甘肅定西地區甘藍枯萎病病原菌的分離與鑒定

申永銘, 李海源, 陳愛昌, 魏周全, 胡小平*

(1.西北農林科技大學植物保護學院, 楊凌 712100;2. 甘肅定西市植保植檢站, 定西 743000)

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甘肅定西地區甘藍枯萎病病原菌的分離與鑒定

申永銘1, 李海源1, 陳愛昌2, 魏周全2, 胡小平1*

(1.西北農林科技大學植物保護學院, 楊凌 712100;2. 甘肅定西市植保植檢站, 定西 743000)

自2009年起,甘肅定西地區出現了甘藍植株矮化、葉片黃化、枯萎甚至死亡的現象。2015年8月,我們采集了田間病株樣本,使用常規組織分離法對病原菌進行了分離和純化,依據柯赫氏法則進行了病原菌確認,并通過形態學和分子生物學方法對病原菌進行了鑒定。結果表明病原菌的形態學特征與尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum一致,其rDNA-ITS、rDNA-IGS以及EF-1α序列與尖孢鐮刀菌F.oxysporum相似性達99%,基于病原菌及尖孢鐮刀菌各代表專化型EF-1α序列構建的系統發育樹將該菌與尖孢鐮刀菌黏團專化型F.oxysporumf.sp.conglutinans聚為一類,故引致甘肅定西地區甘藍枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌黏團專化型F.oxysporumf.sp.conglutinans。

EF-1α;Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans; 鐮刀菌

甘藍枯萎病是一種危害性極強的土傳性病害,最早于1899年發現于美國紐約州,目前在全世界多數夏秋甘藍栽培地區都有發生,如美國、加拿大、希臘、日本等[1-4]。在我國,該病害僅在北京延慶和山西壽陽地區有病原菌分離鑒定的記載[5-8]。

甘肅省定西市位于甘肅省中部,地處秦嶺以西黃土高原溝壑丘陵區,屬于南溫帶半濕潤、中溫帶半干旱區,夏季氣候涼爽,雨量相對充沛,晝夜溫差大,有利于各類蔬菜干物質的積累,因此成為西北最大的高原夏菜產地。甘藍作為當地的重要經濟作物之一,有著悠久的種植歷史和近0.67萬hm2的種植面積。但自2009年起,在田間出現了甘藍葉片黃化,植株枯萎、死亡等癥狀。2016年,該病害的累計危害面積近0.2萬hm2,占當地甘藍種植總面積的30%,嚴重影響了甘藍的質量和產量,造成了嚴重的經濟損失。本文從甘肅定西地區采集了發病甘藍樣品,并進行了病原菌的分離與鑒定。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離純化

2015年8月于甘肅省定西市安定區采集具有典型癥狀的病害樣品,用常規組織分離方法進行病原菌分離與純化[9]。

1.2 致病性測定

采用蘸根法對分離物進行致病性測定。將分離物于馬鈴薯葡萄糖液體培養基(potato dextrose broth, PDB)中搖培3 d后,濾除菌絲,收集孢子懸浮液,將其孢子濃度調至1×107個/mL。將兩葉一心期‘秋悅’甘藍(邢蔬種業有限公司)幼苗的根部浸于孢子懸浮液中15 min,移植在裝有無菌土的10 cm×10 cm(口徑×高度)營養缽中,以無菌水蘸根處理的甘藍幼苗作為空白對照。14 d后觀察記載甘藍發病情況。同時,采用常規組織分離方法對病原菌進行再分離,將分離物與初始接種體進行形態學比較。

1.3 病原菌形態特征觀察

將病原菌接種于馬鈴薯葡萄糖培養基(potato dextrose agar, PDA)上,25℃黑暗培養,3 d后觀察菌落形態特征,并在光學顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子及產孢結構等形態特征。

1.4 病原菌分子鑒定

1.4.1 DNA提取

將病原菌接種于鋪有玻璃紙的PDA平板上,25℃黑暗培養5 d后收集菌絲,干燥后取0.2 g菌絲于研缽中,加入液氮研磨至粉狀后置于無菌的2.0 mL離心管中,加入800 μL 2% CTAB溶液混勻,65℃水浴15 min;然后加入800 μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1),混勻后離心15 min (12 000 r/min),取上清液,在上清液中加入800 μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1),混勻后離心15 min (12 000 r/min),取上清液,在上清液中加入350 μL冰異丙醇,混勻后于4℃下靜置30 min,在4℃條件下離心15 min (12 000 r/min),棄上清液,用75%乙醇洗滌沉淀2次,再用無水乙醇洗滌1次,晾干后加入50 μL超純水充分溶解。利用Nanodrop2000檢測合格后,于-20℃下保存備用。

