湖南省番茄和牽牛花上雙生病毒的分子鑒定

班一云, 丁 波, 周雪平

(中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

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湖南省番茄和牽牛花上雙生病毒的分子鑒定

班一云, 丁 波*, 周雪平*

(中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京 100193)

雙生病毒是一類在全世界范圍內廣泛發生的單鏈環狀DNA病毒。本文對從湖南采集到的6例(洋姜、番茄、蘿卜、賽葵、甘薯、牽牛花)疑似雙生病毒侵染的植物葉片進行了分子鑒定。利用滾環擴增技術(RCA)對樣品DNA進行擴增,分別對其RCA產物進行酶切,并將酶切得到的片段測序后進行BLAST比對,結果顯示番茄樣品中的病毒分離物與番茄黃化曲葉病毒相似性最高(99%),牽牛花樣品中的病毒分離物與甘薯卷葉病毒相似性最高(99%),證明這兩個分離物是單組分DNA-A雙生病毒。這是在湖南省首次發現并報道雙生病毒的全核酸序列。

番茄黃化曲葉病毒; 甘薯卷葉病毒; DNA-A

雙生病毒是一類具有孿生顆粒形態的植物單鏈DNA病毒,一般發生在熱帶和亞熱帶地區,寄主范圍十分廣泛,在全球范圍內造成重大損失[1]。番茄黃化曲葉病毒Tomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV)和甘薯卷葉病毒Sweetpotatoleafcurlvirus(SPLCV)均屬于雙生病毒科Geminiviridae的菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus,該屬病毒主要以煙粉虱傳播,危害極為嚴重[2-4]。番茄黃化曲葉病毒是侵染番茄LycopersiconesculentumMill的主要病毒之一,最早在以色列被發現,1964年正式被命名[5]。該病毒引起植株曲葉、黃化、矮化等癥狀,常對番茄栽培地區造成毀滅性危害[6]。我國是世界上最大的甘薯IpomoeabatatasLan生產國,而甘薯卷葉病毒主要侵染旋花科植物,其危害嚴重阻礙了甘薯產業的發展[7-8]。牽牛花Pharbitisnil是一種觀賞植物,并且具有藥用價值,其生長適應性強,田間路邊隨處可見。研究表明,雙生病毒可經煙粉虱在牽牛花與作物之間相互傳播[9-10],因此牽牛花對雙生病毒重組、傳播及擴散都有重要的作用,對作物生產構成了嚴重的威脅[11]。目前,受全球氣候變暖、國際貿易加強及人類活動等影響,雙生病毒病害在我國的危害范圍不斷擴大[12]。因此,對不同地區、不同寄主的雙生病毒進行鑒定,進一步明確該病害在我國的發生、分布及危害情況可為病毒病防控打下基礎。本研究對從湖南省采集的樣品進行了分子鑒定,發現番茄樣品被TYLCV侵染,而牽牛花樣品被SPLCV侵染,TYLCV和SPLCV分離物的全基因組大小均約2.8 kb的單鏈環狀DNA分子。病毒基因組共編碼6個開放閱讀框(open reading frame,ORF),分別為AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4[13-15],并未檢測到DNA-B和DNAβ組分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2016年10月在湖南省長沙市采集到疑似被雙生病毒侵染的植物葉片樣品6份,分別為洋姜、番茄(圖1a)、蘿卜、賽葵、甘薯和牽牛花(圖1b)。陽性對照為本實驗室保存的番茄黃化曲葉病毒和甘薯卷葉病毒。

圖1 從湖南省采集的番茄和牽牛花樣品的感病癥狀Fig.1 Symptoms of tomato and morning glory samples collected from Hunan Province

1.1.2 試劑及儀器

FastDigest內切酶,購自Thermo Scientific公司;pLB零背景快速克隆試劑盒,購自天根生化科技公司;2×EasyTaqPCR Super Mix,購自全式金生物技術公司;KOD-Plus-Neo高保真酶試劑盒,購自Toyobo公司;E.Z.N.A.Gel Extraction Kit,購自Omega Bio-Tek公司;TempliPhi Amplification Kit,購自GE公司;Centrifuge 5424離心機,購自Eppendorf公司;Gel Doc XR+凝膠成像系統,T100 Thermal Cycler PCR儀,購自Bio-Rad公司;Tissuelyser-48全自動快速樣品研磨儀,購自上海凈信科技公司。

