一株侵染柑橘木虱的球孢白僵菌的分離及鑒定

宋曉兵, 彭埃天, 程保平, 凌金鋒, 陳 霞, 張煉輝

(1. 廣東省農業科學院植物保護研究所, 廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣州 510640; 2. 華南農業大學農學院, 廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室, 廣州 510640)

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一株侵染柑橘木虱的球孢白僵菌的分離及鑒定

宋曉兵1,2, 彭埃天1*, 程保平1, 凌金鋒1, 陳 霞1, 張煉輝2

(1. 廣東省農業科學院植物保護研究所, 廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣州 510640; 2. 華南農業大學農學院, 廣東省微生物信號與作物病害防控重點實驗室, 廣州 510640)

從柑橘木虱蟲體分離得到一株具有強致病性的蟲生真菌GZMS-28,本文測定了該菌株對柑橘木虱的致病性,并分析了其rDNA ITS基因序列。試驗結果表明,該菌株對柑橘木虱具有較強的致病性,濃度為1.0×108個/mL的分生孢子懸浮液處理柑橘木虱成蟲7 d后,其校正死亡率達到95.7%。菌株GZMS-28的培養特征與白僵菌屬球孢白僵菌較為一致,其rDNA ITS序列與GenBank中白僵菌屬多個球孢白僵菌菌株的對應序列相似性達到99%以上,因此將菌株GZMS-28鑒定為球孢白僵菌Beauveriabassiana。

柑橘木虱; 球孢白僵菌; 致病性; 生物防治

柑橘黃龍病(Huanglongbing)能侵染各種柑橘類植物,是柑橘產業上的毀滅性病害,目前暫無有效的防治藥劑,也沒有抗病品種可供生產應用[1]。柑橘黃龍病病原(CandidatusLiberibacter spp.)是韌皮部限制的革蘭氏陰性菌,至今尚未獲得廣泛認可的純培養[2]。柑橘黃龍病的人為傳播主要通過帶病接穗嫁接和帶病苗木調運,自然傳播主要通過柑橘木虱Diaphorinacitri[3-4]。取食病樹的柑橘木虱攜帶黃龍病菌后,再取食健康樹完成病菌的傳播[5],病原菌可以在柑橘木虱中腸上皮細胞增殖,后進入血腔繼續增殖,再擴散到其他組織,最終到達唾腺[6-9]。

目前對于柑橘木虱多采用化學防治措施,化學農藥的頻繁使用造成了農藥殘留、環境污染以及昆蟲抗藥性等諸多問題,而生物防治被認為是最有效和最具應用前景的防治手段。據統計全世界已記載的蟲生真菌大約有1 000種[10],而我國已發現的蟲生真菌涵蓋40多個屬400多種[11]。蟲生真菌是昆蟲種群的主要控制因素,自然界中全部病死昆蟲中約60%是由于感染真菌而導致死亡[12]。蟲生真菌侵染昆蟲的過程主要包括：識別寄主、機械破壞、分泌毒素、干擾代謝等,各種因素的共同作用導致寄主昆蟲死亡[13]。本研究通過收集柑橘木虱蟲體,進行病原真菌的分離,篩選出對柑橘木虱具有較強致病力的菌株,為利用蟲生真菌防治柑橘木虱提供原始材料,對促進柑橘木虱生物防治技術的順利開展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

分離蟲生真菌所用的柑橘木虱采集于廣東省廣州市天河區九里香MurrayaexoticaL.上,測定病原菌致病性所用的柑橘木虱為本實驗室溫室中九里香植株上常年繼代飼養的種群。

1.2 主要試劑和引物

2×EasyTaqPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司,基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司,用于蟲生真菌分離培養的培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基,所用PCR引物為擴增真菌ITS區域的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 蟲生真菌的分離純化

田間采集柑橘木虱在超凈工作臺上進行分離操作,將木虱成蟲浸于70%乙醇中消毒30 s,然后用0.1%升汞消毒1.5 min,再用滅菌水漂洗3次,用滅菌濾紙吸干木虱蟲體上的水分,然后放置于PDA平板中。在27℃恒溫培養箱中培養2～3 d,至蟲體周圍長出菌絲后,挑取菌絲轉至新的PDA平板上,如此重復3次,然后用稀釋純化法對病菌進行單菌落分離。最終將分離純化的菌株保存于PDA斜面培養基上,置于4℃冰箱保存。

