氧化苦參堿對牙齦卟啉菌內(nèi)毒素作用下人牙周膜細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響

汪義永， 陳 凌， 魏 斌， 吳 贇

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氧化苦參堿對牙齦卟啉菌內(nèi)毒素作用下人牙周膜細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響

汪義永， 陳 凌， 魏 斌， 吳 贇

目的 研究氧化苦參堿對牙齦卟啉菌內(nèi)毒素(Pg-LPS)作用下人牙周膜細(xì)胞(PDLC)堿性磷酸酶(ALP)的活性及其表達(dá)的影響。 方法 采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離PDLC，對照組為僅含1%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，實驗組分別加入不同濃度的氧化苦參堿溶液和Pg-LPS。采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和酶聯(lián)免疫、實時熒光定量RT-PCR技術(shù)，觀察Pg-LPS對PDLC的ALP活性及其表達(dá)的影響。 結(jié)果 在25 μg/mL的Pg-LPS作用下，PDLC的ALP活性及其表達(dá)明顯減低，加入一定濃度的氧化苦參堿溶液后，PDLC的ALP活性及其表達(dá)有一定程度恢復(fù)。 結(jié)論 氧化苦參堿可以減輕Pg-LPS對PDLC的破壞，對Pg-LPS抑制PDLC的ALP活性及其表達(dá)的現(xiàn)象具有拮抗作用。

氧化苦參堿； 內(nèi)毒素類； 牙齦/微生物學(xué)； 擬桿菌屬； 牙周膜/細(xì)胞學(xué)； 堿性磷酸酶

研究表明，體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cell, PDLC)具有成骨細(xì)胞樣特性，牙齦卟啉菌內(nèi)毒素(porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide, Pg-LPS)是破壞牙周支持組織的重要致病物質(zhì)，可抑制PDLC的堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, ALP)活性，對PDLC的分化產(chǎn)生嚴(yán)重影響，造成牙周膜的修復(fù)過程不能正常進(jìn)行[1-2]。氧化苦參堿是從中藥苦參中提取的有重要藥理活性的成分，已有多類制劑被研發(fā)，并廣泛應(yīng)用于抗炎、抗病毒、抗腫瘤及免疫治療等方面，具有良好的應(yīng)用前景。現(xiàn)本課題組通過觀察氧化苦參堿對Pg-LPS抑制PDLC的ALP活性及其表達(dá)的影響，研究其是否能夠?qū)筆g-LPS對牙周組織的破壞，為氧化苦參堿用于牙周病防治的可能性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、新生牛血清及胰蛋白酶(美國Gibco公司)；雙抗(青霉素：100 U/mL；鏈霉素：100 μg/mL，美國Hyclone公司)；PBS(杭州吉諾生物科技有限公司)；Triton X-100(華美生物工程公司)；ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Pg-LPS(晶美生物工程公司)；氧化苦參堿(陜西惠科生物工程)。

1.2 方法

1.2.1 PDLC分離培養(yǎng) 健康雙尖牙4顆(無牙體牙髓及牙周病變)，置于4 ℃的含雙抗的平衡鹽溶液中，在超凈工作臺內(nèi)用PBS沖洗牙根表面血污，用功刮勺刮去牙根中1/3的牙周膜，再用0.2%的Ⅰ型膠原酶37 ℃水浴消化40 min，加入4 mL含20%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液(37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.045的CO2)進(jìn)行培養(yǎng)。使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長及形態(tài)變化，當(dāng)細(xì)胞鋪滿孔底的60%～80%，消化傳代培養(yǎng)，免疫組織化學(xué)法鑒定組織來源，礦化誘導(dǎo)后茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況，取4～6代細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 氧化苦參堿對Pg-LPS作用下PDLC的ALP活性的影響 將生長狀況良好的第4代PDLC用胰酶-EDTA消化后計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于96孔培養(yǎng)板。接種細(xì)胞濃度為1×105mL-1，待細(xì)胞貼壁后在無菌超凈工作臺內(nèi)棄去上清，PBS清洗3次，并分為5組，每組設(shè)6個復(fù)孔。A組為空白對照組，僅含1%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液；B組為25 μg/mL的Pg-LPS刺激組；C組為25 μg/mL的Pg-LPS+1 μg/mL氧化苦參堿；D組為25 μg/mL的Pg-LPS+10 μg/mL氧化苦參堿；E組為25 μg/mL的Pg-LPS+25 μg/mL氧化苦參堿。去除培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加入0.1% Triton X-100 100 μL，4 ℃冰箱過夜。觀察已無完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)后，吹打，按ALP試劑盒說明書操作，加入緩沖液50 μL，基質(zhì)液50 μL，底物100 μL，37 ℃孵育30 min，酶聯(lián)儀于520 nm下測吸光度值。

