脾氣虛大鼠焦慮樣行為及其初步機制研究

劉文俊　柴紀嚴　謝鑫

[摘要]目的 研究脾氣虛大鼠焦慮程度的變化并探討其可能機制。方法 選取雄性SD大鼠16只，體質量（200±10）g，將其隨機分為對照組和脾氣虛組（模型組），每組8只。曠場實驗評價大鼠焦慮程度；ELISA法測定海馬組織ATP和縮膽囊素-8（CCK-8）含量；免疫組化法檢測海馬CCKB型受體（CCKBR）表達。結果 與對照組比較，模型組的焦慮程度顯著降低（P<0.01），海馬組織的ATP含量降低（P<0.05），海馬CCK-8水平變化不明顯（P>0.05），但其受體表達下降（P<0.05）。結論 脾氣虛時焦慮程度下降，其初步機制與海馬能量不足和CCKBR表達減少有關。

[關鍵詞]脾氣虛；焦慮；縮膽囊素-8；縮膽囊素B受體；ATP

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）07（b）-0004-03

[Abstract]Objective To study the anxiety degree change of rats in spleen qi deficiency rat and discuss its initial mechanism.Methods 16 male SD rats with the body mass of （200±10）g were selected and they were randomly divided into the control group and spleen qi deficiency group （model group），and there were 8 rats in each group.Open-field test （OFT） was used to evaluate anxiety degree of rats.ELISA was chosen to measure ATP and CCK-8 concentrations in hippocampal tissue.Immunohistrochemical method was used to check CCKBR expression in hippocampal tissue.Results Compared with those in the control group，rat′s anxiety was reduced （P<0.01），hippocampal ATP level was decreased （P<0.05），hippocampal CCK-8 concentration was unchanged （P>0.05），hippocampal CCKBR expression was decreased （P<0.05） in the model group.Conclusion Anxiety in spleen qi deficiency is lower and its initial mechanism might involve in decrease of hippocampal ATP level and CCKR expression.

[Key words]Spleen qi deficiency；Anxiety；Cholecystokinin-8；CCKB receptor；ATP

焦慮是機體在適應新環境過程中所表現出的一種基本情緒，具有一定的趨避性，適度焦慮具有保護意義。研究發現，海馬縮膽囊素（cholecystokinin，CCK）及其B型受體（CCK B receptor，CCKBR）與焦慮的形成關系密切[1-4]。中醫將焦慮歸屬神志范疇，由心所主，但也依賴于脾主運化的功能，因為神志受氣血供養，而脾為氣血生化之源，如果脾氣不足，則神失所養，焦慮程度勢必受到影響，但目前沒有相關報道。本研究首先觀察脾氣虛狀態下大鼠的焦慮樣行為變化，進而圍繞海馬CCK及其受體表達探討其發生機制。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組

選取SPF級雄性SD大鼠16只，體質量（200±10）g，購于本溪實驗動物中心[許可證號：SCXK（遼）-2010-0001]，隨機分為對照組和脾氣虛組（模型組），每組8只。大鼠飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心[許可證號：SYXK（遼）-2013-000-9]，自由飲水進食，18～23℃，相對濕度45%～55%。適應性飼養1周后開始實驗。

1.2脾氣虛模型的復制方法及評價標準

模型組大鼠按文獻[5-6]方法復制和評價脾氣虛證模型，即15 d內給予饑飽失常刺激（飽食1 d+禁食2 d，共5個循環），同時每日水溫35～37℃游泳至力竭，以大鼠出現消瘦、食少、神疲和乏力等表現為模型復制成功。

1.3大鼠焦慮程度評價

采用曠場實驗（open-field test，OFT）法評價。將大鼠放入OFT-100大小鼠開場活動實驗系統的箱體中心，記錄其5 min內在不同區域的活動時間。將箱體底部分為25個小格，規定中間9格為中心區域，四角的四格為角落區域，其他12個格為周邊區域。焦慮程度=（角落活動時間+周邊活動時間）/中心活動時間[7-9]。徹底清潔箱體后，檢測下1只大鼠。

1.4海馬組織ATP和CCK-8含量檢測

采用ELISA法。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（3.5 ml/kg）后，取雙側海馬組織，按文獻[10]方法，應用Bio-Rad美國伯樂iMark酶標儀，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.5海馬CCKBR表達

采用免疫組化法。按文獻[11]方法，即制備海馬石蠟切片（4 μm）后，常規脫水，雙氧水封閉，PBS洗3 min×3次，檸檬酸緩沖液（0.01 mol/L，pH6.0），微波爐高火3 min，低火維持15 min，冷卻至室溫后PBS洗3 min×3次；滴加血清封閉液，37℃水浴30 min，棄血清，滴加兔抗大鼠CCKRB受體多克隆抗體（1∶300，三蒸水稀釋），4.0℃過夜；37℃水浴2 h；PBS洗3 min×3次，滴加羊抗兔IgG，37℃水浴30 min；PBS洗3 min×3次，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇二甲苯脫水，中性樹膠封片。陰性對照采用抗體稀釋液代替一抗，步驟同上。鏡下CCKBR陽性反應物呈棕黃色，采用BI-2000醫學圖像分析系統分析其平均光密度。