1.4 菌株的致病性測定

將分離純化的菌株接種到PDA平板上,于27℃恒溫條件下培養10 d后,以滅菌水洗脫菌落上的分生孢子,制備成分生孢子懸浮液,用血球計數板確定孢子懸浮液的濃度,以滅菌水進行系列稀釋,獲得濃度分別為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107和1.0×108個/mL的分生孢子懸浮液,并向其中加入終濃度為0.1%的吐溫80。參照文獻[14]的接種方法,取健康柑橘木虱成蟲浸于不同濃度的分生孢子懸浮液中10～15 s,挑取處理后仍能活動自如的柑橘木虱放置于九里香幼嫩葉片上,然后置于27℃光照培養箱中(L∥D=14 h∥10 h,濕度95%以上)培養。上述各處理重復3次,每個重復為30頭柑橘木虱,設含0.1%吐溫80的滅菌水處理的柑橘木虱為空白對照。培養3 d后開始觀察病菌對柑橘木虱的侵染和致死情況,記錄柑橘木虱的死亡數量,計算死亡率和校正死亡率,死亡率(%)=[(總蟲數-存活蟲數)/總蟲數]×100,校正死亡率(%)=[(處理死亡率-對照死亡率)/(1-對照死亡率)] ×100,最后利用DPS軟件對所得數據進行回歸分析。

1.5 菌株形態特征

將菌株接種到PDA平板中央,置于27℃恒溫培養箱培養,定期觀察菌落生長情況,并記錄菌落顏色和形態,在光學顯微鏡下觀察菌絲和孢子形態。

1.6 ITS序列鑒定

將菌株接種至PD培養液,于27℃恒溫振蕩培養5 d,以滅菌濾紙過濾菌液,取適量菌絲于滅菌研缽中,加入液氮研磨至粉末狀,采用試劑盒法提取菌株總DNA。以提取的DNA為模板,利用通用引物ITS1和ITS4擴增菌株的rDNA ITS序列。PCR反應體系：DNA模板1 μL,2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,用ddH2O補足至總體積25 μL。反應條件為：95℃ 6 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 50 s,35個循環;72℃ 10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳觀察并拍照。

1.7 測序及序列分析

于瓊脂糖凝膠上割取PCR產物的目的條帶,利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化,然后交由Invitrogen公司利用引物ITS1/ITS4進行兩端測序。利用DNAStar軟件對所獲得的目的基因序列進行比較分析,然后利用BLAST進行序列相似性比對,采用MEGA 5.05軟件的鄰接法構建系統發育進化樹。

2 結果與分析

2.1 菌株致病性測定

通過篩選獲得1株對柑橘木虱具有強致病力的菌株,命名為GZMS-28。試驗結果表明,接種的分生孢子懸浮液濃度越高,對柑橘木虱的致死效果越好,菌株GZMS-28對柑橘木虱的LT50和LT90也越短。濃度為1.0×104個/mL的分生孢子懸浮液對柑橘木虱的LT50為10.03 d,而濃度為1.0×108個/mL的分生孢子懸浮液的LT50僅為2.51 d;濃度為1.0×104個/mL的分生孢子懸浮液對柑橘木虱的LT90為33.37 d,而濃度為1.0×108個/mL的分生孢子懸浮液的LT90僅為5.28 d(表1)。

表1 球孢白僵菌不同孢子濃度對柑橘木虱的毒力測定結果

Table 1 Virulence test ofBeauveriabassianawith different spore concentrations againstDiaphorinacitri

孢子濃度/個·mL-1Concentration毒力回歸方程ToxicityregressionequationLT50/dLT90/d相關系數(r)Correlationcoefficient1.0×104Y=2.54104+2.45534X10.0333.370.99651.0×105Y=2.92384+2.28726X8.0929.380.98701.0×106Y=3.17156+2.44340X5.6018.740.99921.0×107Y=3.38231+2.61613X4.1512.830.99811.0×108Y=3.40885+3.97393X2.515.280.9995

接種后孵育時間越長,柑橘木虱成蟲的死亡率越高,菌株GZMS-28對柑橘木虱的LD50和LD90也越小。接種后3 d,菌株GZMS-28對柑橘木虱的LD50為3.43×107個/mL,接種后7 d僅為2.16×105個/mL,接種后10 d則僅為1.36×104個/mL;接種后3 d,菌株GZMS-28對柑橘木虱的LD90為5.63×1010個/mL,接種后7 d僅為2.14×108個/mL,接種后10 d則僅為3.05×107個/mL(表2)。