1.2 方法

1.2.1 葉片總DNA提取

采用CTAB法提取樣品葉片總DNA。分別取0.1 g葉片組織放入預先加入一枚鋼珠的2 mL離心管中,液氮速凍后利用全自動快速樣品研磨儀將樣品研磨至粉狀,加入500 μL 65℃水浴預熱的2% CTAB抽提緩沖液,65℃水浴保溫1 h后加入等體積的24∶1的氯仿/異戊醇振蕩混勻,12 000 r/min離心10 min,轉移上清至新的1.5 mL離心管中。然后加入1/10體積醋酸鈉(pH=5.2)和2倍體積的-20℃預冷的無水乙醇,混勻后于-20℃放置1 h,12 000 r/min離心10 min以沉淀DNA,棄上清后用1 mL 75%乙醇將沉淀清洗1次,12 000 r/min離心10 min棄上清后干燥,最后加入適量去離子水溶解DNA,置于-20℃保存。

1.2.2 病毒基因組的滾環擴增及酶切鑒定

利用TempliPhi Amplification Kit對樣品總DNA進行滾環擴增。將1 μL DNA(約10～20 ng)加入到5 μL樣品緩沖液中,95℃變性3 min后立即置于冰上10 min,然后加入5 μL反應緩沖液和0.2 μL DNA聚合酶,混勻后置于30℃反應18～20 h,最后65℃加熱10 min以終止反應。選取多種雙生病毒含有的酶切位點,采用相應的限制性內切酶分別對6個樣品的RCA產物進行酶切以獲得特異性片段。

1.2.3 病毒基因組的克隆測序及全長序列獲取

將酶切得到的片段連接至pLB載體,由北京擎科生物公司進行測序,在NCBI網站對測序結果進行BLAST比對,結果表明番茄樣品分離物與TYLCV的相似性最高,牽牛花樣品分離物與SPLCV的相似性最高。根據測得的部分序列設計特異引物對：NdeI-F(5′-AAGTATGAGAATCATACTGAAAA-CGCC-3′)/NdeI-R(5′-GGCTGCCTCCTGATGATTATAAGTT-3′)和NcoI-F(5′-CAGATCGAATCA-CTTTCACCCCA-3′)/NcoI-R(5′-TTCGGTGAGACCAGATCGAAGA-3′)分別擴增番茄樣品和牽牛花樣品分離物的DNA-A全長。同時分別利用DNA-B組分的通用引物CR01/CR02[2]和DNA-β的通用引物beta01/beta02[16]對樣品進行PCR擴增,以期獲得DNA-B和DNA-β序列。

1.2.4 病毒基因組序列比對及進化樹構建

利用DNAMAN 5.2.2軟件對篩選的陽性克隆序列進行比對,最終確定病毒分離物的基因組全序列。在NCBI數據庫中進行BLAST相似性比對分析,并從中選取已報道的TYLCV和SPLCV的代表性同源序列,在MEGA 6.0[17]中采用鄰接法(Neighbor-joining)構建全基因組序列進化樹,系統進化樹中bootstrap參數值設置為1 000。

2 結果與分析

2.1 RCA產物酶切檢測

以提取的植物基因組總DNA為模板分別進行RCA擴增,通過酶切樣品的RCA產物,從番茄和牽牛花樣品中均得到了2.5～3.0 kb左右的條帶(圖2),割膠純化后克隆測序,序列BLAST比對結果顯示，番茄樣品的分離物與GenBank中番茄黃化曲葉病毒(KX034547)的相似性最高(99%),命名為TYLCV-HN(KY783940);牽牛花樣品中的分離物與甘薯卷葉病毒(FJ176701)的相似性最高(99%),命名為SPLCV-HN(KY783941)。利用通用引物CR01/CR02[2]和beta01/beta02[16]對樣品進行PCR擴增,結果均未檢測到DNA-B或DNA-β組分,推測TYLCV-HN和SPLCV-HN均為僅含有DNA-A組分的單組分雙生病毒。

圖2 湖南省采集樣品的RCA產物的酶切鑒定Fig.2 Enzyme digestion on the RCA products of samples from Hunan Province

2.2 病毒基因組的序列測定和分析

通過酶切RCA產物得到番茄和牽牛花樣品分離物的基因組片段,分別設計特異引物擴增DNA-A全長(圖3),每個分離物均檢測3個陽性克隆,測序結果表明各分離物病毒基因組序列之間無任何差異。其中,TYLCV-HN全長為2 781 bp,為單鏈閉合環狀DNA,共編碼6個ORF,其中病毒鏈編碼2個ORF：AV1(308-1084)和AV2(148-498),互補鏈編碼4個ORF：AC1(1542-2615)、AC2(1226-1633)、AC3(1081-1485)和AC4(2171-2464)。SPLCV-HN全長為2 827 bp,為單鏈閉合環狀DNA,共編碼6個ORF,其中病毒鏈編碼2個ORF：AV1(301-1065)和AV2(132-476),互補鏈編碼4個ORF：AC1(1587-2681)、AC2(1232-1678)、AC3(1081-1515)和AC4(2267-2524)。

