對比分析不同方法提取土壤中的二氯喹啉酸

胡 楊, 習 京, 喬子珊, 張 玥, 周 挺, 顧 鋼, 詹家綏, 陳鳳平*

(1. 福建農林大學植物病毒研究所, 福州 350002; 2. 中國煙草總公司福建省公司, 福州 350003)

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對比分析不同方法提取土壤中的二氯喹啉酸

胡 楊1#, 習 京1#, 喬子珊1, 張 玥1, 周 挺2, 顧 鋼2, 詹家綏1, 陳鳳平1*

(1. 福建農林大學植物病毒研究所, 福州 350002; 2. 中國煙草總公司福建省公司, 福州 350003)

本文采用4種常用方法分別對福建田土中添加的二氯喹啉酸進行了提取,并采用高效液相色譜法對其添加回收率進行了測定,對比分析表明,當二氯喹啉酸添加濃度為1.25 μg/g時,方法二即氫氧化鈉溶液提取、乙酸乙酯凈化法回收率最高,約為70%,且雜質峰較小,基線平穩,峰形較對稱;重復性高,兩次生物學試驗的平均回收率無顯著差異,均略高于70%。方法一即乙腈磷酸水溶液提取、氯化鈉凈化法,回收率較高,但雜質峰較高,基線不平穩。方法三即硼砂甲醇溶液提取、二氯甲烷凈化法,雖然雜質峰小、基線平穩、峰形較好、但回收率低，約為50%。方法四即甲醇磷酸水溶液直接提取法,因提取液難以在旋轉蒸發儀中濃縮,因此未繼續檢測。綜合結果表明,方法二最適用于福建省水稻田二氯喹啉酸的提取。

二氯喹啉酸; 高效液相色譜法; 土壤

二氯喹啉酸,即3,7-二氯喹啉-8-羧酸,商品名為快殺稗、殺稗靈和神鋤等,是德國巴斯夫公司在1984年開始推廣的一種激素型喹啉酸類除草劑,對防除水稻田稗草具有特效選擇性[1],在水稻田廣為應用。目前,已登記的有效成分含二氯喹啉酸的除草劑廠家及產品信息多達152條(中國農藥信息網)。二氯喹啉酸通過單子葉植物根部吸收進入植物莖部,并在莖部誘導形成1-氨基環丙烷-1-羧酸(ACC),隨后ACC在ACC氧化酶的作用下轉換成乙烯和氰化物,隨著乙烯和氰化物的積累最終毒害植物起到殺滅植物的作用[2]。

二氯喹啉酸在水稻田防除稗草效果好,殘效期長,但是殘留的二氯喹啉酸對后茬輪作作物尤其是茄科和豆科植物容易產生藥害[3-4]。在美國阿肯色州水稻田施用二氯喹啉酸后其附近水域二氯喹啉酸的殘留量可達μg/L級[5];利用測滲計模擬水稻田施用二氯喹啉酸的環境行為,結果表明95%二氯喹啉酸殘留在水稻田30 cm表層土壤中[6]。1998年-2002年,廣東省煙區出現了水稻田施用二氯喹啉酸引發后茬煙草大面積生長畸形[7-8]。有報道稱土壤中危害煙株生長的二氯喹啉酸閾值為0.01 μg/mg[9],而我國水稻田的二氯喹啉酸除草劑的使用量遠高于該濃度。因此,檢測農田土壤中的二氯喹啉酸殘留量在生產中具有重要意義。

二氯喹啉酸的常用測定方法有液相色譜法[10-11]和氣相色譜法[7],有些采用毛細管電泳法[12],但應用很少。雖然氣相色譜法的檢測靈敏度高,但由于其前處理較為復雜,因此液相色譜法應用更為廣泛。利用液相色譜法檢測土壤中殘留的二氯喹啉酸的方法很多,但是不同土壤樣品適合的方法有差異[13]。本文采用高效液相色譜測定法,以福建田土為樣本,對4種常用的從土壤中提取二氯喹啉酸的方法進行對比分析,以期獲得一種最適用于福建省水稻田土壤的殘留檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試土壤:取自福建農林大學未施用過二氯喹啉酸的試驗田表層土壤。

