小豆SSR—PCR反應體系優(yōu)化及引物篩選

趙雅楠 王穎 張東杰 姜多

摘要：為探索適宜小豆SSR-PCR反應的最佳條件以篩選具有多態(tài)性的SSR引物，采用L16（45）正交設計優(yōu)化影響小豆SSR-PCR反應的5個因素（Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq用量、引物濃度、模板DNA用量），利用優(yōu)化后的 SSR-PCR 體系，以10份小豆種質(zhì)為模板，對80對小豆（50對）和綠豆（30對）的SSR引物進行多態(tài)性篩選，得出小豆SSR-PCR的最佳反應體系（20 μL）：Mg2+濃度2.5 mmol/L，dNTPs濃度1.0 mmol/L，Taq活性1.5 U，引物濃度 0.6 μmol/L，模板DNA用量30 ng。利用優(yōu)化后的體系在小豆和綠豆引物中篩選出31對條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復性好的SSR引物，有效擴增率為38.75%。小豆SSR-PCR優(yōu)化體系的建立及多態(tài)性引物的篩選為進一步開展小豆遺傳育種研究奠定了基礎，為小豆遺傳多樣性分析和遺傳圖譜庫構(gòu)建等研究提供了技術參數(shù)和理論依據(jù)。

關鍵詞：小豆；綠豆；SSR-PCR；體系優(yōu)化；引物篩選；有效擴增率；遺傳育種

中圖分類號： S521.03文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0033-05[HS）][HT9.SS]

小豆（Vigna angularis）是豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionaceae）菜豆族（Phaseoleae）豇豆屬（Vigna）的栽培豆種，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、粗纖維、維生素等營養(yǎng)素及三菇皂苷、無機鹽等有效成分，具有清熱除濕、消腫解毒等功效，是一種深受歡迎的醫(yī)食同源作物[1]。然而小豆一直被視為小宗作物，基礎性研究相對比較薄弱，特別是分子標記技術研究相對滯后，在小豆遺傳多樣性分析、遺傳育種及種質(zhì)創(chuàng)新等研究領域面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。

簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）是一類以 1～6 個堿基為基元的串聯(lián)重復DNA序列，廣泛分布于植物基因組中[2]。SSR分子標記因其多態(tài)性豐富、重復性好、操作簡便等特點逐漸成為植物遺傳分析中的重要標記技術之一，廣泛應用于遺傳圖譜構(gòu)建[3]、種質(zhì)資源鑒定[4]、新品種選育[5]等研究中。目前，小豆SSR標記技術主要集中在QTL定位[6]、遺傳多樣性分析[7]等研究領域，而關于小豆SSR-PCR反應體系建立與優(yōu)化及多態(tài)性引物篩選方面鮮有報道。本研究利用L16（45）正交設計探究影響小豆SSR-PCR反應的5個因素（Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq活性、引物濃度、模板DNA用量）的最優(yōu)條件，同時運用優(yōu)化后的體系進行引物篩選，旨在建立高效、穩(wěn)定的小豆SSR-PCR反應體系，為小豆遺傳多樣性分析、遺傳育種及群體遺傳學探究奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1.2SSR引物

試驗所選用的80對SSR引物主要來源于2個部分：從NCBI數(shù)據(jù)庫公布的小豆SSR引物中選擇50對進行合成，另外30對引物從小豆近緣作物綠豆SSR引物中選擇并合成。選用引物X57（F：5′-CACACTTCAAGGAACCTCAAG-3′，R：5′-GTAGGCAACCTCCATTGAAC-3′）為PCR擴增體系優(yōu)化試驗的固定引物。80對引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3主要試劑及儀器

SSR-PCR反應所用的Mg2+、dNTPs、Taq、Buffer、標準分子量（marker）及植物基因組DNA提取試劑盒（plant genomic DNA kit），均購自天根生化科技（北京）有限公司。TBD-3000核酸蛋白檢測儀，購自上海同田生物技術股份有限公司；ABI VeritiTM 96孔梯度PCR儀，購自美國Applied Biosystems公司；DYCP-31BN瓊脂糖電泳槽，購自北京六一生物科技有限公司；Power Pac HC電泳儀，購自美國BIO-RAD公司；Tanon-6200凝膠成像系統(tǒng)，購自上海天能科技有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取及檢測

每份材料取室溫種植10～15 d的植株嫩葉，液氮研磨成粉，試劑盒提取DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，核酸檢測儀檢測模板DNA用量與純度，然后將其稀釋成30 ng/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SSR-PCR正交試驗設計