1.6統計學處理

采用統計學軟件SPSS 17.0分析數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩組大鼠焦慮程度的比較

由圖1和表1可見，對照組大鼠主要活動于角落和周邊區域，較少通過中心區域；與此相比，模型組大鼠在中心區域活動增加，活動時間顯著延長，角落活動時間明顯增加，周邊活動時間無明顯變化，但焦慮程度低于對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。

2.2兩組大鼠海馬組織ATP和CCK水平及CCKBR表達的比較

與對照組比較，模型組海馬ATP含量和CCKBR表達低于對照組（均P<0.05），但CCK-8水平雖然減少，但差異無統計學意義（P>0.05）（表2）。

3討論

隨著焦慮癥發病率日漸提高，相應的中醫研究和治療也成為社會需求[12-14]。但中醫典籍中無焦慮癥的明確記載，特別是目前尚不清楚五臟與焦慮的關系，因此開展相關研究具有一定的現實意義。

與焦慮癥不同，焦慮屬于一種具有適應性意義的重要情感反應，能夠提高大腦的反應性和警覺性，協調機體各部分功能，以應對威脅自身安全的危險情景。焦慮雖屬于負性情緒，但其趨避特性可以讓機體遠離危險，因此具有重要的保護意義。檢測動物焦慮樣行為的方法較多，本研究選用了OFT。OFT可以檢測嚙齒類動物自發活動和探索行為，最初應用于大鼠，后來逐步推廣到小鼠及其他動物，現在也多用于檢測大鼠的焦慮樣行為[15-17]。本研究觀察到，對照組大鼠進入曠場后，因對中心空曠區域存在畏懼，而更多地選擇活動于角落和周邊區域，即使通過中心區域也只是短暫停留，不會表現出較長時間的探究行為，產生較為明顯的趨避性，焦慮程度較高，顯示該組大鼠具有較為強烈的自我保護意識。

中醫將自然界中各種事物的運動變化稱為“神”，即“陰陽不測謂之神”（《素問·天元紀大論》），并認為心總管機體對外來刺激的應答，即心主神志。心具有“任物”功能，即接受和處理外來信息，對外界變化作出相應判斷，以形成精神、意識和思維等活動。不過，心還需要其他四臟支持，才能正常執行“任物”功能，特別是脾化生氣血的功能。中醫認為氣血為神的物質基礎，如“血氣者，人之神”（《素問·八正神明論》，“血者，神氣也”（《靈樞·營衛生會》），因此，只有脾運正常，氣血化生充足，從而維持心主神志功能，以正常“任物”，而脾氣不足則導致氣血化生不足，削弱心的“任物”能力，使其難以正確應對外來刺激，引起機體功能紊亂，甚至危及生命，即“得神者昌，失神者亡”（《素問·移精變氣論》）。

鑒于脾主運化功能是神志活動的基礎，本研究通過觀察脾氣虛大鼠的焦慮樣行為變化，探討脾與焦慮的關系。實驗結果顯示，模型組大鼠進入曠場后，其在中心區域活動時間明顯延長，而角落停留時間變短，焦慮程度顯著低于對照組。該組大鼠的上述表現提示，脾氣虛時機體處在新的環境中，對未知危險的感知能力下降，不能正確應對潛在危險，自身保護能力不足。

海馬是行為和情緒形成的重要結構，其神經元功能狀態直接影響機體對外界的應答。本研究結果顯示，模型組大鼠海馬ATP含量顯著低于對照組，提示海馬神經元能量供給不足與脾氣虛時焦慮程度下降有關。許多研究認為，ATP是氣血的物質基礎之一[18-19]，由此推測脾可以通過生成ATP的方式維持機體適度焦慮。此外，海馬神經元的相關神經遞質在焦慮樣行為產生中發揮重要作用。CCK-8雖然首先發現于胃腸道，卻是廣泛分布于大腦的一種重要神經肽，尤其以海馬結構表達最為豐富。研究發現，CCK-8結合其受體后可以在認知行為、攝食和學習記憶等方面扮演重要角色，而其在焦慮方面的作用尤受重視[1-4]。本研究結果顯示，模型組海馬組織CCK-8水平雖無明顯下降，但其受體表達顯著低于對照組，提示該受體介導的海馬神經元生物學效應可能出現異常，其中可能涉及了行為和情緒的產生等，但詳細作用還需要后續工作證實。

綜上所述，脾氣虛可降低焦慮程度，其初步機制與海馬能量不足和CCKBR表達減少有關。

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（收稿日期：2017-06-05 本文編輯：許俊琴）