表2 不同孵育時間下球孢白僵菌對柑橘木虱的毒力測定結果

Table 2 Virulence test ofBeauveriabassianaat different incubation times againstDiaphorinacitri

孵育時間/dIncubationtime毒力回歸方程ToxicityregressionequationLD50/個·mL-1LD90/個·mL-1相關系數(r)Correlationcoefficient3Y=1.99704+0.39855X3.43×1075.63×10100.97727Y=2.71655+0.42800X2.16×1052.14×1080.971510Y=3.41788+0.38261X1.36×1043.05×1070.9737

試驗結果表明,經1.0×104個/mL的孢子懸浮液處理柑橘木虱成蟲后3 d的校正死亡率為11.0%,處理后7 d的校正死亡率達31.8%;經1.0×108個/mL的孢子懸浮液處理柑橘木虱成蟲后3 d的校正死亡率為62.0%,處理后7 d的校正死亡率達95.7%。試驗處理后2 d,利用體視顯微鏡觀察,在一些柑橘木虱蟲體表觀察到真菌的菌絲,處理后7 d,肉眼可見菌株GZMS-28的產孢結構,試驗中還發現菌株GZMS-28對柑橘木虱若蟲也具有侵染性(圖1)。

圖1 菌株GZMS-28對柑橘木虱若蟲及成蟲的侵染Fig.1 The strain GZMS-28 infecting citrus psyllid nymph and adult

2.2 菌株培養特性和形態特征

菌株GZMS-28在PDA培養基上于27℃恒溫條件培養,其菌落為乳白色絮狀,菌落蓬松、呈放射狀生長,圓形或不規則形,菌絲生長較慢,但產孢速度較快,后期菌落背面呈淡黃色。菌株產孢細胞輪生或單生,分生孢子梗向頂部軸式產孢,形成彎曲的具有凸起的產孢軸。分生孢子透明,球形或卵形,壁薄,大小為2.5 μm×3.5 μm(圖2)。

圖2 菌株GZMS-28在光學顯微鏡下的形態特征(目鏡×物鏡=10×40倍)Fig.2 Morphological characteristics of the strain GZMS-28 under an optical microscope(400×)

2.3 菌株序列分析

經瓊脂糖凝膠電泳檢測,利用通用引物ITS1/ITS4擴增的PCR產物大小為570 bp左右。測序后用NCBI BLAST進行在線比對,菌株GZMS-28的rDNA ITS序列與GenBank數據庫中多個球孢白僵菌菌株的對應序列(GenBank No. JX122736,JQ320365,GU565572,AY531972等)的相似性高達99%。在系統發育樹中,菌株GZMS-28與Beauveriabassiana的多個分離物聚為1個分支,而宛氏擬青霉Paecilomycesvariotii的菌株(GenBank No. AY753335)則單獨聚為另外1個分支(圖3)。

圖3 基于rDNA ITS序列構建的菌株GZMS-28和其他球孢白僵菌的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of GZMS-28 isolate and other Beauveria bassiana based on rDNA ITS sequences

根據菌株GZMS-28的培養特性、形態特征及rDNA ITS的序列分析,可將所分離的菌株鑒定為白僵菌屬的球孢白僵菌。在分類地位上屬于半知菌亞門Deuteromycotina,絲孢綱Hyphomycetes,叢梗孢目Moniliales,叢梗孢科Moniliaceae,白僵菌屬Beauveria,球孢白僵菌Beauveriabassiana,GenBank登錄號為KT715480。

3 小結與討論

球孢白僵菌是一種重要的昆蟲病原真菌,對環境和脊椎動物無害,其殺蟲譜廣,致病性強,是目前國內應用最廣泛的昆蟲病原真菌,但工業化、標準化及劑型加工等方面進展緩慢[15]。張艷璇等通過室內毒力試驗發現球孢白僵菌對柑橘木虱具有強致死作用,1.0×104個/mL的孢子懸浮液作用第10天,柑橘木虱累計校正死亡率為92.68%[16]。利用胡瓜鈍綏螨搭載白僵菌控制柑橘木虱,在兩者共同作用下柑橘木虱卵和成蟲3 d后的死亡率和患病率分別為98.4%和98.8%,對低齡若蟲的感染率高達100%[17];Lezamagutiérrez等測定了球孢白僵菌對柑橘木虱的致病力,結果顯示,球孢白僵菌對柑橘木虱成蟲的致死率為42%,對柑橘木虱若蟲的致死率為40%[18]。Pinto等測定了球孢白僵菌對柑橘木虱若蟲的致死濃度及其與殺蟲藥劑的兼容性,結果表明,侵染10 d后的LC50為0.4×107個/mL,LC90為6.7×107個/mL,在溫室條件下,殺蟲藥劑不影響球孢白僵菌在柑橘上的定殖[19]。

