2種野外采集白腐真菌分離及其產漆酶液體培養基優化

李環明 楊洪升 薛春梅

摘要[目的]優化2種野外采集白腐真菌菌絲產漆酶液體培養基。[方法]對2種采集的白腐真菌輪紋韌革菌（Stereum ostrea）和朱紅密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）通過分離純化得到白腐真菌菌絲，應用ABTS法測定其產漆酶活性，研究碳源、氮源、金屬陽離子、pH、溫度、轉速對白腐真菌產漆酶的影響。[結果]輪紋韌革菌最佳培養基是葡萄糖20.00 g、硝酸鉀5.00 g、NaH2PO4 5.00 g、CuSO4 1.00 g、初始pH 6、溫度25 ℃、轉速170 r/min，在第11天其產漆酶活性達到最大，為1.557 U/mL，是PDA液體培養基產漆酶活性的2.7倍。朱紅密孔菌最佳培養基是麥芽糖25.00 g、酵母膏5.00 g、NaH2PO4 1.00 g、KCl 2.00 g、初始pH 7、溫度30 ℃、轉速200 r/min，在第9天其產漆酶活性達到最大，為1.478 U/mL，是PDA液體培養基產漆酶活性的2.3倍。[結論]篩選出2種野外白腐真菌產漆酶最佳培養基，為漆酶的進一步研究提供了參考。

關鍵詞 白腐真菌；漆酶；培養基；篩選

中圖分類號 S182 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）03-0001-03

Abstract[Objective] The aim was to optimize the liquid culture medium of two species of field acquisition white rot fungi.[Method] By isolating and purifying two species of white rot fungi，Stereum ostrea and Pycnoporus cinnabarinus，white rot fungus hyphae were collected，and the liquid culture medium of laccase was screened.ABTS method was applied to measure the activity of laccase.Effects of carbon sources，nitrogen sources，metal cations，pH，temperature and rotational speed on laccase produced by white rot fungi were studied.[Result] The optimum medium of Stereum ostrea was glucose 20.00 g，potassium nitrate 5.00 g，NaH2PO4 5.00 g，CuSO4 1.00 g，the initial pH 6，temperature 25 ℃， rotational speed 170 r/min，and the laccase activity reached the maximum on the 11th day the maximum value reached 1.557 U/mL which was 2.7 times of the laccase activity of PDA liquid culture.The optimum medium of Pycnoporus cinnabarinus was maltose 25.00 g，yeast extract 5.00 g，NaH2PO4 1.00 g，KCl 2.00 g，the initial pH 7，temperature 30 ℃，rotational speed 200 r/min，and the laccase activity reached the maximum in the 9 d，the maximum value 1.478 U/mL which was 2.3 times of the laccase activity of PDA liquid culture.[Conclusion] The opitimal liquid culture medium of two species of field acquisition white rot fungi is obtained so as to provide reference for further study of laccase.

Key words White rot fungus；Laccase；Culture medium；Screen

白腐真菌是一類使木材呈白色腐朽的真菌，可在特定條件下產各種酶系[1]，包括漆酶、木質素過氧化氫酶和錳過氧化氫酶等[2-3]。在白腐真菌產的酶系中，漆酶的應用非常廣泛。在染料脫色方面，馬利[4]、傅愷[5]、張麗[6]、王天女等[7]對重組血紅密孔菌產漆酶對活性藍等染料進行脫色結果分析，其脫色率達93%。在環境污染的處理方面，彭丹對黃孢原毛平革菌在固態發酵體系產真菌漆酶對五氯酚（PCP）降解進行研究，結果表明在沒有氧化還原介體時粗漆酶液能降解PCP，反應6 h降解率為37.8%，粗酶液中加入5 mmol/L氧化還原介體（ABTS）能獲得更高的降解率，達97.0%；將粗漆酶液用（NH4）2SO4鹽析純化，用提純后漆酶降解PCP，6 h后降解率為81.8%[8-9]。在農藥處理方面，程科[1]對白腐菌漆酶純化分離并對阿特拉津進行降解研究，結果表明，在最優降解條件下，阿特拉津降解率響應預測值為52.41%，驗證值為52.32%，最適條件下的降解率提高了10%～15%。此外，漆酶能選擇性地催化木質素降解，這一特性可用于紙漿生產。漆酶還可用來測定食品中抗壞血酸的總含量，該方法已應用于白酒、啤酒、奶粉等食品檢測[10]。筆者研究了2種野外采集的白腐真菌液體粗酶液中漆酶的活性，對產漆酶的液體培養基進行優化，以期得到最佳的培養基配方。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑。