1.2.3 實時熒光定量RT-PCR檢測ALP mRNA的表達(dá)水平

1.2.3.1 細(xì)胞RNA的提取 將生長狀態(tài)良好的第4代PDLC傳入25 cm2的培養(yǎng)瓶，按上述分組連續(xù)培養(yǎng)24 h，使用Trizol RNA提取液提取PDLC中的RNA。取適量的RNA分別進(jìn)行定量與瓊脂糖凝膠電泳，鑒定提取效果。

1.2.3.2 逆轉(zhuǎn)錄 樣本cDNA合成，反應(yīng)體系如下：逆轉(zhuǎn)錄Buffer 2 μL，上下游引物均為0.2 μL，dNTP 0.1 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，DEPC水5 μL，RNA模板2 μL，總體積10 μL。加入逆轉(zhuǎn)錄酶之前，先于70 ℃下干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致。加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，37 ℃水浴60 min。取出后立即于95 ℃下干浴3 min，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液，即cDNA溶液，保存于-80 ℃待用。

1.2.3.3 熒光定量PCR檢測

1.2.3.3.1 GAPDH陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為1011mmol/L，反應(yīng)前取3 μL，按10倍稀釋(加水27 μL并充分混勻)為1010mmol/L，依次稀釋至109,108,107,106,105及104mmol/L，備用。

1.2.3.3.2 采用TAKARA SYBR Green染料法對PCR反應(yīng)進(jìn)行熒光定量檢測，反應(yīng)體系共50 μL，其中：模板5 μL，上下游引物各0.8 μL， SYBR Green PCR Mix 25 μL， ddH2O 18.4 μL，進(jìn)行PCR循環(huán)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 60 s→95 ℃ 15 s→60 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。

GAPDH引物：

上游：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′

下游：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′

ALP引物：

上游：5′-ACCATTCCCACGTCTTCACATTT-3′

下游：5′-AGACATTCTCTCGTTCACCGCC-3′

1.2.3.4 Real-Time PCR結(jié)果分析 使用熒光定量PCR分析軟件，根據(jù)陽性內(nèi)參模板GAPDH制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對ALP cDNA擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，作為mRNA表達(dá)水平的相對值。

2 結(jié) 果

2.1 體外培養(yǎng)PDLC培養(yǎng)礦化能力檢測 培養(yǎng)6 d后組織塊周圍見細(xì)胞爬出，呈長梭形或星形(圖1A)。培養(yǎng)時間增長，見礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)組的胞密度逐漸增大，出現(xiàn)不透光黑色結(jié)節(jié)并逐漸增大(圖1B)；茜素紅染色后可見礦化誘導(dǎo)液實驗組形成多處紅染礦化結(jié)節(jié)，顯示為鈣鹽沉積部位(圖1C)。

A：人牙周膜細(xì)胞；B：礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)；C：茜素紅染色.圖1 人牙周膜細(xì)胞及其培養(yǎng)礦化檢測Fig 1 Human periodontal ligament cells mineralization

2.2 不同濃度氧化苦參堿對Pg-LPS作用下PDLC的ALP活性的影響 25 μg/mL的Pg-LPS能夠有效降低PDLC的ALP活性，而加入不同濃度氧化苦參堿后，ALP的活性均有所提高(表1)。

2.3 PCR產(chǎn)物結(jié)果 25 μg/mL的Pg-LPS作用于PDLC后，其ALP mRNA的表達(dá)明顯降低，與空白對照組比較，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。加入Pg-LPS，并以1，10，25 μg/mL的氧化苦參堿作用，3組PDLC表達(dá)的ALP mRNA水平均有所增高，并在一定范圍內(nèi)隨濃度的增高而增加，加入氧化苦參堿的3個實驗組與僅加入25 μg/mL Pg-LPS的實驗組間比較，差別均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

表1 不同時間點各組堿性磷酸酶活性

Pg-LPS：牙齦卟啉菌內(nèi)毒素. A：空白對照組； B：Pg-LPS刺激組； C：Pg-LPS+1 μg/mL氧化苦參堿； D：Pg-LPS+10 μg/mL氧化苦參堿； E：Pg-LPS+25 μg/mL氧化苦參堿. 與B組比較，☆：P<0.05.

Pg-LPS：牙齦卟啉菌內(nèi)毒素. A：空白對照組； B：Pg-LPS刺激組； C：Pg-LPS+1 μg/mL氧化苦參堿； D：Pg-LPS+10 μg/mL氧化苦參堿； E：Pg-LPS+25 μg/mL氧化苦參堿. 與B組比較，☆：P<0.05.圖2 ALP mRNA與GAPDH吸光度比值Fig 2 The absorbance ratio of ALP mRNA and GAPDH