1.2 試劑

二氯喹啉酸標準品(99.9%)購自北京勤誠亦信科技開發有限公司;蒸餾水購自屈臣氏公司;色譜級甲醇(HPLC)購自默克公司;甲醇、磷酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、硼砂、二氯甲烷均為分析純,購自國藥化學集團有限公司。

1.3 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1100型 DAD檢測器);旋片真空泵(ZXZ1型，浙江黃巖天龍有限公司);全自動高壓滅菌鍋(日本三洋公司);離心機(Multifuge X1R,Thermo);數控超聲波清洗器(KQ-500DB型，昆山市超聲儀器公司);鼓風干燥箱(精宏有限公司);振蕩器(SPH-2102, Shiping);電子天平(FA1204B, 上海精密儀器有限公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1 高效液相色譜法的檢測條件

流動相為甲醇+0.5%乙酸(體積比為65∶35);流速為1.0 mL/min;柱溫為40℃;檢測波長為240 nm;進樣體積為10 μL;色譜分離柱為C18柱(4.6 nm×250 nm,5 μm,安捷倫)。在該條件下,二氯喹啉酸的出峰時間為3.7 min。

1.4.2 制作標準曲線

以色譜級甲醇為溶劑配制500 μg/mL二氯喹啉酸標準儲備溶液,再用色譜級甲醇稀釋得到0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/mL二氯喹啉酸系列標準工作溶液。將標準溶液分別進樣,每個濃度進樣3次,求目標峰峰面積的平均值,將獲得的峰面積與藥液濃度作圖,求相關系數。

1.4.3 土壤樣品的提取方法

采用下列4種方法分別提取土壤中的二氯喹啉酸,每種方法重復2次,每重復進樣2次。

方法一:稱取10 g土壤于150 mL三角瓶中,加入1 mL 12.5 μg/mL的二氯喹啉酸藥液,于20℃ 150 r/min條件下搖床內振蕩搖勻24 h。然后加入50 mL乙腈和0.05%磷酸水溶液混合液(V∶V=3∶2),超聲20 min,然后置于搖床中振蕩提取1.5 h (25℃,150 r/min),隨后將混合液轉移到離心管中,5 000 r/min離心5 min,取上清液轉移到裝有7 g氯化鈉的具塞量筒中,劇烈振蕩30 s,靜置分層后取上清液。上清液用旋轉蒸發儀濃縮至近干,再用6 mL蒸餾水超聲溶解,過預處理好的C18固相萃取柱(預處理依次用6 mL甲醇和6 mL超純水淋洗),控制流速小于0.5 mL/min;再用3 mL蒸餾水清洗濃縮瓶并過C18柱;然后用3 mL甲醇洗脫,重復2次,收集所有洗脫液,用旋轉蒸發儀于35℃下濃縮至近干,最后用1.0 mL色譜級甲醇定容,過0.22 μm濾膜,收集濾液供液相色譜測定。

方法二:參考鄭雄志等[14]的方法。稱取10 g土壤樣品于150 mL三角瓶中,加入1 mL 12.5 μg/mL的二氯喹啉酸藥液,置于20℃ 150 r/min條件下搖床內振蕩搖勻24 h。然后加入30 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉溶液,振蕩提取2.5 h,5 000 r/min離心5 min;取上清液用磷酸調pH約為2.5,加入15 mL乙酸乙酯激烈振蕩萃取2次,每次振蕩5 min;收集合并乙酸乙酯相,用旋轉蒸發儀于35℃下濃縮至近干,最后用1.0 mL色譜級甲醇定容,過0.22 μm濾膜,收集濾液供液相色譜測定。

方法三:參考陳澤鵬等[15]的方法。稱取10 g土壤樣品于150 mL三角瓶中,加入1 mL 12.5 μg/mL的二氯喹啉酸藥液,于20℃150 r/min條件下搖床內振蕩搖勻24 h。然后加入12 mL 0.05 mol/L的硼砂緩沖液和20 mL甲醇,于25℃搖床中振蕩提取5 h,5 000 r/min離心5 min,取上清液用鹽酸調pH值到1～2,加入10 mL二氯甲烷萃取3次,棄去水層,合并二氯甲烷相并用旋轉蒸發儀于35℃下濃縮至近干,最后用1.0 mL色譜級甲醇定容,過0.22 μm濾膜,收集濾液供液相色譜測定。

