麻黃堿對IL-17誘導的人永生化角質形成細胞HaCaT分泌CCL20的影響

蔣燕，郭順，，鄒悅，陳力

(1南京中醫藥大學第一臨床醫學院，南京210023；2江蘇省中醫院)

麻黃堿對IL-17誘導的人永生化角質形成細胞HaCaT分泌CCL20的影響

蔣燕1，郭順1，2，鄒悅1，陳力2

(1南京中醫藥大學第一臨床醫學院，南京210023；2江蘇省中醫院)

目的 觀察麻黃堿對IL-17誘導的人永生化角質形成細胞HaCaT分泌CCL20的影響。方法 將HaCaT細胞隨機分為6組。A組加不含藥物的培養液， B組加含20 ng/mL IL-17的培養液，C、D、E分別加含20 ng/mL IL-17聯合800、1 200、1 600 μg/mL麻黃堿的培養液，F組加含20 ng/mL IL-17聯合50 μg/mL MTX的培養液。培養36 h后，采用ELISA法測定細胞上清液CCL20，采用RT-PCR法測定細胞中的CCL20 mRNA。結果 A、B、C、D、E、F組HaCaT細胞上清液CCL20水平分別為(97.72±1.86)、(159.43±7.09)、(147.05±2.25)、(138.60±8.04)、(126.66±7.04)、(114.39±3.90)pg/mL，HaCaT細胞CCL20 mRNA相對表達量分別為0.91±0.08、7.22±0.32、4.95±0.33、2.79±0.19、1.79±0.49、1.80±0.47；B、C、D、E、F組均高于A組(P均<0.05)，D、E、F組均低于B組(P均<0.05)，C、D組均低于F組(P均<0.05)。結論 麻黃堿能有效抑制IL-17誘導的HaCaT細胞分泌CCL20，為麻黃治療銀屑病提供一定的理論依據。

麻黃堿；趨化因子；CCL20；白細胞介素17；銀屑病；人永生化角質形成細胞

銀屑病是一種由T細胞介導的持續存在的慢性、炎癥性疾病，其主要表現是角質形成細胞的異常分化和增殖。Th17細胞是一類T細胞，其標志性細胞因子IL-17 具有強大的致炎性，在銀屑病的發生發展過程中有重要作用[1，2]。CCL20又稱為巨噬細胞炎性蛋白-3α( MIP-3α)，是CC類趨化因子之一，在IL-17的誘導下表達明顯增加[3～5]；其也可誘導Th17細胞增殖和活化，并募集炎性因子進入皮損區,導致銀屑病的發生[4，5]。傳統中醫認為銀屑病多采用清熱涼血法，現代中醫創新地提出汗法治療銀屑病亦可取得良好效果[6，7]。麻黃作為發汗藥之首，具有通腠理、解肌功效。麻黃堿是麻黃的主要成分，具有一定的發汗作用。2016年5～10月，我們以麻黃堿作為干預藥物，觀察其對IL-17介導的人永生化角質形成細胞HaCaT分泌CCL20的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設備 人永生化的角質形成細胞HaCaT購于南京凱基生物有限公司，高糖DMEM、胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、DMSO購于美國Gibco公司；重組IL-17購于美國PeproTech公司，重組細胞因子溶解稀釋套裝購于杭州聯科生物技術有限公司。鹽酸麻黃堿購于中國食品藥品檢定研究院，甲氨蝶呤注射液(MTX)購于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。ELISA試劑盒購于美國R&D公司，TRIzol購于美國Invitrogen公司，逆轉錄及SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量PCR試劑盒均購于大連寶生物工程有限公司。倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司產品，細胞培養箱為美國Thermo公司產品，熒光定量PCR儀、酶標儀為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 HaCaT細胞培養 HaCaT細胞置于高糖DMEM培養基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)中，于5% CO2、恒溫、37 ℃培養箱培養。