1.4.2 病原菌ITS、IGS及EF-1α序列擴增及測序

PCR擴增病原菌核糖體DNA內轉錄間隔區(ribosome DNA internal transcribed spacer, rDNA-ITS)、核糖體DNA基因間隔區(intergenic spacer, IGS)及延長因子-1α(elongation factors-1α, EF-1α)序列。反應體系25 μL:上下游引物(10 μmol/L) 各0.5 μL,10×TransTaq?-T Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,TransTaq?-T DNA polymerase 0.25 μL,模板DNA (50 ng/μL) l μL, ddH2O 18.25 μL。所用引物及PCR程序見表1。PCR產物送英濰捷基(上海)貿易有限公司進行測序。

1.4.3 數據分析

將測序結果進行BLAST比對分析。從GenBank下載鐮刀菌屬代表種及尖孢鐮刀菌不同專化型菌株的EF-1α序列,用ClustalX(1.8)進行多重序列比對后,將序列信息導入MEGA(4.0)通過鄰接法(neighbor-joining)構建系統發育樹,同時利用Bootstrap(10 000次重復)檢驗各分支的置信度。

表1 引物信息及PCR擴增程序

Table 1 Information of primers and PCR programs

引物Primer引物序列(5'-3')Primersequence擴增區域AmplificationregionPCR擴增程序PCRprogramITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGCITS4TCCTCCGCTTATTGATATGCITS[10]94℃5min;94℃30s、55℃30s、72℃1min,35個循環;72℃10minNL11CTGAACGCCTCTAAGTCAGCNS1GAGACAAGCATATGACTACIGS[11]94℃5min;94℃30s、55℃30s、72℃3min,35個循環;72℃10minEF-1ATGGGTAAGGARGACAAGACEF-2GGARGTACCAGTSATCATGTTEF-1α[12]94℃5min;94℃30s、55℃30s、72℃1min,35個循環;72℃10min

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

甘藍枯萎病在田間會形成典型的發病中心,中心的面積表現出連年擴展的趨勢,所輻射的區域也逐年擴大。處于發病中心邊緣的病株一般發病較輕,僅植株下部部分葉片表現出沿葉脈黃化并伴有輕微萎蔫的現象,病株莖部橫截面維管束處明顯變褐,越靠近發病中心,病情越加嚴重,病株葉片幾乎完全黃化,植株矮化枯死,以致田間出現明顯的缺苗斷壟現象(圖1)。

圖1 甘藍枯萎病發病癥狀Fig.1 Symptoms of cabbage Fusarium wilt

2.2 致病性測定

經過病原菌的分離與純化后共得到17個分離物,根據形態學特征歸為DXF001、DXF002、DXF003和DXF004四類。其中,DXF001包含11個分離物,占總分離物的64.7%;DXF002包含3個分離物,占總分離物的17.6%;DXF003包含2個分離物,占總分離物的11.8%;DXF004包含1個分離物,占總分離物的5.9%。從每類分離物中選取一個代表性菌株,分別為DXF001-01、DXF002-01、DXF003-01和DXF004-01,用于致病性測定。結果顯示,接種14 d后只有接種DXF001-01的植株表現出典型的甘藍枯萎病癥狀(圖2 b)。再分離物與DXF001-01表現出一致的形態學特征,說明DXF001-01為甘藍枯萎病的病原菌。

圖2 病原菌對甘藍致病性測定Fig.2 Pathogenicity identification of the pathogen to cabbage

2.3 病原菌形態特征

在PDA培養基平板上培養4 d后,病原菌菌落圓形白色,氣生菌絲致密(圖3a);顯微觀察可見其菌絲呈絲狀、無色并伴有隔膜。病原菌產生大量的小型分生孢子和少量的大型分生孢子,其中小型分生孢子為卵圓形至長橢球形或腎型,無隔膜或具1個隔膜,大小為(3.8～15.0)μm×(1.5～5.0)μm,假頭狀著生于細長、瓶狀的分生孢子梗上;大型分生孢子鐮刀狀,兩端尖,一般具3～5個隔膜,大小為(18.6～33.8)μm×(3.2～6.2)μm(圖3b)。根據病原菌的形態學特征,依據Booth的鐮刀菌屬分類系統[13],該病原菌被鑒定為尖孢鐮刀菌F.oxysporum。

圖3 病原菌于PDA培養基上的培養特征Fig.3 Cultural characteristics of the pathogen on potato dextrose agar (PDA)

2.4 病原菌的分子鑒定

病原菌ITS、IGS及EF-1α序列的測序結果在GenBank的注冊號分別為LC165017、LC165016和LC165018,BLAST分析結果顯示這3個序列分別與尖孢鐮刀菌F.oxysporum的相似性達到了99%、99%和100%。利用病原菌與尖孢鐮刀菌各專化型菌株的EF-1α序列信息,構建系統發育樹,結果顯示EF-1α可以對Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans、Fusariumoxysporumf.sp.lilii、Fusariumoxysporumf.sp.melonis等10個尖孢鐮刀菌專化型進行聚類(圖4)。最終DXF001-01被鑒定為尖孢鐮刀菌黏團專化型(F.oxysporumf.sp.conglutinans)。

