bcl-2在早期外傷性癲癇大鼠中的表達

王 文，寇小波，江 濤，喬 偉，杜 陳，黃其軍，馮愛平*

（德陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)科，四川 德陽 618000）

bcl-2在早期外傷性癲癇大鼠中的表達

王 文，寇小波，江 濤，喬 偉，杜 陳，黃其軍，馮愛平*

（德陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)科，四川 德陽 618000）

目的 研究早期外傷性癲癇大鼠皮層腦組織中bcl-2的表達。方法 將30只成年SD大鼠隨機分為正常對照組、實驗組、生理鹽水組（假手術(shù)組）。正常對照組大鼠不做任何處理，實驗組大鼠皮層注射FeCl3，生理鹽水組大鼠注射生理鹽水。24小時后檢測bcl-2的mRNA表達水平、bcl-2蛋白的表達水平。結(jié)果 行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組和生理鹽水組大鼠均未見癇性發(fā)作，實驗組大鼠可觀察到癇性發(fā)作；實驗組和生理鹽水組bcl-2的mRNA和蛋白表達均較正常對照組增高（P＜0.05），但實驗組較生理鹽水組顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論 bcl-2在PTE大鼠皮層腦組織中表達顯著下降，細胞凋亡可能與PTE的形成有關(guān)。

bcl-2；細胞凋亡；外傷性癲癇

外傷性癲癇(post-traumatic epilepsy，PTE)是一種嚴(yán)重的疾病，通常繼發(fā)于顱腦損傷，屬于臨床常見病，占癥狀性癲癇病的10%～20%[1]。癲癇發(fā)作可進一步加重腦損傷。創(chuàng)傷性腦損傷后存在細胞凋亡基因的表達，特別是B細胞淋巴瘤-2（bcl-2）基因的表達。PTE是由顱腦外傷發(fā)展而來，既然腦外傷后存在細胞凋亡相關(guān)基因bcl-2的表達，是否PTE也存在這些基因的表達及表達的程度如何，目前研究較少。本實驗通過研究鐵離子致癇大鼠模型腦組織中bcl-2的表達情況，探討早期外傷性癲癇的的可能發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取清潔級健康雄性SD大鼠30只，體重為200～250 g。隨機分為正常對照組、實驗組和生理鹽水組（假手術(shù)組）三組，每組均為10只。采用購于美國Sigma公司的FeCl3溶液（100 mmol/L），bcl-2兔單克隆抗體IgG購于美國Abcam公司，β-肌動蛋白（actin）鼠多克隆抗體IgG及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗購于中國北京中杉金橋公司，由中國北京六合華大基因科技公司合成PCR引物，Trizol RNA抽提試劑、SYBR Green PCR Master Mix及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司。

1.2 鐵離子致癇大鼠模型的制作

參照Golden N等[2]及筆者既往[3]實驗方法，采用濃度為3.5%、劑量為10 mL/kg的水合氯醛麻醉大鼠，于立體定位儀上固定，備皮、消毒并切開頭皮。在左側(cè)冠狀縫后1 mm、矢狀縫旁2 mm處鉆開顱骨，暴露皮層腦組織。進針深度3 mm，注射濃度為100 mmoL/L 的FeCl3溶液5 μL，勻速注射（在5 min內(nèi)），并留滯針頭數(shù)分鐘以防溶液外溢。注意切勿鉆穿硬腦膜傷及皮層腦組織，以免引起顱腦創(chuàng)傷出血干擾實驗結(jié)果。正常對照組不做處理，生理鹽水組（假手術(shù)組）在同樣位置注射5 μL 0.9%NaCl。麻醉蘇醒后觀察行為學(xué)表現(xiàn)，癲癇發(fā)作評分參照改良Racine法(0分為無癲癇發(fā)作；1分為愣神發(fā)作；2分為口面部痙攣、點頭；3分為一側(cè)前肢陣發(fā)性抽搐；4分為兩側(cè)前肢痙攣及持續(xù)性點頭；5分為前肢陣攣、強直或跌倒；6分為發(fā)作衰竭致死)。本組將≥3分的行為學(xué)改變定義為癲癇發(fā)作，符合條件者認定為成功。對于造模失敗者，補齊動物，重新造模。傷后24 h，通過腹腔注射水合氯醛的方式，對大鼠進行麻醉，斷頭取腦；然后，對左側(cè)大腦皮層注射區(qū)域標(biāo)本進行分離、沖洗并保存。

