工程化蛋白質納米孔實時監測鎘離子與谷胱甘肽的單分子反應

卓莎+王瑩+亢曉峰

摘 要 本研究利用合成的全-6-季銨基-β-環糊精（Per-6-quaternary ammonium-β-cyclodextrin，p-QABCD）裝備基因工程化的α-溶血素（α-Hemolysin，αHL）蛋白質納米孔（M113R）7，構建全新的單分子納米孔反應器，在單分子水平實現對谷胱甘肽（GSH）和鎘離子（Cd2+）的絡合反應的實時原位監測，并辨認絡合反應的不同路徑、反應中間產物和最終產物。結果表明，溶液的pH值顯著影響GSH與Cd2+絡合產物的絡合比例。pH=7.4時，GSH與Cd2+絡合反應的最終產物為Cd（GSH）2； pH=9.0時，最終產物為Cd（GSH）2和Cd2（GSH）2。其中，Cd2（GSH）2的形成遵循兩種路徑：（1）一個Cd2+首先結合兩個GSH分子的巰基形成Cd（GSH）2，然后，第二個Cd2+結合去質子化的氨基形成Cd2（GSH）2； （2）兩個Cd2+分別結合同一個GSH分子的巰基和去質子化的氨基形成Cd2（GSH）1，然后，第二個GSH分子的巰基和去質子化的氨基結合Cd2（GSH）1的Cd2+形成Cd2（GSH）2。本研究實現了在單分子水平無標記和無化學修飾研究金屬離子和生物小分子的反應，對理解細胞內重金屬的解毒機理和拓展納米孔單分子技術的研究領域具有重要意義。

關鍵詞 納米通道； 單分子檢測； 全-6-季銨基-β-環糊精； 谷胱甘肽； 鎘離子

1 引 言

鎘是人體的非必需元素，入侵人體會結合含巰基和氨基的蛋白質破壞肝和腎臟等器官中酶系統正常的生理功能，干擾細胞內的鈣代謝引起成骨過程和正常骨代謝的紊亂，降低抗氧化酶的活性造成機體氧化損傷等[1，2]。谷胱甘肽（Glutathione， γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine， GSH）是細胞內普遍存在的含巰基三肽，具有獨特的還原性和親和性，易與入侵人體的Cd2+、Zn2+、Pb2+和Ni2+等重金屬離子結合形成復合物并排出體外，是生物體內重要的重金屬解毒物質[3～7]。因此，研究Cd2+與GSH的相互作用對探索生物體內重金屬離子的生理功能和解毒機理具有重要意義。

GSH與金屬離子絡合反應的研究已有報道，主要集中于絡合反應的作用位點和絡合產物的結構及性質。常用的研究方法包括核磁共振法（NMR）[8，9]、 吸收光譜法[10]、電位滴定法[11]、熒光法[12]、循環伏安法（CV）[13，14]、紅外光譜法[15，16]、示差脈沖極譜法（DPP）結合多變量曲線分析技術[17]等。GSH含有兩個羧基（pKa1=2.12， pKa2=3.59 ）、一個氨基（pKa3=875）和一個巰基（pKa4=9.65），不同pH值下與金屬離子的結合位點不同[18]，因此，絡合反應過程的研究相對困難。發展一種直接、靈敏、實時監測絡合反應過程的方法，尤其是在納米空間內監測單分子水平的絡合反應的方法，將為GSH與金屬離子相互作用的研究提供新的平臺。

以蛋白質納米孔，如α-溶血素納米孔，作為基礎元件的納米孔單分子檢測技術在單分子分析、單分子化學反應研究和DNA測序等方面具有重要的研究和應用價值，研究對象包括金屬離子、有機小分子和DNA等多種物質[19～23]。此技術是基于單個分子與納米孔相互作用時納米孔內離子電流的改變而建立的單分子分析技術[24～26]，已成功實現在單分子水平對化學反應的中間態以及反應路徑的研究，包括二硫鍵的形成和斷裂[24]，半胱氨酸與有機砷化合物共價鍵的形成和斷裂[25]，砷與硫醇取代反應中七種產物的相互轉化等[26]。但常需要在納米孔中修飾反應物，容易受到分子構象的影響。本研究將合成的帶正電的全-6-季銨基-β-環糊精分子適配器嵌入（M113R）7 αHL蛋白質納米孔中，作為納米反應器和傳感器研究Cd2+與GSH的絡合比例和反應中間產物，并成功區分不同絡合比例的絡合產物，揭示了Cd2+與GSH的反應路徑。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Axopatch 200B膜片鉗放大器和1440A A/D 數字轉換器（美國Axon Instruments公司）； 4040A函數發生器（美國BK Precision公司）； UltiMate3000液相色譜-質譜聯用電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜儀（美國Dionex公司）。