圖3 利用特異引物擴增番茄樣品和牽牛花樣品中雙生病毒分離物基因組全長Fig.3 PCR amplification of the full genome of the geminiviruses on tomato and morning glory with specific primers

2.3 TYLCV-HN及SPLCV-HN的序列分析

從NCBI中選取有代表性的同源序列和TYLCV-HN和SPLCV-HN序列進行序列比對,采用鄰接法(neighbor-joining)分別對TYLCV和SPLCV構建進化樹(圖4)。從進化樹圖中可以看出,TYLCV-HN與云南分離物的親緣關系最近(圖4a),SPLCV-HN與江蘇、安徽等地分離物的親緣關系最近(圖4b)。

3 討論

本研究通過對從湖南省采集的6例樣品進行檢測及鑒定,證明雙生病毒的危害進一步擴大到了湖南省,為進一步研究我國雙生病毒的分布情況及分子變異情況提供了一定的科學依據。根據雙生病毒科病毒的命名規則,全基因組核酸序列的相似性大于89%被命名為同種病毒的不同株系,小于89%則被命名為不同種的病毒[18],因此將TYLCV-HN確定為TYLCV的一個分離物,SPLCV-HN為SPLCV的一個分離物。這是首次在湖南省發現并報道雙生病毒。

圖4 TYLCV和SPLCV不同分離物的核苷酸序列進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of different isolates of TYLCV and SPLCV

番茄在湖南省的生產生活中占有重要地位,它不僅是人們日常食用的主要蔬菜,番茄產業也為當地的農民增加了收入。然而,番茄黃化曲葉病毒病是一種發生于番茄上的毀滅性病害[19],它嚴重制約了番茄產業的發展。目前,該病害在我國傳播呈現出由南向北的發展趨勢,并且逐年加重[20]。從進化樹關系圖中可以看出,TYLCV-HN和云南等省市的分離物的序列親緣關系最近,并且其保守性也很高,所以我們推測從湖南省檢測到的雙生病毒很可能是從周邊省份傳入。湖北省與湖南省相鄰,并且在2015年已有雙生病毒發生的報道[21],但是兩地分離物的親緣關系卻不是最近(圖4a),可見分離物親緣關系的遠近并不與地域呈正相關。

由于TYLCV可隨種苗等傳播,所以有必要在調種前進行檢測,同時也建議加強田間管理工作,及時清除病苗和適時施肥等[22];而積極培育選擇抗病品種也會在很大程度上減少經濟損失。

甘薯卷葉病毒主要侵染旋花科植物,在中國從南到北均有發生,不但危害了甘薯產業的發展,還嚴重影響了牽牛花的經濟價值[7-8]。作為一種主要的觀賞植物,牽牛花在田間路邊隨處可見。研究表明,雙生病毒可經煙粉虱在牽牛花與作物之間互傳,作為雙生病毒的中間寄主,牽牛花對其重組、傳播及擴散都有重要的作用[9]。因此,在平時作物生產過程中應加強檢疫,使用無毒種苗,發現病株后及時拔除。

RCA是一種新近發展起來的恒溫核酸擴增方法,可以直接從樣品總DNA擴增目的DNA,實現對靶病毒的信號放大,在生物大分子檢測方面有重要的應用價值,同時也提高了雙生病毒的檢出率[23-24]。本研究通過酶切樣品的RCA產物快速準確地檢測到番茄和牽牛花樣品中的雙生病毒序列,進一步明確了該病害在我國的發生及分布情況,為雙生病毒病害的防控提供了參考。

[1] Hanley-Bowdoin L, Bejarano E R, Robertson D, et al. Geminiviruses: masters at redirecting and reprogramming plant processes [J]. Nature Reviews Microbiology, 2013, 11(11): 777-788.

[2] Fondong V N, Pita J S, Rey M E, et al. Evidence of synergism betweenAfricancassavamosaicvirusand a new double-recombinant geminivirus infecting cassava in Cameroon [J]. The Journal of General Virology, 2000, 81(1): 287-297.

[3] Shafiq M, Asad S, Zafar Y, et al.PepperleafcurlLahorevirusrequires the DNA B component ofTomatoleafcurlNewDelhivirusto cause leaf curl symptoms [J]. Virology Journal, 2010, 7(1): 367-374.

[4] Mansoor S, Briddon R W, Zafar Y, et al. Geminivirus disease complexes: an emerging threat [J]. Trends in Plant Science, 2003, 8(3): 128-134.

[5] Cohen S, Harpaz I. Periodic, rather than continual acquisition of a new tomato virus by its vector, the tobacco whitefly (BemisiatabaciGennadius) [J]. Entomologia Experimentalis et Applicata, 1964, 7(2): 155-166.

[6] 宋建軍, 劉紅宵, 仇燕, 等. 番茄黃化曲葉病毒病的發生分布及防治對策[J]. 北方園藝, 2010(7): 147-150.