恒溫水浴鍋、YXQ-LS-立式壓力蒸汽滅菌鍋、KA-1000低速離心機、BS-2F振蕩培養箱、ZHWY-2102全溫搖床振蕩器、SPX-250B-G型恒溫光照培養箱。呋喃西林、ABTS、KNO3、MgSO4、NaH2PO4、H2O2、CuSO4、CaCl2、KCl、ZnSO4、醋酸-醋酸鈉緩沖液。

1.1.2 供試菌種。菌種采于佳木斯市四豐鄉小樺山，根據真菌鑒定圖譜鑒定為輪紋韌革菌、朱紅秘孔菌。

1.1.3 培養基。

PDA選擇培養基：土豆100.00 g，葡萄糖5.00 g，呋喃西林0.25 g，瓊脂10.00 g，定容至500 mL。斜面培養基：稱去皮馬鈴薯200.00 g，切成小塊，加適量（完全浸沒馬鈴薯）蒸餾水，煮20～30 min，用9層紗布過濾出馬鈴薯浸出液，加入葡萄糖20.00 g、NaH2PO4 3.00 g、MgSO4·7H2O 1.50 g、瓊脂20.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL[11]。液體標準培養基：馬鈴薯200.00 g，煮20～30 min，用9層紗布過濾，加入葡萄糖20.00 g、NaH2PO4 3.00 g、MgSO4·7H2O 1.50 g、蛋白胨5.00 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離及擴大培養。先用75%乙醇擦拭1次，用剪刀剪開菌體，在中間剪一小塊菌體接種到PDA選擇培養基上，當菌絲萌發至長2 cm時，切取菌絲尖端1 mm左右，接入新配制PDA母種培養基上，重復3～5次，以不長雜菌為分離成功[1]。

1.2.2 液體菌種的制備。在每瓶PDA液體培養基中接種3塊10 mm的菌片，25 ℃、110 r/min培養13 d。

1.2.3 培養基的篩選。

1.2.3.1 碳源篩選。以不加馬鈴薯的液體標準培養基為基準，設置葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖5個不同碳源處理，另設不加碳源為對照，篩選最佳碳源。

1.2.3.2 氮源篩選。設置硝酸鉀、硫酸銨、 酵母膏、牛肉膏、蛋白胨5個氮源處理，以不加氮源為對照，篩選最佳氮源。

1.2.3.3 金屬陽離子篩選[6]。設置Zn2+、Ca2+、Mg2+、K+、Cu2+5個因素，以不加金屬陽離子為對照。

1.2.3.4 營養因素正交試驗。試驗因素與水平見表1。

1.2.3.5 溫度的篩選。以營養因素正交試驗篩選出來的最佳組合為基礎培養基，分別設置15、20、25、30、35、40 ℃共6個不同溫度處理。

1.2.3.6 初始pH的篩選。用5% NaOH和0.2 mol/mL HCl將發酵培養基的初始pH分別設置為4、5、6、7、8、9。

1.2.3.7 搖床轉速篩選。設置110、140、170、200、230 r/min，以不設轉速為對照。

1.2.3.8 培養時間的篩選。根據對2種白腐真菌培養基營養因素及條件的篩選，最后得出最佳培養基配方，并且進行培養，測定1、3、5、7、9、11、13、15 d等不同時間段產漆酶活性。