1.3 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測bcl-2 mRNA表達

取約80 mg腦組織標(biāo)本，參照說明書提取總RNA（Trizol法），微量分光光度計（美國BIO-RAD公司）檢測RNA樣品濃度（A值）及純度（A260/A280值在1.7～2.0范圍內(nèi)）并進行標(biāo)化。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參照進行實時定量PCR反應(yīng)（美國BIO-RAD公司的IQ5 RTPCR儀）。25 μl反應(yīng)體系中包含12.5μl SYBR GREEN，10 ul PCR水，0.25 μl上游引物，0.25μl下游引物和2μl cDNA。引物序列見表1。反應(yīng)條件如下：50℃ 2 min，95℃ 5 min；95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。PCR結(jié)果采用Ct值比較相對定量法，β-actin為內(nèi)參照。

表1 RT-PCR引物序列

1.4 Western blotting檢測bcl-2蛋白表達

按照說明書對總蛋白質(zhì)進行提取，以BCA法對其濃度情況進行檢測。以β-actin為內(nèi)參蛋白，將提取的蛋白樣品加入變性緩沖液放入沸水中，繼續(xù)蒸煮5分鐘；緊接著，再進行5分鐘的10000 r/min離心，并在此基礎(chǔ)上上樣。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜。在4℃封閉環(huán)境中，將經(jīng)過5%脫脂牛奶處理過的硝酸纖維膜放置并過夜；在此基礎(chǔ)上，再加入抗體孵育過夜，即抗β-actin抗體、抗bcl-2抗體。加入二抗于37℃孵育1 h。化學(xué)發(fā)光法進行顯色，通過Image J來檢測蛋白定量情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0分析，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示。檢測水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)觀察

實驗組共給12只大鼠左側(cè)運動-感覺皮層注射鐵離子，10只出現(xiàn)與人類發(fā)作相似的發(fā)作行為，主要有自動癥（面部肌肉顫動、規(guī)律性點頭、濕狗樣抖動）、上肢抖動并發(fā)展為向?qū)?cè)翻滾以及嚴(yán)重而持續(xù)的邊緣運動性驚厥（全身性強直-陣攣發(fā)作），未見發(fā)作嚴(yán)重而死亡的大鼠。傷后6 h內(nèi)發(fā)作最為頻繁，局灶性發(fā)作多見。發(fā)作間期進食、活動減少。見表2。正常對照組和生理鹽水組大鼠未觀察到癲癇發(fā)作。

表2 大鼠癲癇發(fā)作行為學(xué)表現(xiàn)

2.2 RT-PCR結(jié)果

實驗組bcl-2 mRNA的表達較正常對照組增高（P＜0.05），較生理鹽水組下降（P＜0.05）。見表3。

表3 大鼠皮層bcl-2 mRNA和蛋白的表達水平

1）經(jīng)LSD-t檢驗，與正常對照組比較，P＜0.05；2）經(jīng)LSD-t檢驗，與實驗組比較，P＜0.05。

2.3 Western blotting結(jié)果

實驗組bcl-2的蛋白表達較正常對照組增高（P＜0.05），較生理鹽水組顯著下降（P＜0.05）。見表3、圖1。

圖1 Western blotting顯示bcl-2蛋白的表達，1：正常對照組；2：實驗組；3：生理鹽水組。

3 討 論

癲癇發(fā)作是顱腦損傷后的嚴(yán)重并發(fā)癥，腦損傷愈重，并發(fā)癲癇的機會愈大，特別是開放性腦損傷。治療困難，易發(fā)展成為難治性癲癇。由于人類PTE腦組織標(biāo)本獲取困難，故以動物模型為研究對象。目前鐵離子致癇模型最為常用，本組采用皮層注射FeCl3作為致傷機制，成功率高，與文獻報道及筆者既往研究類似[2-3]。