采用L16（45）正交設計探究Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq活性、引物濃度及模板DNA用量的最佳水平。選擇X57為固定引物，正交試驗因素及水平如表2所示，設計方案如表3所示，除表中變化因素外，每組試驗體系還含有2 μL 10×Buffer，用ddH2O補足20 μL。

1.2.3SSR-PCR擴增及檢測

PCR擴增反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；72 ℃延伸12 min，4 ℃保存。每個處理取6 μL PCR產(chǎn)物，與6×DNA Loading按6 ∶[KG-*3]1體積比混勻后在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，以Low MW DNA marker-A為對照，在成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.4SSR引物篩選

利用B0000725小豆樣品及已優(yōu)化的體系初篩來自小豆（50對）和綠豆（30對）的80對SSR引物，然后以B0000326等10份來自4個省份的小豆樣品DNA為模板，用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳復篩成功擴增的引物，選擇擴增條帶清晰、多態(tài)性豐富的SSR引物用于后期小豆SSR分子標記遺傳多樣性等研究。

2結(jié)果與分析

2.1DNA的提取

利用植物基因組DNA提取試劑盒（plant genomic DNA kit）提取小豆的DNA，D260 nm/D280 nm值在1.68～1.82之間，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示條帶清晰，無明顯拖尾現(xiàn)象（圖1），表明模板DNA提取效果較好，濃度較高，可滿足后續(xù)SSR分析需求。

2.2SSR-PCR正交試驗結(jié)果直觀分析

采用L16（45）正交設計進行擴增，結(jié)果如圖2所示，16個處理均成功擴增，說明該正交設計中各因素的水平基本合理，沒有偏離最適范圍。平行比較16組處理可知，4、5、6、9、11、12號處理擴增效果較差， 條帶較弱；2、3、8、10、13、14號處理

條帶較好，其中條帶最清晰、穩(wěn)定性最好且雜帶較少的是14號，賦值為16，而條帶最模糊，產(chǎn)量最少的是4號，賦值為1。按照這種方法進行2次獨立打分統(tǒng)計，取平均值，并求出各因素同一水平下的得分Ai、平均值ki及極差R，ki表示不同水平下各因素對該體系的影響程度，ki越大，表示水平越好；極差R值越大，表示該因素對PCR體系的影響越大。由表4可知，Mg2+濃度對SSR-PCR反應體系的影響最大，其次是Taq活性，其后依次是引物濃度、模板DNA用量，dNTPs濃度影響最小。

2.3SSR-PCR正交試驗方差分析

為減少試驗誤差，增加結(jié)果的準確性，彌補直觀分析中極差不能客觀估計誤差的不足，本研究對試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果如表5所示，Mg2+濃度、Taq活性、引物濃度對反應體系的影響達到極顯著水平（P<0.01），模板DNA用量對反應體系的影響達到顯著水平（P<0.05），而dNTPs濃度對反應體系的影響未達到顯著水平（P>0.05），這與極差分析結(jié)果一致，充分說明誤差對本試驗的影響較小，本試驗結(jié)果準確、可靠。

2.4不同水平下各因素對小豆SSR-PCR擴增的影響

2.4.1Mg2+濃度對小豆SSR-PCR擴增的影響

作為Taq的輔助因子，Mg2+主要通過影響Taq活性間接影響 SSR-PCR 擴增效果[8]。Mg2+濃度過低會抑制Taq活性， 影響催化效果，擴增條帶較弱；濃度過高則會增強Taq活性，產(chǎn)生非特異性條帶，導致錯配率增加。通過極差和方差分析可知，Mg2+濃度對小豆SSR-PCR擴增的影響最大。由圖3可知，當Mg2+濃度在1.0～2.0 mmol/L范圍內(nèi)時，評分平均值逐漸降低，擴增效果不佳；當Mg2+濃度在2.0～2.5 mmol/L時，評分平均值逐漸增大，并在2.5 mmol/L時達到最高值，因此本試驗選擇最佳Mg2+濃度為2.5 mmol/L。

2.4.2Taq活性對小豆SSR-PCR擴增的影響

Taq在 SSR-PCR反應中起催化作用，是決定PCR擴增效果的正相關因素，其活性受諸多因素的影響。作為對Mg2+敏感的依賴性酶，Taq對擴增效果的影響主要表現(xiàn)在條帶數(shù)量及亮度方面[9]。由圖4可知，Taq活性與評分平均值的關系波動較大，總體呈先下降后上升再下降的趨勢， 在Taq活性為 1.5 U 時

