棘胸蛙(Quasipaaspinosa)對重復急性冷暴露的生理應激與適應耐受

頡志剛,王永鵬,王 娜,鄭榮泉,2

1 浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江省野生動物生物技術與保護利用重點實驗室，金華 3210042 浙江師范大學行知學院， 金華 321004

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)對重復急性冷暴露的生理應激與適應耐受

頡志剛1,2,*,王永鵬1,王 娜1,鄭榮泉1,2

1 浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江省野生動物生物技術與保護利用重點實驗室，金華 3210042 浙江師范大學行知學院， 金華 321004

為探討棘胸蛙(Quasipaaspinosa)這一溪源性兩棲類對環境溫度極端變化做出的生理響應與適應機制,測定了該物種在反復遭受急性冷暴露(4 ℃, 12 h)過程中其非特異性免疫反應、氧化還原狀態以及熱休克蛋白70(Hsp70)mRNA 表達的變化,結果發現：棘胸蛙在初次冷暴露過程中外周血細胞吞噬活性(第4小時 和第 12小時；P<0.05)、脾巨噬細胞呼吸爆發強度(第4小時 和第12小時；P<0.05)以及胃溶菌酶活力受到顯著抑制(第12小時；P<0.05)；當蛙返回到 22 ℃ 環境 12 h 后3種免疫指標均恢復到初始和對照組水平(P>0.05)。經過連續 7 d 冷暴露后,除溶菌酶外,血細胞吞噬活性和脾巨噬細胞呼吸爆發強度均能恢復到初始和對照組水平(P>0.05)。另外,冷暴露增加了肝臟和腎臟內丙二醛(MDA)的含量,但腎臟內 MDA 含量升高的幅度要明顯大于肝臟；肝臟 SOD 活力和 GSH 含量也表現出急性和適應性升高,而腎臟僅 SOD 活力有所升高,暗示在低溫脅迫狀態下棘胸蛙肝臟氧自由基清除能力要強于腎臟。HSP70 作為應激保護蛋白,當機體遭受冷暴露后肝臟 Hsp70 mRNA 表達量始終未呈現出應激性升高,反而受到顯著抑制(P<0.05)。綜上所述,棘胸蛙在經歷多次急性冷脅迫后體內部分非特異性免疫功能以及肝臟氧化防御系統可以產生不同程度的適應性改變。

棘胸蛙；冷暴露；免疫；氧化防御；熱休克蛋白70

氣候異常可能是導致全球兩棲動物種群衰退和物種滅絕的重要因素之一[1-2]。如非季節性極端低溫天氣的頻繁出現或季節交替期出現的寒流都可能嚴重干擾兩棲動物的生理內穩態[1,3],從而增加感染疾病的風險,最終可能成為導致種群數量下降的誘因[2,4]。兩棲類特異性免疫進化并不完全,非特異性免疫在特異性免疫被調動前可快速地為機體提供免疫保護,尤其在應激狀態下占有主導地位[5-6]。溫度依賴性是兩棲類免疫反應的主要特征[7- 9],低溫一方面可以直接降低免疫細胞的活力并抑制溶菌酶等胞外酶的分泌和活性,另一方面可通過激活丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA)引起糖皮質激素(Glucocorticoid, GC)分泌的增加[10-11],而 GC 可以抑制巨噬細胞對病原的吞噬與加工,阻礙淋巴母細胞轉化,減少血液循環中淋巴細胞數量[12]。

在脅迫狀態下氧自由基或活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的大量積累可導致機體氧化損傷[13-14]。ROS 可改變包括免疫細胞在內的細胞膜上磷脂雙分子層中飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸比例,并破壞膜內蛋白的生物活性造成細胞變性、腫脹乃至死亡[14]。體內超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶類和谷胱甘肽(GSH)等非酶抗氧化物質可清除多余的 ROS,以維持機體的氧化-抗氧化的內穩態(Oxidant-antioxidant Homeostasis, OAH)[15]。

