturalSciences,HubeiKeyLaboratoryofFoodCropGermplasmandGeneticImprovement,Wuhan430064,China)

Molecular identification of five bean weevils that were frequently intercepted from customs was studied in this paper. Based on the mtDNA COⅠ gene sequences ofCallosobruchuschinensis,Bruchusrufimanus,B.pisorum,AcanthoscelidesobtectusandC.maculatusfrom GenBank, 30 pairs of primers were designed, and the five bean weevils can be specifically identified by PCR amplification with five pairs of specific primers. Moreover, the sensitivity of PCR was detected at 50,25,10,5,1,0.5,0.1 and 0.05 ng/μL genomic DNA ofC.chinensis,B.rufimanus,B.pisorum,A.obtectusandC.maculatus,respectively.The results showed that the sensitivity forB.pisorumandC.maculatuswas 0.1 ng/μL, while 0.5 ng/μL for the other three. The method provides a rapid and reliable tool for identification of the five bean weevils, which could be applied in detecting and monitoring of bean weevil pests.

Bruchidae; mtDNA COⅠ gene; specific primers; molecular identification

2016-09-30

2017-01-10

國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-09); 科技部國際合作重點項目(2011DFB31620); 湖北省農業科技創新中心資助項目(2016-620-000-001-006)

S 379

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.022

* 通信作者 E-mail: zhwan168@163.com