方法四:參考張倩等[11]的方法。稱取10 g土壤樣品于150 mL三角瓶中,加入1 mL 12.5 μg/mL的二氯喹啉酸藥液,置于20℃150 r/min條件下搖床內振蕩搖勻24 h。然后加入30 mL甲醇和0.01%磷酸水溶液混合液(V∶V=3∶1),振蕩提取1 h,將提取液轉移到離心管中,于5 000 r/min離心5 min,取上清液用旋轉蒸發儀于35℃下濃縮至近干,最后用1.0 mL色譜級甲醇定容,過0.22 μm濾膜,收集濾液供液相色譜測定。

1.4.4 提取方法的穩定性

將原濃度12.5 μg/mL及低濃度1.0 μg/mL二氯喹啉酸藥液1 mL添加于土壤中,選擇上述回收率最高的一種方法,再次測定不同濃度藥劑的添加回收率,每個處理重復2次。

1.4.5 數據分析

二氯喹啉酸的回收率按下面公式計算,其中A2和A1分別是不同處理提取的二氯喹啉酸濃度的峰面積和標準溶液二氯喹啉酸的峰面積。不同處理之間的回收率差異采用SPSS軟件中的LSD方法進行比較。

回收率(%)=A2/A1×100。

2 結果與分析

2.1 標準曲線制作

按1.4.1的分離條件,測得在0.1～10 μL/mL之間二氯喹啉酸濃度與峰面積間的線性相關系數r為0.99;表明二氯喹啉酸濃度在0.1～10 μg/mL之間與響應值具有良好的線性關系(圖1)。

圖1 高效液相色譜法檢測二氯喹啉酸的標準曲線Fig.1 The standard curve of quinclorac determined with high performance liquid chromatography

2.2 不同提取方法對二氯喹啉酸的分離情況

利用方法一、二和三提取土壤樣品中的二氯喹啉酸,并采用1.4.1的液相色譜的檢測條件可以有效地將二氯喹啉酸與土壤中的其他雜質分離開(圖2)。其中,方法一的雜質含量較高,目標峰較小且峰形不對稱;方法二雜質峰較小,目標峰形狀較對稱,峰度最高;方法三雜質峰小,但目標峰較小即回收率較低;方法四在提取過程中,由于最后濃縮一步很難在短時間內完成,放棄繼續檢測。綜合認為方法二的提取方法效果最佳。

圖2 利用高效液相色譜對不同方法提取的土壤中二氯喹啉酸進行分離的色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of quinclorac separated from soil using different extraction methods

2.3 不同提取方法對二氯喹啉酸的回收率

方法一、二和三對添加濃度為1.25 μg/g的二氯喹啉酸的回收率分別為66.13%、71.18%和49.29%(表1)。可以看出,不同方法的出峰時間均比較穩定;方法一和方法二的回收率高于方法三,但是方法二和方法三的重復性高于方法一。因此,綜合認為方法二是最佳的提取方法。

表1 不同土壤提取方法的二氯喹啉酸回收率1)

Table 1 Recovery of quinclorac extracted from soil by different methods

方法Method保留時間/min Retentiontime重復1Repetition1重復2Repetition2回收率/% Recoveryrate重復1Repetition1重復2Repetition2平均回收率/%Averagerecoveryrate方法一3.5433.54761.7770.4866.13方法二3.5753.57271.9770.3871.18方法三3.5753.54950.8947.6949.29

1) 方法四因在提取過程提取液難以濃縮,因此棄之不再檢測。 The recovery of quinclorac extracted by fourth method was not detected because of the difficulty in evaporation of solution in rotary evaporators.

2.4 方法二回收率的穩定性

根據2.2和2.3試驗結果可知方法二是最優的提取方法,因此通過再次測定原濃度的添加回收率及低濃度的添加回收率確定該方法的穩定性,結果表明相同濃度的兩次生物學重復試驗回收率沒有差異,回收率穩定在70%以上。添加低濃度的二氯喹啉酸,其回收率為46.75%,顯著低于高濃度的回收率。

表2 利用方法二提取對不同添加濃度二氯喹啉酸的回收率1)

Table 2 The recovery of quinclorac spiked with different concentrations in the second extraction method

試驗Test添加濃度/μg·g-1Concentration保留時間/min Retentiontime重復Repetition1重復2Repetition2回收率/% Recoveryrate重復Repetition1重復2Repetition2平均回收率/%Averagerecoveryrate試驗一1.253.5753.57271.9770.38(71.18±1.12)a試驗二1.253.4713.46068.2773.60(70.94±3.77)a試驗二0.13.4783.48247.3846.11(46.75±0.90)b

1) 同列數據后跟有不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)。 Different letter following the values within the same column indicated significant difference between treatments (P<0.05).