評分達到最高，因此本試驗選擇Taq最佳活性為1.5 U。

2.4.3引物濃度對小豆SSR-PCR擴增的影響

引物是決定SSR-PCR特異性的關鍵因素，與模板DNA互補結(jié)合特異程度直接決定PCR產(chǎn)物的特異性，引物濃度過高會增加引物二聚體的合成概率，引發(fā)錯配或非特異性擴增，背景加深，難以辨別特異性條帶；引物濃度過低則使擴增效率降低，不能與模板DNA完全結(jié)合，使擴增產(chǎn)物數(shù)量減少[10]。由圖5可知，引物濃度在0.4～0.6 μmol/L范圍內(nèi)時，評分平均值逐漸上升，當濃度大于0.6 μmol/L時，評分平均值逐漸降低，因此本試驗選擇0.6 μmol/L為最佳引物濃度。

2.4.4模板DNA用量對小豆SSR-PCR擴增的影響

充足的模板DNA是保證SSR-PCR擴增成功的基礎，模板DNA用量過高會影響Mg2+發(fā)揮作用，產(chǎn)生非特異性擴增，甚至導致擴增失敗；用量過低則會降低擴增效率和產(chǎn)量，出現(xiàn)條帶太弱的情況。由圖6可知，當模板DNA用量在20～30 ng范圍

內(nèi)時，評分平均值逐漸增大，當其濃度大于30 ng時，評分平均值呈下降趨勢，因此選擇30 ng為模板DNA的最佳用量。

2.4.5dNTPs濃度對小豆SSR-PCR擴增的影響

dNTPs是SSR-PCR反應的直接原料之一，dNTPs濃度過高雖然可以提高反應速率，但會與Taq形成競爭關系，抑制其與Mg2+結(jié)合，非特異性條帶增多[11]；dNTPs濃度較低則會使擴增條帶減少。由圖7可知，dNTPs濃度在0.5～2.0 mmol/L范圍內(nèi)時，評分平均值呈先上升后下降的趨勢，當dNTPs濃度為 1.0 mmol/L [CM（20*2/3]時評分平均值達到最高水平，因此本試驗選擇[CM）]

1.0 mmol/L 為dNTPs最佳濃度。

2.5引物篩選

利用分別來自內(nèi)蒙古自治區(qū)、黑龍江省、吉林省及遼寧省的10份不同小豆種質(zhì)DNA及優(yōu)化得到的反應體系對80對SSR引物進行多態(tài)性篩選，選擇目標區(qū)域內(nèi)條帶清晰、多態(tài)性豐富、重復性好的核心引物用于后期小豆SSR研究。如圖8所示，從50對小豆引物中篩選得到22對多態(tài)性引物，從30對綠豆引物中篩選得到9對多態(tài)性引物，共計31對，多態(tài)性比率為38.75%。

3討論與結(jié)論

SSR分子標記因其多態(tài)性豐富、可重復性強、操作簡便等優(yōu)點已成為遺傳研究中比較成熟的標記技術之一，在作物基因標記、輔助育種、親緣關系鑒定等研究中應用廣泛[12]。而PCR反應是SSR標記中的重要環(huán)節(jié)，其中多個因素及各因素間的相互作用均會對SSR標記產(chǎn)生影響，PCR擴增敏感性、特異性、產(chǎn)量等都可能因Mg2+濃度、dNTPs濃度、模板DNA用量、Taq活性、引物濃度的不同而產(chǎn)生變化。因此，優(yōu)化SSR-PCR體系，使反應中的各個因子達到最佳水平，并利用優(yōu)化后的組合進行多態(tài)性引物篩選是基于SSR分子標記技術進行作物遺傳育種研究的基礎。