球孢白僵菌對昆蟲寄主的侵染是機械壓力和酶共同作用的結果[20],前人研究表明,在孢子萌發和侵入時需要多種酶類來降解昆蟲表皮,包括蛋白質酶、幾丁質酶、酯酶、脂酶以及淀粉酶,其中蛋白質酶和幾丁質酶被認為是與侵染相關的主要酶類[21-23]。球孢白僵菌中的幾丁質酶基因Bbchitl和Bbchit2已被克隆,高效表達幾丁質酶基因Bbchitl能顯著提高球孢白僵菌的毒力,重組菌株的致死中時LT50和致死中濃度LC50均顯著低于野生型菌株[24],而且雙價基因工程菌的毒力高于Bbchit l的工程菌株[25-27]。利用基因工程技術獲得高效、穩定的工程菌株,將增強球孢白僵菌對柑橘木虱的毒力、對環境的適應性、延長孢子儲藏期,對促進球孢白僵菌殺蟲劑商品化生產和應用具有重要意義。

在真菌分類體系中白僵菌一直屬于半知菌亞門,絲孢綱,叢梗孢目,叢梗孢科,白僵菌屬[28],本文仍沿用了傳統的白僵菌分類體系。隨著對白僵菌分子進化和系統發育的研究,將白僵菌歸類于雙核亞界,子囊菌門,盤菌亞門,糞殼菌綱,肉座菌亞綱,肉座菌目,蟲草菌科,蟲草屬[29]。Rehner等對不同國家和地區的86株白僵菌進行了ITS和延長因子的分析,將白僵菌分為6個進化支,分別為A：球孢白僵菌,包括有性和無性型球孢白僵菌;B：布氏白僵菌;C：無性型且源自歐洲和北美洲的球孢白僵菌;D：蘇格蘭白僵菌和蠕孢白僵菌;E：無性型和有性型且源自亞洲的白僵菌;F：多形白僵菌[30]。

本文測定了球孢白僵菌菌株GZMS-28對柑橘木虱的致病性,該菌株產孢速度快,致死率高,具有較好的生防潛力。菌株的產孢條件、孢子萌發率、生長速率等生物學特性需要進一步研究,尤其是菌株的田間應用效果有待試驗,未來可將其開發成優良的生防菌制劑,促進柑橘木虱蟲生真菌殺蟲劑的產業化進程。

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(責任編輯：楊明麗)

Isolation and identification of aBeauveriabassianastrain infectingDiaphorinacitri

Song Xiaobing1,2, Peng Aitian1, Cheng Baoping1, Ling Jinfeng1, Chen Xia1, Zhang Lianhui2

(1.ResearchInstituteofPlantProtection,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection,Guangzhou510640,China; 2.AgriculturalCollegeofSouthChinaAgriculturalUniversity,GuangdongProvinceKeyLaboratoryofMicrobialSignalsandDiseaseControl,Guangzhou510640,China)

The strain GZMS-28 with strong pathogenicity was isolated fromDiaphorinacitriand its pathogenicity againstD.citriwas examined. Its rDNA ITS gene sequence was also analyzed.D.citriadults were treated by conidial suspension at the concentration of 1.0×108spores/mL, and the corrected mortality rate was 95.7% after 7 days. The results showed that the strain has a strong pathogenicity againstD.citri. The study found that the morphological characteristics of the strain were consistent with that ofBeauveriabassiana. The sequence alignment result showed that the strain GZMS-28 shared 99% homology with the sequences retrieved from GenBank (acc. nos. JX122736, JQ320365, GU565572 and AY531972). According to the morphological characteristics and rDNA ITS sequence analysis, the strain GZMS-28 was identified asB.bassiana.

Diaphorinacitri;Beauveriabassiana; pathogenicity; biocontrol

2016-04-11

2016-07-16

廣東省農業領域引導項目(2013B020309004)；廣東省科技計劃項目(廣東省農作物病蟲害綠色防控技術研究開發中心建設)；廣東省公益研究與能力建設項目(2014B020203003)；廣東省現代農業產業技術體系建設專項(2016LM1077)

S 436.661, S 476.12

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.026

* 通信作者 E-mail：pengait@163.com