1.2.2 藥物溶液制備 麻黃堿先高溫滅菌后用PBS(pH 7.2～7.4)溶解成10 mg/mL，母液儲存于4 ℃冰箱，臨用時用10%血清DMEM稀釋成各濃度加入孔中。MTX以高溫滅菌后用PBS(pH 7.2～7.4)稀釋成50 μg/mL待用，儲存于4 ℃冰箱。

1.2.3 HaCaT細胞上清液中CCL20水平檢測 采ELISA法。取對數生長期的HaCaT細胞，常規消化后按5×105/孔種植于6孔板，置于37 ℃、5% CO2恒溫孵箱中。24 h后觀察鋪板均勻、生長狀態良好后，將細胞隨機分為6組。A組加不含藥物的培養液2 mL， B組加含20 ng/mL IL-17的培養液2 mL，C、D、E、分別加含20 ng/mL IL-17聯合800、1 200、1 600 μg/mL麻黃堿的培養液2 mL，F組加含20 ng/mL IL-17聯合50 μg/mL MTX的培養液2 mL。培養36 h后收集上清液，以2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清。用PBS(pH 7.2～7.4)稀釋細胞，調整細胞密度到1×106/mL。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成分。以2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清。每組設3個復孔，根據ELISA試劑盒說明進行，操作實驗完成后用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔光密度(OD值)；根據制作的標準曲線，采用間接法讀取各樣品的CCL20水平。

1.2.4 HaCaT細胞CCL20 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取對數生長期的HaCaT細胞，常規消化后按35×105/孔種植于直徑6 mm小皿中，置于37 ℃、5% CO2恒溫孵箱中。24 h后觀察鋪板均勻、生長狀態良好后，細胞分組與用藥同1.2.3，培養36 h。①HaCaT細胞總RNA提取：采用TRIzol法。小皿中加入4 ℃的TRIzol 1 mL，然后轉移至1.5 mL離心管中，在室溫下放置5 min，使得核酸蛋白復合物完全分離；然后加入0.2 mL氯仿，蓋緊離心管管蓋，用手上下振蕩15 s，溶液呈乳白狀，無分層現象；室溫靜置3 min后，4 ℃下以12 000 r/min離心15 min；取出離心管，樣品分為無色的上清水相、中間的白色層及粉紅色的下層有機相。小心吸取無色上清水相，移至另一離心管；向得到的上清水相加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10 min；4 ℃下以12 000 r/min離心10 min，小心去除上清；緩慢沿管壁加入75%乙醇(用DEPC處理過的水配制)1 mL，輕輕混勻。4 ℃下以12 000 r/min離心10min，小心吸盡上清；室溫干燥沉淀5 min，加入30～50 μL的無RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-70 ℃保存。②RNA純度測定及定量：取RNA樣品，用Buffer稀釋100倍，測定樣品在260 nm和280 nm的OD值確定RNA的質量。計算公式：RNA濃度=OD260×稀釋倍數×0.04 μg/μL。比色皿光徑1 cm，OD260/OD280在1.8～2.1可進行下一步的實驗。③cDNA的合成：反應液的配制按說明書進行，反應體系為20 μL。反應條件為37 ℃ 15 min (反轉錄反應) ，85 ℃ 5 s(反轉錄酶失活反應) ，合成第一鏈cDNA。④熒光實時定量PCR反應：引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。CCL20上游引物為5′-ACCTCTGCGGCGAATCAGAA-3′,下游引物為5′- GATAGCATTGATGTCACAGCCTTCATT-3′，擴增片段為134 bp；內參照β-action上游引物為 5′-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′，下游引物為5′-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3′，擴增片段為132 bp。RT-PCR反應液的配制按說明書進行，反應體系為20 μL 。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，循環40次，實驗結果采用2-ΔΔCT計算，以CCL20 與β-actin 的比值表示其相對表達量。