1.2.4 漆酶活性測定。

1.2.4.1 胞外酶的提取。對液體培養基進行紗布過濾，冰箱冷藏24 h后4 000 r/min離心15 min，上清液即為胞外提取液[12-13]。

1.2.4.2 漆酶活性測定。采用ABTS法。

空白樣（4.0 mL）：2.0 mL 0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）+0.4 mL 0.3 mol/L ABTS +1.2 mL去離子水+0.4 mL失活酶液。樣品（4.0 mL）：2.0 mL 0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）+0.4 mL 0.3 mol/L ABTS+1.2 mL去離子水+0.4 mL酶液。在40 ℃下應用可見分光光度計檢測420 nm波長處吸收值變化，30 s間隔讀數，記錄240 s內吸收值變化，定義1 min內氧化1 μmol ABTS所需要的酶量為1個漆酶活力單位（U），已知420 nm波長處ABTS摩爾消光系數ε420=3.6×104 L/（mol·cm）。

2 結果與分析

2.1 營養因素對白腐真菌產漆酶的影響

5種碳源中，輪紋韌革菌產漆酶液體培養基中最佳碳源是葡萄糖，其產漆酶最大值為0.578 U/mL；朱紅密孔菌產漆酶液體培養基中最佳碳源是麥芽糖，其產漆酶最大值為0.642 U/mL（圖1）。

5種氮源中，輪紋韌革菌產漆酶液體培養基中最佳氮源是硝酸鉀，其產漆酶最大值為1.069 U/mL；朱紅密孔菌產漆酶液體培養基中最佳氮源是酵母膏，其產漆酶最大值為0.752 U/mL（圖2）。

2.2 金屬陽離子對白腐真菌產漆酶的影響

由圖3可知，金屬陽離子Mg2+、Cu2+對輪紋韌革菌產漆酶都有促進作用，Cu2+對輪紋韌革菌促進最大，在添加了Cu2+的液體培養基中，其產漆酶最大值為1.349 U/mL。而Ca2+對其有抑制作用，添加了Ca2+的液體培養基產漆酶值為0.389 U/mL，Zn2+、K+影響不大，和不加金屬離子產漆酶相差不大。

金屬陽離子K+、Mg2+、Cu2+對朱紅密孔菌產漆酶都有促進作用，K+對朱紅密孔菌促進作用最大，在添加了K+的液體培養基中，其產漆酶最大值為0.931 U/mL。而Ca2+對其有抑制作用，添加了Ca2+的液體培養基產漆酶值為0.056 U/mL，Zn2+對朱紅密孔菌產漆酶影響不大。

2.3 不同營養因素正交試驗結果

綜合評價，輪紋韌革菌液體營養因素培養基最優組合為A2B2C3D1，此時獲得的菌絲產漆酶為1.386 U/mL。即優化后的最適培養基為：葡萄糖20.00 g，硝酸鉀5.00 g，NaH2PO4 5.00 g，CuSO4 1.00 g。由極差R值可知，影響菌絲體產漆酶的因素大小順序為葡萄糖、硝酸鉀、CuSO4和NaH2PO4，葡萄糖和硝酸鉀對試驗結果有極顯著影響（表2）。

朱紅密孔菌液體營養因素培養基最優組合為A3B2C1D3，此時獲得的菌絲產漆酶為0.940 U/mL。即優化后的最適培養基為：麥芽糖25.00 g，酵母膏5.00 g，NaH2PO4 1.00 g，KCl 2.00 g。由極差R值可知，影響菌絲體產漆酶的因素大小順序為麥芽糖、酵母膏、NaH2PO4和KCl，麥芽糖和酵母膏對試驗結果有極顯著影響（表3）。

2.4 培養條件對白腐真菌產漆酶的影響

2.4.1 pH對白腐真菌產漆酶的影響。

由圖4可知，輪紋韌革菌在pH 6的液體培養基中產漆酶量最大，為1.395 U/mL，且偏堿的培養基不適合菌絲體產漆酶。朱紅密孔菌產漆酶最適pH為7，產漆酶最大值為0.940 U/mL，偏堿的培養基對其有抑制作用。

2.4.2 溫度對白腐真菌產漆酶的影響。

由圖5可知，輪紋韌革菌最適溫度為25 ℃，產漆酶最大值為1.386 U/mL，朱紅密孔菌最適溫度為30 ℃，產漆酶最大值為0.972 U/mL。溫度過高和過低，2種白腐真菌漆酶活性都降低。