植烷酸卵磷脂（DPhPC，美國Avanti Polar Lipids公司）； 戊烷（99.7%，美國Honeywell Burdick & Jackson公司）； 聚四氟乙烯膜（Teflon膜， 英國Goodfollow公司）； 正十六烷（99%）、谷胱甘肽（≥98%）、碘甲烷（99%）、KCl（≥99.0%）、CdCl2（≥98%）、 KOH（≥85%）、甲酸（≥95%）、甲醛（≥36.0%）、二甲基甲酰胺（≥99%）、四氫呋喃（≥99.9%）和全-6-氨基-β-環糊精（Per-6-amino-β-cyclodextrin，98%），均購自美國Sigma-Aldrich公司。

2.2 全-6-季銨基-β-環糊精（Per-6-quaternary ammonium-β-cyclodextrin，p-QABCD）的合成[27]

取0.2360 g全-6-氨基-β-環糊精（Per-6-amino-β-cyclodextrin）與15.0 mL甲酸、8.0 mL甲醛和15.0 mL H2O混合，70℃下攪拌反應18 h。反應結束后，混合物真空干燥得到全-6-叔胺基-β-環糊精。將制備的全-6-叔胺基-β-環糊精和0.0150 g KOH懸浮在二甲基甲酰胺溶液中，添加300 μL碘甲烷，4℃，N2保護下反應4 h。將反應后的混合物減壓濃縮到10.0 mL，添加60.0 mL四氫呋喃沉淀產物。四氫呋喃多次洗滌沉淀并真空干燥獲得白色的p-QABCD固體。ESI-MS表征：[M]7+ m/z 208.4。

2.3 （M113R）7 αHL蛋白質納米孔制備[28]

M113R αHL單體采用大腸桿菌BL21（DE3）pLysS原核表達制備，超濾離心純化，并進一步在兔血紅細胞膜上組裝成（M113R）7 αHL七聚體。

2.4 實驗方法[29]

中間有微米級小孔（直徑120～150 μm）的Telfon膜將電解池分為兩個腔室，用戊烷-正十六烷混合液（99∶1， V/V）預處理小孔使孔周圍為疏水界面，電解池兩端分別加入1 mL緩沖液（1 mol/L KCl， 10 mmol/L Tris-HCl， pH 7.4或pH 9.0）和一滴DPhPC，插入兩根Ag/AgCl電極，靜置5 min，加入0.5 mL緩沖液，使液面沒過小孔，并在孔上形成磷脂雙分子層。電解池一端加入終濃度為0.05～0.3 ng/mL的（M113R）7 αHL蛋白質（cis端，接地），另一端施加電壓（trans端），待蛋白質擴散至小孔附近并插入脂雙層形成單通道后，體系形成導通回路。膜片鉗放大器采集電流信號，采樣頻率為100 kHz，濾波頻率3 kHz。pClamp 10.3和Origin 8.5軟件統計分析數據，平均滯留時間（τoff）、捕獲頻率（1/τon）經相應的事件數柱狀圖單指數擬合得到，平均阻塞電流值（I）經電流與事件數柱狀圖高斯擬合得到。

3 結果與討論

3.1 分子適配器p-QABCD裝備的（M113R）7 αHL納米孔分別檢測Cd2+和GSH （M113R）7αHL納米孔是常用的突變型αHL納米孔[30]，由7個113位的甲硫氨酸被精氨酸取代后的αHL單體聚合而成，腔內最窄處為7個精氨酸構成的正電荷環狀結構，易于捕獲帶負電的分子或減小帶負電分子的穿孔速度。Cd2+與GSH的絡合物進入（M113R）7 αHL納米孔，無電流響應信號。為了檢測Cd2+-GSH絡合物，將p-QABCD作為分子適配器嵌入（M113R）7 αHL納米孔形成新型納米反應器和傳感器，即p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔（圖 1A）。納米孔的最窄處形成第二個正電荷的環狀結構，通道內徑明顯縮小，靜電作用位點增多，易于捕獲Cd2+-GSH絡合物。