2 結果

2.1 各組HaCaT 細胞上清液CCL20水平比較 A、B、C、D、E、F組HaCaT細胞上清液CCL20水平分別為(97.72±1.86)、(159.43±7.09)、(147.05±2.25)、(138.60±8.04)、(126.66±7.04)、(114.39±3.90)pg/mL，B、C、D、E、F組HaCaT細胞上清液CCL20水平均高于A組(P均<0.05)，D、E、F組HaCaT細胞上清液CCL20水平均低于B組(P均<0.05)，C、D組HaCaT細胞上清液CCL20水平均低于F組(P均<0.05)。

2.2 各組HaCaT細胞CCL20 mRNA表達比較 A、B、C、D、E、F組HaCaT細胞CCL20 mRNA相對表達量分別為0.91±0.08、7.22±0.32、4.95±0.33、2.79±0.19、1.79±0.49、1.80±0.47，B、C、D、E、F組HaCaT細胞CCL20 mRNA相對表達量均高于A組(P均<0.05)，D、E、F組HaCaT細胞中CCL20 mRNA相對表達量均低于B組(P均<0.05)，C、D組HaCaT細胞CCL20 mRNA相對表達量均低于F組(P均<0.05)。

3 討論

Th17細胞作為影響銀屑病發生發展的重要T細胞廣受關注，其向皮損遷移浸潤是銀屑病最先發生的過程[8]。IL-17是Th17細胞特異產生的細胞因子，具有強大的致炎效應，也可誘導角質形成細胞產生各種趨化因子。CCL20是IL-17誘導分泌的重要趨化因子，其特異性受體CCR6多表達于Th17細胞中的CD4+效應T細胞[9]。CCL20與CCR6的惟一選擇性保證了CCR6陽性細胞即Th17細胞準確遷移定位至皮損部位[10]。CCL20特異性募集Th17細胞，也可誘導其增殖活化分泌大量促炎因子IL-17、IL-22、TNF-α等；這些炎性因子也可以被CCL20募集至皮損部位，并且可以刺激角質細胞異常增殖并釋放更多細胞因子,以活化T細胞[4，5，11]。活化后的T細胞及角質形成細胞分泌的細胞因子，可通過影響增殖及凋亡調控基因的表達，再次影響角質細胞的增生，形成惡性循環，最終導致銀屑病的發生發展[1]。研究表明，IL-17顯著增加CCL20的表達, 具有劑量和時間依賴性[5]。在正常角質形成細胞中CCL20低水平表達，而CCL20在銀屑病皮損中呈高表達，皮損越嚴重表達程度越高[5，11]。本次實驗以IL-17作為誘導因子介導永生化角質形成細胞(HaCaT細胞)分泌CCL20模擬銀屑病體外實驗簡易模型。現代醫家總結前人經驗認為銀屑病常由“血”論治，常治以清熱涼血法。宋坪等[7]提出從“玄府”論治新觀點，在治療上采用“開通玄府法”治療斑塊狀銀屑病，常用藥物麻黃、桂枝等，治療銀屑病也取得一定成效。我們在前期研究中已證實，單藥麻黃可以拮抗小鼠銀屑病樣模型的發生[12]。麻黃堿作為麻黃的主要成分，分子量較小，易溶于水、乙醇等溶劑，較為穩定，并且有研究表明其具有較強發汗作用[13]。本研究將麻黃堿溶于pH適宜的PBS中，并且分成800、1 200、1 600 μg/mL的濃度分別干預IL-17誘導的HaCaT細胞，為“汗法”治療銀屑病的體外實驗提供一定的實驗基礎。MTX在臨床運用治療銀屑病得到廣泛應用，取得較好療效[14]。其藥理學作用主要是競爭性抑制四氫葉酸在胸腺嘧啶合成過程中傳遞甲基的作用，以阻止細胞周期中DNA的合成，可以影響銀屑病中角質細胞異常增殖達到治療目的；也有研究發現，MTX可以抑制體內淋巴細胞的增殖活化[15]；另有部分學者研究發現，其可能在抑制T細胞活化并且抑制活化后趨化因子的生成以阻斷銀屑病惡性循環的免疫效應有重要作用[16，17]。因此，本次實驗參考以往文獻[18]及前期實驗以50 μg/mL MTX干預IL-17誘導的HaCaT細胞作為陽性參照組。