通常優(yōu)化SSR-PCR體系都是采用單因素試驗設計或正交試驗設計。單因素分析處理較多，且不能兼顧各因素之間的相互作用，即在單因素試驗中得到的各個因素的最佳水平組合擴增效果不一定最好。而正交試驗設計是在全面試驗中選擇部分有代表性的處理組合，具有均衡分散性和整齊可比性的特點，能夠充分考慮各因素水平之間的交互作用，簡單、便捷、高效，利用較少次數(shù)試驗得到較佳的試驗結(jié)果，可有效解決SSR-PCR優(yōu)化所需試驗量與實際可行試驗次數(shù)之間的矛盾，利用有限的試驗量全面掌握事物的內(nèi)在規(guī)律是一種較理想的SSR-PCR優(yōu)化途徑[13]。本研究采用正交試驗設計對影響小豆SSR-PCR反應的5個因素進行4個水平的優(yōu)化，最終得到SSR-PCR的最佳反應條件：總體系20 μL，Mg2+濃度為2.5 mmol/L，dNTPs濃度為1.0 mmol/L，Taq活性為1.5 U，引物濃度為0.6 μmol/L，模板DNA用量為30 ng，這與大豆[14]、蕓豆[15]、水稻[16]、玉米[17]等作物已報道的 SSR-PCR 體系有所不同，說明SSR-PCR體系因物種不同而存在差異，在選用PCR試驗方法時要根據(jù)實際情況進行調(diào)整，以形成適合物種研究的技術平臺。此外，試驗結(jié)果評價受一定主觀因素的影響，建立一套客觀、明確的評分標準有助于小豆SSR-PCR體系的準確建立和該優(yōu)化方法的廣泛應用，因此在接下來的試驗中應對其進一步完善。

SSR-PCR反應體系中，Taq活性會對條帶清晰度及數(shù)量產(chǎn)生影響，而Mg2+作為Taq的激活劑可調(diào)控其活性，進而影響擴增的特異性和忠實性。模板DNA用量過低會被雜帶影響，用量過高則會產(chǎn)生拮抗作用，導致擴增失敗。引物濃度會對反應的特異性及定位效果產(chǎn)生影響。dNTPs則通過控制反應速率來影響SSR-PCR反應體系。由試驗結(jié)果可知，Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq活性、引物濃度、模板DNA用量對 SSR-PCR 體系有不同程度的影響，其中Mg2+濃度、Taq活性及引物濃度對反應體系的影響達到極顯著水平（P<0.01），DNA模板用量對反應體系的影響達到顯著水平（P<0.05），而dNTPs濃度對反應體系的影響未達到顯著水平（P>005）。前人關于上述5個因素對SSR-PCR反應體系影響程度的排列順序并不完全一致，表明各因素對反應體系的影響作用因物種的差異而不甚相同。王耀文等認為，引物濃度對苦蕎SSR-PCR反應體系的影響最大[18]；而何仁鋒等則認為，在藥用菊花SSR-PCR反應體系中Taq活性是關鍵影響因素[19]；王志勇等對狗牙根SSR-PCR體系優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，Mg2+濃度對反應體系影響最大[20]；麥靜等研究也發(fā)現(xiàn)，Mg2+濃度和引物濃度對厚樸SSR-PCR體系影響達極顯著水平[21]，本研究結(jié)果與之相似。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，dNTPs濃度對小豆SSR-PCR反應體系的影響不大，當dNTPs濃度為0.5～2.0 mmol/L時對反應影響不顯著，這可能是因為PCR反應對dNTPs濃度的要求不高，滿足反應需求即可。

SSR引物一般分為根據(jù)物種序列自主開發(fā)和通用近緣作物引物2種途徑。引物開發(fā)必須以基因組序列已知為前提，且操作繁瑣、工作量較大、費用高，而近緣作物轉(zhuǎn)移法為引物開發(fā)提供了新的思路。近緣作物間具有不同程度的基因同源性，因此SSR引物往往在不同作物間具有一定的通用性，將一種引物開發(fā)較成熟作物的SSR引物通用于其近緣作物來獲得SSR位點的方法不僅可以減少工作量、降低費用，還可以為不同作物間遺傳關系的研究提供理論依據(jù)[22]。本研究將30對綠豆SSR引物通用于小豆進行擴增，篩選得到9對適宜小豆SSR分析的引物，證明綠豆SSR引物適用于小豆，利用近緣物種間SSR引物具有通用性的特點進行遺傳研究的思路是可取的，這既為小豆SSR多態(tài)性引物的篩選提供便利，同時也為小豆的遺傳學研究奠定了基礎。但本研究中獲得的小豆SSR引物數(shù)量較少且多態(tài)性水平較低，不能滿足后期小豆SSR標記研究的需要，因此在接下來的研究中要繼續(xù)加強對小豆SSR引物篩選的工作，為小豆遺傳育種、種質(zhì)資源研究等夯實基礎。

參考文獻：

[1]于章龍，段欣，武曉娟，等. 紅小豆功能特性及產(chǎn)品開發(fā)研究現(xiàn)狀[J]. 食品工業(yè)科技，2011（1）：360-363.