2.4.3 轉速對白腐真菌產漆酶的影響。

由圖6可知，輪紋韌革菌最佳轉速為170 r/min，產漆酶最大值為1.482 U/mL，朱紅密孔菌最佳轉速為200 r/min，產漆酶最大值為1.117 U/mL，在靜置狀態下2種白腐真菌產漆酶活性都非常低。

2.5 培養時間對產漆酶的影響 結果表明，輪紋韌革菌在最佳培養基培養下，開始1～5 d漆酶活性較低，在第7天有下降，7～11 d快速增長并且達到最大，在第11天其產漆酶活性為1.557 U/mL，13～15 d漆酶活性稍有下降，并且達到平穩。朱紅密孔菌在最佳培養基培養下，開始1～3 d漆酶活性較低，3～7 d平穩增長，并且在7～9 d快速增長，達到最大，在第9天其產漆酶活性為1.478 U/mL，在11 d有下降，11～13 d產漆酶活性變化不大，到15 d又有下降。

3 結論

輪紋韌革菌最佳培養基是葡萄糖20.00 g、硝酸鉀5.00 g、NaH2PO4 5.00 g、CuSO4 1.00 g、初始pH 6、溫度25 ℃、轉速170

r/min，在第11天其產漆酶活性達到最大，為1.557 U/mL，是PDA液體培養基產漆酶活性的2.7倍。朱紅密孔菌最佳培養基是麥芽糖25.00 g、酵母膏5.00 g、NaH2PO4 1.00 g、KCl 2.00 g、初始pH 7、溫度30 ℃、轉速200 r/min，在第9天其產漆酶活性達到最大，為1.478 U/mL，是PDA液體培養基產漆酶活性的2.3倍。通過對2種白腐真菌產漆酶培養基的篩選，得出最佳培養基配方，為后期的漆酶研究提供了理論依據。

參考文獻

[1]

程科.白腐菌漆酶分離純化、酶學性質及其對阿特拉津最適降解條件的研究[D].長春：吉林農業大學，2012.

[2] 劉蘋，唐志紅，李夢玉，等.金針菇漆酶活性測定的最佳反應條件及液體培養胞外酶的研究[J].食品科技，2012（6）：14-17.

[3] 徐騰飛，盧磊，趙敏，等.一株產漆酶細菌的分離鑒定及酶學性質研究[J].微生物學通報，2013，40（3）：434-442.

[4] 馬利.白腐真菌及其漆酶對不同結構染料的降解研究[D].武漢：華中科技大學，2013.

[5] 傅愷.真菌漆酶高產菌株的發酵產酶及酶促降解有機染料的動力學研究[D].廣州：華南理工大學，2013.

[6] 張麗.銅離子誘導白腐菌高產漆酶及其用于降解染料的研究[D].廣州：華南理工大學，2013.

[7] 王天女，李國富，趙敏，等.重組血紅密孔菌漆酶在染料脫色中的應用[J].南京林業大學學報（自然科學版），2016，40（1）：92-96.

[8] 彭丹.黃孢原毛平革菌和黃孢原毛平革菌漆酶對五氯酚降解的研究[D].長沙：湖南大學，2008.

[9] 張博.東北白腐真菌高效產酶及降解多環芳烴特征研究[D].哈爾濱：東北林業大學，2014.

[10] 王鼎，曾東方，池汝安，等.3，3′-二甲基聯苯胺法測定香菇漆酶活性研究[J].江蘇林業科技，2008，35（5）：12-16.

[11] 范寰，廖偉，劉文思，等.白腐真菌液體發酵培養基的優化研究[J].飼料研究，2010（10）：31-33.

[12] 蔣冬冬，李莉，趙新海，等.產漆酶真菌的篩選及其固態發酵條件研究[J].微生物學雜志，2010，30（6）：55-59.

[13] 劉禹，蘭進，徐新然，等.靈芝屬不同菌種漆酶活性的比較[J].中藥材，2016（8）：1692-1695.