本次實驗運用ELISA測定麻黃堿、MTX干預IL-17誘導的細胞分泌CCL20，結果表明IL-17能夠促進HaCaT細胞分泌CCL20，麻黃堿能依賴濃度抑制這一效應，MTX也能達到明顯地抑制效果，且MTX的抑制效應比低、中濃度的麻黃堿強。RT-PCR檢測結果與此相一致：IL-17能夠提升HaCaT細胞的mRNA表達水平，麻黃堿隨著濃度的增加抑制效應更強；MTX能夠明顯地抑制其表達水平，并且比低、中濃度麻黃堿平均表達水平低。此結果表明，IL-17能夠明顯提高HaCaT細胞分泌CCL20的能力，MTX作為臨床療效確切的藥品能夠明顯抑制其分泌能力，與既往研究相符[18]。低濃度與中濃度的麻黃堿雖然沒有MTX的抑制效應強，但是從三組不同濃度麻黃堿的比較來看，隨著麻黃堿的濃度升高，HaCaT細胞分泌CCL20的水平、CCL20 mRNA相對表達量越來越低。這表明麻黃堿能夠抑制IL-17誘導HaCaT細胞分泌CCL20，提示麻黃堿可能在抑制銀屑病活化Th17細胞及其分泌趨化分子這一環節發揮作用，具體機制還需進一步研究。本實驗為麻黃組成方有效治療銀屑病提供一定實驗基礎，為“汗法”治療銀屑病提供理論基礎。

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Effect of ephedrine on CCL20 secretion of IL-17-induced immortalized human keratinocytes (HaCaT)

JIANGYan1,GUOShun,ZOUYue,CHENLi

(1FirstClinicalMedicalCollegeofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Objective To observe the effect of ephedrine on CCL20 secretion of IL-17-induced immortalized human keratinocytes (HaCaT).Methods HaCaT cells were randomly divided into 6 groups.Cells in the group A were only treated by DMEM. Cells in the group B were treated with 20 ng/mL IL-17 nutrient solution. Cells in the groups C, D and E were treated with 800, 1 200 and 1 600 μg/mL ephedrine medium including 20 ng/mL IL-17. Cells in the group F were treated with 20 ng/mL IL-17 combined with 50 μg/mL MTX culture medium. After 36 h, ELISA was performed to determine the expression of CCL20 protein. RT-PCR was used to assess the expression of CCL20 mRNA. Results The expression levels of CCL20 protein in the cultural supernatant of HaCaT cells of groups A, B, C, D, E and F were (97.72±1.86), (159.43±7.09), (147.05±2.25), (138.60±8.04), (126.66±7.04), (114.39±3.90) pg/mL, respectively. The relative CCL20 mRNA expression in HaCaT cells of groups A, B, C, D, E, F were 0.91±0.08, 7.22±0.32, 4.95±0.33, 2.79±0.19, 1.79±0.49, 1.80±0.47, respectively. Groups B, C, D, E and F were higher than group A (allP<0.05); groups D, E, F were lower than group B (allP<0.05); groups C and D were lower than group F (all P<0.05).Conclusion Ephedrine can inhibit the CCL20 secretion of IL-17-induced HaCaT cells, and it provides a theoretical basis for the treatment of psoriasis by ephedrine or even diaphoresis.

ephedrine; chemotactic factor; CCL20; interleukin-17; psoriasis; immortalized human keratinocytes

國家自然科學基金資助項目(81603626)；江蘇省中醫院院級課題(Y14020)。

蔣燕(1990-)，女，碩士研究生，主要研究方向為銀屑病。E-mail： jiangyan20088@126.com

陳力(1960-)，女，碩士生導師，教授，主任醫師,主要研究方向為痤瘡及銀屑病等。E-mail： wandyyf@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.10.007

R285.5

A

1002-266X(2017)10-0024-04

2016-11-15)