[2]Ravi M，Geethanjali S，Sameeyafarheen F，et al. Molecular marker based genetic diversity analysis in rice（Oryza sativa L.） using RAPD and SSR markers[J]. Euphytica，2003，133（2）：243-252.

[3]Moncada M D，Tovar E，Montoya J C，et al. A genetic linkage map of coffee（Coffea arabica L.） and QTL for yield，plant height，and bean size[J]. Tree Genetics & Genomes，2015，12（1）：1-17.

[4]Utami D W. Development of SSR marker set to identify fourty two indonesian soybean varieties[J]. ET Journal，2015，11（2）：49-58.

[5]Taeprayoon P，Tanya P，Sukha L，et al. Genetic background of three commercial oil palm breeding populations in Thailand revealed by SSR markers[J]. Australian Journal of Crop Science，2015，9（4）：281-288.

[6]Venkataramana P B，Gowda R，Somta P，et al. Mapping QTL for bruchid resistance in rice bean（Vigna umbellata）[J]. Euphytica，2016，207（1）：135-147.

[7]Chen H L，Liu L P，Wang L X，et al. Development of SSR markers and assessment of genetic diversity of adzuki bean in the Chinese germplasm collection[J]. Molecular Breeding，2015，35（10）：1-14.

[8]Ashkani S，Rafii M Y，Shabanimofrad M，et al. Multiplex SSR-PCR approaches for semi-automated genotyping and characterization of loci linked to blast disease resistance genes in rice[J]. Comptes Rendus Biologies，2015，338（11）：709-722.

[9]Chen S Q，Zheng X J，Cao H R，et al. A simple and efficient method for extraction of Taq DNA polymerase[J]. Electronic Journal of Biotechnology，2015，18（5）：355-358.[ZK）]

[10]Arismendi N，Bruna A，Zapata N，et al. PCR-specific detection of recently described Lotmaria passim（Trypanosomatidae） in Chilean apiaries[J]. Journal of Invertebrate Pathology，2016，134：1.

[11]Jaramillo M C，Martínezduarte R，Hüttener M，et al. Increasing PCR sensitivity by removal of polymerase inhibitors in environmental samples by using dielectrophoresis[J]. Biosensors & Bioelectronics，2013，43（10）：297-303.

[12]Shitta N S，Abberton M T，Adesoye A I，et al. Analysis of genetic diversity of African yam bean using SSR markers derived from cowpea[J]. Plant Genetic Resources-Characterization and Utilization，2016，14（1）：50-56.

[13]Yang T T，Li-Qiang M U. Optimizing SSR-PCR system of Panax ginseng by orthogonal design[J]. Journal of Forestry Research，2007，18（1）：31-34.

[14]蘇輝，李志剛，宋書宏. 正交設計優(yōu)化大豆SSR-PCR反應體系及引物篩選[J]. 華北農(nóng)學報，2009，24（2）：99-102.

[15]陳明麗，王蘭芬，薛仁風，等. 基于普通菜豆基因組測序開發(fā)SSR標記[C]// 中國作物學會50周年慶祝會暨2011年學術年會論文集. 北京：中國作物學會，2011.[HJ1.6mm]

[16]Tanweer F A，Rafii M Y，Sijam K，et al. Identification of suitable segregating SSR markers for blast resistance in rice using inheritance and disease reaction analysis in backcross families[J]. Australasian Plant Pathology，2015，44（6）：619-627.

[17]Ho J C，Kresovich S，Lamkey K R. Extent and distribution of genetic variation in US maize[J]. Crop Science，2005，45（5）：720-725.

[18]王耀文，夏楠，韓瑞霞，等. 苦蕎SSR-PCR反應體系的優(yōu)化及引物篩選[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，2011，39（4）：4-8.

[19]何仁鋒，馮尚國，陳喆，等. 藥用菊花SSR-PCR反應體系優(yōu)化及引物篩選[J]. 分子植物育種，2015（2）：367-378.

[20]王志勇，郭海林，劉建秀. 正交設計優(yōu)化狗牙根SSR-PCR反應體系[J]. 分子植物育種，2007，5（增刊1）：201-206.

[21]麥靜，楊志玲，楊旭，等. 瀕危植物厚樸SSR引物篩選及反應體系優(yōu)化[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學報，2015，31（4）：600-607.

[22]倪先林，趙甘霖，劉天朋，等. SSR分子標記在糯高粱種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中的應用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2015，31（1）：16-22.[ZK）][HT][HJ][FL）]