圖4 尖孢鐮刀菌代表專化型及DXF001-01 EF-1α基因系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of translation elongation factor 1α (EF-1α) genes of DXF001-01 and Fusarium oxysporum formae speciales

3 討論

甘藍枯萎病首次發現于北京延慶地區,其病原菌被確定為尖孢鐮刀菌黏團專化型F.oxysporumf.sp.conglutinans[5,7]。張揚等報道,在北京延慶地區除尖孢鐮刀菌黏團專化型F.oxysporumf.sp.conglutinans外,輪枝樣鐮刀菌F.verticillioides也可導致甘藍枯萎病的發生[6]。田仁鵬從山西壽陽地區甘藍枯萎病株上分離到的GLHW1,經鑒定為尖孢鐮刀菌F.oxysporum[8]。本文則通過形態學觀察結合分子生物學方法將甘肅定西地區甘藍枯萎病鑒定為尖孢鐮刀菌黏團專化型F.oxysporumf.sp.conglutinans。

隨著現代分子生物學技術的發展,病原菌的鑒定不再局限于形態學的觀察。本文對病原菌的ITS序列進行了測序,通過序列比對將病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌F.oxysporum。雖然ITS在進化的過程中具有高度的保守性,但是由于鐮刀菌ITS2存在非同源的拷貝,可能會導致不準確的鑒定結果[14]。而EF-1α序列對鐮刀菌系統發育學種的鑒定具有很大的可用性,它在鐮刀菌種的水平上具有豐富的信息量,在鐮刀菌屬中也并未發現 EF-1α 序列的非直系同源拷貝[12]。目前已有很多學者利用EF-1α構建系統發育樹成功地對鐮刀菌進行了鑒定[15-17]。為了保證鑒定結果的準確性,本文對病原菌的EF-1α序列進行了擴增、測序,并將測序結果與其他尖孢鐮刀菌專化型的EF-1α序列進行建樹分析,結果顯示,EF-1α基因可以對Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans、Fusariumoxysporumf.sp.lilii、Fusariumoxysporumf.sp.melonis等10個尖孢鐮刀菌專化型進行聚類,本文所分離的病原菌劃歸于尖孢鐮刀菌黏團專化型F.oxysporumf.sp.conglutinans,與前人的研究結果相一致[5-7]。

有文獻曾報道尖孢鐮刀菌黏團專化型F.oxysporumf.sp.conglutinans的寄主范圍十分廣泛,不僅可以侵染大多數十字花科作物,還能侵染茄科、葫蘆科、豆科、菊科、旋花科、傘形科及百合科等主要蔬菜作物,并使其成為無癥帶菌的隱性寄主[3,5,18-19]。而甘肅定西是西北最大的高原夏菜產地之一,蔬菜品種多,種植面積廣,因此尖孢鐮刀菌黏團專化型F.oxysporumf.sp.conglutinans不僅會對當地甘藍的生產造成嚴重的影響,也會成為其他蔬菜生產的潛在隱患。本研究結果為當地甘藍枯萎病的防治奠定了可靠的理論基礎。

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(責任編輯：楊明麗)

Isolation and identification of the pathogen causing cabbage wilt in Dingxi District, Gansu Province

Shen Yongming1, Li Haiyuan1, Chen Aichang2, Wei Zhouquan2, Hu Xiaoping1

(1.CollegeofPlantProtection,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China; 2.DingxiStationofPlantProtectionandQuarantine,Gansu743000,China)

Symptoms of stunting, leaf yellowing, withered and dead of cabbage were observed in Dingxi District, Gansu Province since 2009. Samples were collected from diseased field in August, 2015. The pathogen was isolated and purified by the method of general tissue isolation, confirmed according to Koch’s postulates, and identified by morphologic characteristics and molecular identification. The results showed that morphologic characteristics of the pathogen were consistent with those ofFusariumoxysporum. The similarity of rDNA-ITS, rDNA-IGS and EF-1α betweenF.oxysporumand the pathogen is 99%. The phylogenetic analysis of EF-1α gene sequences ofF.oxysporumformaespecialesand the pathogen showed that the pathogen was classified asF.oxysporumf.sp.conglutinans. Thus, the pathogen of cabbage wilt in Dingxi, Gansu wasF.oxysporumf.sp.conglutinans.

EF-1α;Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans;Fusarium

2016-09-07

2016-11-14

定西市蔬菜產業科技提升項目(DXSK2016006);高原夏菜病害防治技術與應用項目

S 436.35

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.032

* 通信作者 E-mail:xphu@nwsuaf.edu.cn