檢測電壓為+160 mV時，（M113R）7αHL通道開放電流I0=（155.32 ± 5.11）pA（Level 0； 圖1B）。 p-QABCD在電壓驅動下從trans端嵌入納米孔時，通道電流變為I1=（61.35 ± 4.12）pA（Level 1； 圖1C）。將Cd2+加入trans端或將帶負電的GSH加入cis端，無電流響應信號產生（圖1D和1E）。結果表明， Cd2+或GSH單獨進入p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔時不能引起電流的明顯變化，推測原因是Cd2+和GSH的體積太小或穿過納米孔的速度太快，現有的儀器分辨率不能捕獲到明顯的電流信號。

3.2 p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔監測Cd2+與GSH的反應進程

pH=9.0時，cis端加入GSH分子，trans端加入Cd2+，在正電壓的驅動下， GSH和Cd2+進入納米孔并在納米孔或p-QABCD內部相遇（圖 2A）發生絡合反應，產生5種類型的電流信號，如圖2B和2C中Ⅰ～Ⅴ所示，包含兩種無過渡態的信號（Ⅰ和Ⅱ）和3種有過渡態的信號（Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ）。推測無過渡態信號（Ⅰ和Ⅱ）是由Cd2+與GSH在納米孔的大腔中相遇發生絡合反應后形成的絡合物被p-QABCD捕獲產生； 有過渡態信號（Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ）是由Cd2+與GSH分子直接在p-QABCD內部相遇并逐步發生絡合反應產生，p-QABCD作為傳感器記錄絡合反應過程。這5種信號集中在3個電流平臺，分別為I2A = （42.52 ± 3.27） pA （Level 2A）； I2B = （34.21 ± 2.21） pA （Level 2B）； I2C = （24.52 ± 3.08） pA （Level 2C）； 相應的平均滯留時間τoff分別為τoff2A = （0.07 ± 0.01） ms； τoff2B = （0.26 ± 0.03） ms； τoff2C = （0.34 ± 0.04） ms（圖2D～2G）。結果表明，pH=9.0時，Cd2+與GSH絡合反應過程中會產生3種不同結構的絡合中間產物或最終產物。

文獻[9～17]表明，GSH的巰基與金屬離子的結合幾乎不受pH值的影響，而去質子化的氨基與金屬離子的結合受pH值影響較大，在堿性條件下才會與金屬發生絡合反應。因此，為了確認3種絡合中間產物或最終產物的結構，在pH=7.4和pH=9.0時，將不同濃度比的Cd2+與GSH同時加入cis端，使其在本體溶液中形成絡合最終產物，記錄絡合最終產物進入p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔的電流響應信號。

3.3 p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔檢測Cd2+-GSH 絡合最終產物

3.3.1 pH=7.4時， p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔檢測Cd2+-GSH絡合最終產物pH=7.4時，將Cd2+和GSH同時加入cis端，二者在電解液中反應形成絡合最終產物并進入p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔，只產生一種電流信號I2=（33.32±2.08） pA，τoff2 = （0.24±0.13） ms（Level 2； 圖3A～3D），結果表明，pH=7.4時絡合反應的產物只有1種。圖3E表明，固定cis端GSH濃度為20 μmol/L， 隨著Cd2+濃度增加，事件頻率呈現先增大后穩定的趨勢。當Cd2+與GSH濃度比<0.5時， Level 2事件頻率呈線性增加，當濃度比>0.5時，Level 2事件頻率趨于定值。結合文獻[9，14，17]，Level 2由絡合產物Cd（GSH）2產生。與GSH分子相比，Cd（GSH）2具有更大的分子結構并且在穿孔時有4個離子化的羧基與p-QABCD相互作用，易被捕獲引起電流變化。Level 2的電流值和滯留時間與圖2中Level 2B相似（I2B = （34.21 ± 2.21）pA； τoff2B = （0.26 ± 0.03） ms），表明Level 2B由絡合產物Cd（GSH）2產生。