3 結論與討論

本研究對福建土壤中的二氯喹啉酸進行分離的色譜條件為:流動相為甲醇+0.5%乙酸(體積比為65∶35);流速為1.0 mL/min;柱溫為40℃;檢測波長為240 nm;進樣體積為10 μL;色譜分離柱為C18柱(4.6 nm×250 nm,5 μm),采用該條件可以將土壤中的二氯喹啉酸和其他雜質分離開來。也有其他研究報道采用不同的流動相組分[11]，或者不同的甲醇乙酸比例[10,13]進行分離,但是共同點都是流動相為甲醇酸性水溶液,因此不同的試驗條件和不同的樣品,在應用分離條件前應進行測試,選用分離效果最優的方法。

在上述檢測條件下,本研究使用的方法二,即氫氧化鈉溶液提取、乙酸乙酯凈化法回收率最高,約為70%,且雜質峰較小、基線平穩、峰形較對稱,而且重復性高。當二氯喹啉酸濃度低至0.1 μg/g時,該方法回收率有所降低,但依然可達到50%左右。因此,本方法可作為檢測田間土壤二氯喹啉酸殘留量的參考方法。采用該方法提取不同土壤樣品時,需要注意調節pH值,以保證離心過程雜質充分沉淀。

方法一,即乙腈磷酸水溶液提取、氯化鈉凈化法,雖然也有較高的回收率,但雜質峰也比較高,基線不平穩,同時在過C18固相萃取柱時,流速不同對回收率的影響極大,流速快的回收率遠低于流速慢的,因此若采用此方法試驗過程中應盡量減緩流速,以保證提取質量。方法三,即硼砂甲醇溶液提取、二氯甲烷凈化法,雖然回收率低,約50%,但雜質峰小、基線平穩、峰形較好,如果是檢測二氯喹啉酸含量較高的樣品時,也可考慮采用此方法。

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(責任編輯：楊明麗)

Comparison of four methods for quinclorac extraction from soil

Hu Yang1, Xi Jing1, Qiao Zishan1, Zhang Yue1, Zhou Ting2, Gu Gang2, Zhan Jiasui1, Chen Fengping1

(1.InstituteofPlantVirology,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China; 2.FujianBranchofNationalTobaccoCorporation,Fuzhou350003,China)

Quinclorac was extracted from field soil spiked with quinclorac in Fujian Province by four common methods and the recovery rate was evaluated by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the second method was best for Fujian soil when quinclorac was spiked at 1.25 μg/g, in which the quinclorac was extracted with sodium hydroxide solution and purified with ethyl acetate. The second method had the highest recovery rate of about 70%, with small impurity peak, smooth baseline, symmetry shape of target peak and high repeatability. There was no difference between the average recovery rates in the two biological experiments with the second method. High recovery was also obtained when using the first method, in which the quinclorac was extracted with acetonitrile phosphoric acid solution and purified with sodium chloride, while the large impurity peak was presented with unstable baseline. The small impurity peak, smooth baseline, and good shape of target peak appeared when using the third method, in which the quinclorac was extracted with borax methanol solution and purified with dichloromethane, while the recovery was low with the rate of approximate 50%. The fourth method did not proceed because of difficulty in evaporation of the extraction solution in rotary evaporators, in which the quinclorac was extracted using methanol phosphoric acid solution without purification. Taken together, the second method was the most suitable method for quinclorac extraction in paddy field in Fujian Province.

quinclorac; high performance liquid chromatography; soil

2017-01-24

2017-03-16

福建農林大學校杰出青年科研人才計劃(xjq201621); 中國煙草總公司福建省公司科技項目(閩煙合同(2014)181號)

S 482.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.023

* 通信作者 E-mail:chenfengping1207@126.com

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