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，在骨組織的形成、改建和修復(fù)的過程中，ALP發(fā)揮了十分重要的調(diào)節(jié)作用。ALP的含量高低代表了組織細(xì)胞的分化以及形成骨組織的能力，ALP活性的高低表明骨組織的代謝和改建能力。體外培養(yǎng)的PDLC采用礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)可形成礦化結(jié)節(jié)，能夠分泌高活性的ALP，表達(dá)成骨的相關(guān)蛋白和細(xì)胞因子，具有成骨細(xì)胞的特性。Pg是牙周病的主要致病菌之一，LPS是其主要致病成分，能夠降低PDLC的生物活性，直接破壞PDLC的超微結(jié)構(gòu)，可對PDLC產(chǎn)生不可逆的損傷[3]。近期研究表明，Pg-LPS會明顯抑制PDLC的分化能力，導(dǎo)致其不能向成骨樣細(xì)胞分化；還可抑制PDLC表達(dá)ALP的活性，這些不良影響將導(dǎo)致牙槽骨的代謝和更新減慢，造成牙周支持組織的破壞，牙周組織的更新和改建過程將無法正常進(jìn)行[4-5]。研究如何通過藥物拮抗Pg-LPS對PDLC的的破壞，保護(hù)PDLC免受Pg-LPS的損傷對牙周病的預(yù)防和治療具有重要作用。

氧化苦參堿一直被認(rèn)為具有抗炎作用，可抑制多種炎癥介質(zhì)的活性，并影響炎癥過程的各個階段。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿及氧化苦參堿等苦豆子生物堿可顯著抑制白三烯的作用，并隨劑量的增大而增強(qiáng)[6]；還可以降低核因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)及絲裂原活化蛋白激酶相關(guān)的炎癥反應(yīng)，抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)等炎癥因子的產(chǎn)生[7]。而NF-κB是調(diào)控促炎因子產(chǎn)生、激發(fā)炎癥反應(yīng)的重要調(diào)控因子。在細(xì)胞水平，對于脂多糖刺激后的RAW264.7細(xì)胞，氧化苦參堿可抑制NF-κB活化，減少炎性黏附分子和細(xì)胞因子的分泌，劑量依賴性地降低炎癥相關(guān)因子IL-11、C反應(yīng)蛋白和TNF-α的表達(dá)[8]。說明氧化苦參堿可對抗炎癥反應(yīng)，對機(jī)體及細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，濃度為25 μg/mL的Pg-LPS作用于PDLC，其ALP的表達(dá)和活性明顯降低，表明該濃度的Pg-LPS對PDLC造成了明顯破壞；分別加入1，10及25 μg/mL的氧化苦參堿后，ALP的表達(dá)和活性均有所提高，并隨氧化苦參堿濃度的升高而升高，表明氧化苦參堿對Pg-LPS抑制PDLC的ALP活性具有拮抗作用，在一定范圍內(nèi)，氧化苦參堿濃度越高，保護(hù)作用越好，且在ALP的mRNA表達(dá)和蛋白翻譯階段具有同等作用。文獻(xiàn)報道，氧化苦參堿具有很強(qiáng)的藥理活性，對血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞等都具有保護(hù)作用[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿的抗炎及抑制炎癥介質(zhì)的特性可能同時在牙周發(fā)揮相同的作用，它能夠?qū)筆g-LPS對PDLC的破壞，促進(jìn)PDLC的ALP活性，促進(jìn)其成骨能力，而且這種作用在1～25 μg/mL呈濃度依賴關(guān)系，可能的途徑是氧化苦參堿對Pg-LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)發(fā)揮相應(yīng)的對抗作用，需進(jìn)一步深入研究證實。本研究對氧化苦參堿在牙周組織中的作用進(jìn)行探討，為牙周病的治療開辟新途徑，提供新的思路。

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(編輯：何佳鳳)

Effects of Oxymatrine on the Activity of Alkaline Phosphatase in Human Periodontal Ligament Cells Stimulated by Porphyromonas Gingivalis Lipopolysaccharide

WANG Yiyong, CHEN Ling, WEI Bin, WU Yun

Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

Objective To study the effect of oxymatrine on the activity of alkaline phosphatase(ALP)and the expression of human periodontal ligament cells (PDLC) stimulated by Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (Pg-LPS). Method The human PDLC were isolated by cell culture technique. The control group was treated with 1% fetal bovine serum. The experimental groups were treated with different concentrations of oxymatrine solution and Pg-LPS. The activity of ALP and its expression in human PDLC were observed by cell culture and enzyme-linked immunosorbent assay and real time PCR. Results The activity and expression of ALP in human PDLC were significantly decreased at 25 μg/mL Pg-LPS. After addition of oxymatrine solution at a certain concentration, the ALP activity and expression had a certain degree of recovery. Conclusion Oxymatrine can reduce the damage of Pg-LPS on human PDLC and raise the ALP activity and its expression.

oxymatrine; endotoxins; gingiva/microbiology; bacteroides; periodontal ligament/cytology; alkaline phosphatase

2017-02-17

福建省自然科學(xué)基金(2017J05124)；中華口腔醫(yī)學(xué)會口腔疾病與全身疾病關(guān)系研究項目(CSA-Y2015-09)

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院口腔科，福州 350005

汪義永，男，主治醫(yī)師

吳 贇. Email: wuyun488@aliyun.com

R322.41； R378.99； R392.11； R996

A

1672-4194(2017)03-0166-04