3.3.2 pH=9.0時，p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔檢測Cd2+-GSH絡合最終產物 pH=9.0時，同樣將Cd2+和GSH同時加入cis端，共產生兩種類型的電流信號： I3=（34.71 ±2.12） pA，τoff3 = （0.23±0.03） ms （Level 3） 和I4=（24.32±3.08） pA，τoff4 = （0.30±0.03） ms （Level 4）（圖4A～4E），結果表明，pH=9.0時，Cd2+與GSH絡合反應有兩種產物。其中Level 3與圖3中Cd（GSH）2的電流值和滯留時間接近（I2=（33.32±2.08）pA，τoff2 = （0.24±0.13） ms），表明Level 3是由絡合產物Cd（GSH）2產生。圖4F表明，固定cis端GSH濃度為20 μmol/L，隨著Cd2+濃度增加，絡合產物的相對比例發生明顯改變。當Cd2+與GSH的濃度比低于0.5時，電流平臺以Level 3為主，即絡合產物Cd（GSH）2； 當濃度比在0.5～1.0之間時，Level 3的事件頻率減小，Level 4的事件頻率增大； 當濃度比>1時，Level 3和Level 4的事件頻率趨于定值，以電流值較小的Level 4為主，表明產生Level 4的絡合產物具有比Cd（GSH）2 （Level 3）更大的分子結構，結合文獻[10，13，14]，表明Level 4是由絡合產物Cd2（GSH）2產生。Level 4與圖2中Level 2C的電流值和滯留時間相似（I2C = （24.52 ± 3.08） pA； τoff2C = （0.34 ± 0.04） ms），表明Level 2C是由絡合產物Cd2（GSH）2產生的。

3.4 鎘離子與谷胱甘肽的反應進程分析

上述實驗表明，絡合最終產物Cd（GSH）2和Cd2（GSH）2的電流響應信號與監測絡合反應進程中的Level 2B 和Level 2C的電流值與滯留時間相似， Level 2B和Level 2C的信號分別是由Cd（GSH）2和Cd2（GSH）2產生。文獻[9～17]表明，pH=9.0，GSH的巰基與去質子化的氨基均會與金屬離子發生絡合反應，但巰基與氨基很難絡合同一種金屬離子，因此推測Level 2A的信號由中間產物Cd（GSH）1或Cd2（GSH）1產生。典型的電流信號Ⅰ～Ⅴ表面，Cd2（GSH）2的形成遵循兩種路徑：（1）1個Cd2+首先結合2個谷胱甘肽分子的巰基，形成Cd（GSH）2，然后，第二個Cd2+結合去質子化的氨基形成Cd2（GSH）2（TypeⅠ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ； 圖2D）； （2）2個Cd2+分別結合同一個GSH分子的巰基和去質子化的氨基，形成Cd2（GSH）1，然后，第二個GSH分子的巰基和去質子化的氨基與Cd2（GSH）1的Cd2+結合形成Cd2（GSH）2（TypeⅡ和Ⅴ； 圖2D）。

3.5 p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔檢測其它金屬離子與GSH的絡合反應

pH=9.0時，cis端加入GSH，trans端分別加入金屬離子Pb2+、Zn2+和Ni2+。GSH與金屬離子在納米孔或p-QABCD中相遇并發生絡合反應產生的典型電流信號如圖5所示，均只產生兩種類型的電流信號。GSH與Pb2+絡合產物的電流平臺集中在（21.27 ± 1.27） pA和（32.12 ± 1.04） pA，GSH與Zn2+絡合產物的電流平臺集中在（25.63 ± 2.02） pA和（36.35 ± 1.07） pA，GSH與Ni2+絡合產物的電流平臺集中在（26.73 ± 2.07） pA和（37.16 ± 1.12） pA，表明這3種金屬離子與谷胱甘肽的絡合產物為兩種，但是均未產生有過渡態的電流信號，因此，p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔不能觀測到GSH與Pb2+、Zn2+或Ni2+絡合反應的中間過程。上述實驗結果表明，p-QABCD-（M113R）7αHL作為納米反應器和傳感器，能在單分子水平上特異性地檢測Cd2+與GSH的反應中間產物并監測反應路徑。

4 結 論

本研究采用分子適配器p-QABCD裝備基因工程化的（M113R）7αHL蛋白質納米孔，構建全新的單分子納米反應器和傳感器，實現在單分子水平對Cd2+與GSH的反應中間產物和最終產物的識別以及反應路徑的特異性監測。研究結果表明，pH=7.4時，Cd2+與GSH的絡合產物僅為Cd（GSH）2，pH=9.0時有兩種絡合產物，分別為Cd（GSH）2和Cd2（GSH）2。通過分析Cd2+與GSH絡合進程中的電流響應信號，揭示了Cd2（GSH）2的生成路徑。本研究拓展了蛋白質納米孔在單分子檢測領域的應用，為實時監測單分子反應的反應進程和探索復雜反應的反應路徑提供了新思路。

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