顱腦外傷是人類死亡和殘疾的主要原因之一，其后的一系列病理生理反應(yīng)稱為繼發(fā)性損傷，繼續(xù)破壞損傷周圍腦組織，導(dǎo)致大量的神經(jīng)元丟失。其中，細胞凋亡機制起到主要作用[4]。bcl家族與細胞凋亡信號通路相關(guān)，主要包括抑制細胞凋亡的基因bcl-2和促進細胞凋亡的基因如bax，bcl-2蛋白的活化受bax調(diào)節(jié)，bax的表達可以增加線粒體膜的通透性，導(dǎo)致細胞色素C釋放到細胞質(zhì)，激活caspase-3，這不可避免地導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡[5]。而bcl-2作為一種“保護性”基因已經(jīng)在有關(guān)實驗中得到證實。在TBI早期能觀察到bcl-2的表達[6]，而且伴隨著bcl-2表達的下降，常伴有細胞凋亡性死亡增多的現(xiàn)象。應(yīng)用bcl-2多肽能夠減輕TBI后海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失，進一步支持bcl-2的“保護性”作用。本組研究通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，PTE大鼠傷后24小時皮層腦組織bcl-2的mRNA表達較生理鹽水組（假手術(shù)組）下降，Western blotting檢測顯示bcl-2蛋白在傷后也明顯下降。另外，實驗組皮層腦組織bcl-2的mRNA及蛋白表達均較正常對照組增高，也充分說明顱腦損傷后神經(jīng)細胞凋亡的發(fā)生。PTE大鼠抑制細胞凋亡的bcl-2的低表達，充分說明顱腦損傷后細胞凋亡與PTE有關(guān)。這與人類腦組織標(biāo)本的研究結(jié)果類似[7]。

綜上所述，本實驗結(jié)果提示皮層腦組織中bcl-2的低表達與大鼠早期PTE發(fā)作密切相關(guān)。鐵離子致傷后抑制細胞凋亡的bcl-2呈現(xiàn)低表達，導(dǎo)致細胞凋亡發(fā)生，引起神經(jīng)元異常放電，最終誘發(fā)PTE。需要指出的是，本研究的不足在于目前只是一種現(xiàn)象研究。但為在動物模型中繼續(xù)研究細胞凋亡與外傷性癲癇相關(guān)性提供了依據(jù)。

[1] Pitk?nen A, Immonen R. Epilepsy related to traumatic brain injury[J]. Neurotherapeutics, 2014,11(2):286-96.

[2] Golden N, Darmadipura S, Bagiada NA. The difference in seizure incidences between young and adult rats related to lipid peroxidation after intracortical injection of ferric chloride[J]. Singapore Med J, 2010,51(2):105-9.

[3] 王文.STIM1、ORAI1在外傷性癲癇大鼠中的表達.(03),2013.

[4] Lon?arevi?-Vasiljkovi? N, Milanovi? D, Pe?i? V, et al. Dietary restriction suppresses apoptotic cell death, promotes Bcl-2 and Bcl-xl mRNA expression and increases the Bcl-2/Bax protein ratio in the rat cortex after cortical injury[J]. Neurochem Int,2016,96:69-76.

[5] 張淑玲,常全忠,李銀生,郭學(xué)鵬.缺氧缺血性腦損傷大鼠腦內(nèi)bcl-2基因表達與細胞凋亡的關(guān)系.實用兒科臨床雜志,2004(05):387-388+434.

[6] Raghupathi R, Conti AC, Graham DI, et al. Mild traumatic brain injury induces apoptotic cell death in the cortex that is preceded by decreases in cellular Bcl-2 immunoreactivity. Neuroscience. 2002. 110(4): 605-16.

[7] 蔡衛(wèi)林,唐運林,何鵬翔,等.Bcl-2蛋白在外傷性癲癇病灶中的表達[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2010(05):312-314+318.

本文編輯：李新剛

The expression of bcl-2 in post-traumatic epilepsy rats

WANG Wen, KOU Xiao-bo, JING Tao, QIAO Wei, DU Chen, HUANG Qi-jun, FENG Ai-ping
(Department of Neurology, Deyang Second People's Hospital, Sichuan Deyang 618000, China)

Objective To investigate the expression of bcl-2 in cortical brain tissue of post-traumatic epilepsy rats. Methods 30 adult SD rats were randomly divided into control group、experimental group and NS group. The rats in the normal control group did not do any treatment。The experimental group were injection FeCl3,the NS group were injection with saline.The mRNA expression level of bcl-2 and the expression level of bcl-2 protein were detected after 24 h. Results Typical seizures were observed in experimental group. In the mRNA and protein expression of bcl-2, the other two groups declined compared to the control group. However, the experimental group was lower than those in the NS group (P＜0.05). Conclusions The expression of Bcl-2 in the cortical brain tissue of PTE rats decreased significantly, and apoptosis might be related to the formation of PTE.

bcl-2; Neuronal apoptosis; post-traumatic epilepsy

R-332

A

ISSN.2095-8242.2017.22.4162.02

德陽市科學(xué)技術(shù)和知識產(chǎn)權(quán)局基金（2014SZ037）資助

馮愛平