[7] 喬貞貞, 秦艷紅, 喬奇, 等. 甘薯卷葉病毒江蘇分離物基因組全長序列測定及其外殼蛋白基因在大腸桿菌中的表達[J]. 河南農業科學, 2012, 41(4): 86-89.

[8] Valverde, R A, Clark C A, Valkonen J P T. Viruses and virus disease complexes of sweet potato [J]. Plant Viruses, 2007, 1(1): 116-126.

[9] Alvinm S, Ling Kaishu, Howard H F, et al.Sweetpotatoleafcurlvirus: Efficiency of acquisition, retention and transmission byBemisiatabaci(Hemiptera: Aleyrodidae) [J]. Crop Protection, 2009, 28(11): 1007-1011.

[10]Lotrakul P, Valverde R A, Clark C A, et al. Detection of a geminivirus infecting sweet potato in the United States [J]. Plant Disease, 2007, 82(11): 1253-1257.

[11]王向陽. 廣西勝紅薊黃脈病樣中發現多種菜豆金色花葉病毒屬的病毒[J]. 植物病理學報, 2007, 37(6): 679-682.

[12]周雪平. 雙生病毒種類鑒定、分子變異及致病機理研究[C]∥ 中國植物保護學會2015年學術年會, 2015.

[13]Moriones E, Navas-Castillo J.Tomatoyellowleafcurlvirus, an emerging virus complex causing epidemics worldwide [J]. Virus Research, 2000, 71(1/2): 123-134.

[14]Harrison B D, Swanson M M, Fargette D.Begomoviruscoat protein: serology, variation and functions [J]. Physiological & Molecular Plant Pathology, 2002, 60(5): 257-271.

[15]Rojas M R, Jiang Hao, Salati R, et al. Functional analysis of proteins involved in movement of the monopartite begomovirus,Tomatoyellowleafcurlvirus[J]. Virology, 2001, 291(1): 110-125.

[16]Bmugiira R B, Wu Jianbing, Wu Zujian, et al. Molecular characterization ofMalvastrumleafcurlGuangdongvirusisolated from Fujian, China [J]. 植物病理學報, 2008, 38(3): 258-262.

[17]Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA 6: Molecular evolutionary genetics analysis Version 6.0 [J]. Molecular Biology and Evolution, 2013, 30(12): 2725-2729.

[18]Fauquet C M, Bisaro D M, Briddon R W, et al. Revision of taxonomic criteria for species demarcation in the familyGeminiviridae, and an updated list of begomovirus species [J]. Archives of Virology, 2003, 148(2): 405-421.

[19]Glick E, Levy Y, Gafni Y. The viral etiology of tomato yellow leaf curl disease-a review [J]. Plant Protection Science, 2009, 45(3): 81-97.

[20]苗相偉. 番茄黃化曲葉病毒病的研究進展[J]. 中國果菜, 2017(3):31-35.

[21]湯亞飛, 何自福, 杜振國,等. 番茄黃化曲葉病毒在湖北首次報道[J]. 植物保護, 2015,41(5):233-236.

[22]徐德利, 楊靜, 鮑繼友, 等. 番茄黃化曲葉病毒病綜合防控技術研究進展[J]. 農業科技通訊, 2014(9): 254-257.

[23]Cheglakov Z, Weizmann Y, Basnar B, et al. Diagnosing viruses by the rolling circle amplified synthesis of DNAzymes [J]. Organic & Biomolecular Chemistry, 2007, 5(2): 223-225.

[24]Johne R, Müller H, Rector A, et al. Rolling-circle amplification of viral DNA genomes using phi29 polymerase [J]. Trends in Microbiology, 2009, 17(5): 205-211.

(責任編輯：楊明麗)

Molecular identification of geminiviruses on tomato and morning glory in Hunan Province

Ban Yiyun, Ding Bo, Zhou Xueping

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Geminiviruses including a group of single-stranded circular DNA viruses occurred worldwide. Six plant samples collected from Hunan Province with symptoms of suspicious geminivirus infection were examined in this study. After conducting rolling circle amplification (RCA), the RCA products were digested by restriction endonuclease. Sequencing analysis revealed that virus isolates from tomato and morning glory shared 99% of homology withTomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV) andSweetpotatoleafcurlvirus(SPLCV), respectively. These results indicated that tomato and morning glory plants were infected by monopartite geminivirus, and this is the first report of geminivirus infection in Hunan Province.

Tomatoyellowleafcurlvirus;Sweetpotatoleafcurlvirus; DNA-A

研究簡報ResearchNotes

2017-03-25

2017-04-27

國家自然科學基金重大項目(31390422)

S 436

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.025

* 通信作者 E-mail:bding@ippcaas.cn;zzhou@zju.edu.cn