熱休克蛋白(Heat shock protein, HSPs)是機體受到脅迫時表達的一類重要的保護性蛋白, 在調節免疫功能和抗感染方面發揮著重要作用[16-19]。氧化脅迫可以通過激活熱休克轉錄因子(Heat Shock Transcription Factor, HSF)來增加 HSPs 的合成[20],而 HSPs 可以促使 SOD 等抗氧化物的合成和釋放[21]。

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)隸屬于蛙科、棘蛙屬,主要分布在我國南方和越南山區(海拔在500—1000m)的溪流生境,具有較高的科研價值和經濟價值。在養殖實踐中,該物種對環境溫度和潔凈度的要求非常苛刻,尤其在季節交替期比其他常見養殖蛙類更易患病。本研究的目的是了解這一溪源性蛙類在遭受低溫脅迫后機體的免疫功能和氧化防御會做出如何響應,以及在遭受多次脅迫后是否會表現出適應耐受。這對探討兩棲動物環境適應策略及種群波動機制具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 動物與馴化

棘胸蛙于 2010 年 10 月 12 日采自浙江省開化縣山區(118°01′—118°37′N,28°54′—29°30′E ),將采集的個體馴養于水族箱(90 cm×40 cm×40 cm,15 只/箱)內馴化兩周,提供充足的水陸環境和遮蔽物。馴化期間控制水溫(22±1)℃和光周期(12 L∶12 D),每日以黃粉蟲(Tenebriomolitor)活體作為餌料投食1次,隔日用經曝氣脫氯的自來水換水1/3。

1.2 低溫脅迫處理與取樣

選擇 80 只蛙(體重(75.77±1.66) g,性別1∶1)作為實驗動物。將蛙隨機分為兩組,38 只動物仍飼養于馴化環境((22±1) ℃,12—13 只蛙/箱)作為對照組；為保障樣本量將 42 只動物用于冷暴露,將蛙隨機置入低溫恒溫((4±0.5) ℃)培養箱(MIR- 253, SANYO, Japan)內,每臺培養箱配有3個玻璃槽(30 cm×20 cm×15 cm,保持1 cm 水位,14 只蛙/槽,外罩尼龍防逃網),每天冷暴露 12 h 后,再將其轉入馴化環境 12 h,并反復處理 7 d。在冷暴露當天的第 0、4、12、24小時及第7天 的第12小時和 24小時分別取6只動物,對照組同期取樣。蛙經毀髓后斷頭取血(用EDTA- 2Na抗凝),解剖后在冰上操作取脾臟立即用于巨噬細胞呼吸爆發的測定,肝臟、腎臟和胃保存于 -80 ℃ 用于后續分析。

1.3 免疫學指標測定

1.3.1 外周血吞噬活性

采用熒光標記法測定全血吞噬能力,參考 Miliukiené 等[22]方法進行：在 100 μL 抗凝全血加入 50 μL 經熒光素 FITC 標記的酵母(Saccaromycescerevisiae)懸液(1×108個/mL),于 25 ℃ 孵育 60 min,利用熒光分光光度計(RF- 5301PC, SHIMADZU, Japan)測定熒光強度,吸收光波長 480 nm,發射光波長 520 nm。

1.3.2 脾巨噬細胞呼吸爆發

采用氮藍四唑(Bitroblue tetrazolium, NBT)還原法測定脾臟巨噬細胞的呼吸爆發,參照 Couso 等[23]的方法。

1.3.3 胃溶菌酶活力

采用比濁法測定胃溶菌酶活力,以溶壁微球菌(Micrcoccuslysoleikticus)為底物,詳見Shugar[24]建立的方法。

1.4 氧化還原狀態指標測定

肝臟和腎臟的脂質過氧化產物丙二醛(Malonaldehyde, MDA)、GSH 含量以及 SOD 活力用試劑盒(南京建成生物技術研究所)測定。

1.5 肝臟 Hsp70 基因表達半定量分析

肝臟總 RNA 提取方法參照總 RNA 提取試劑盒說明書(寶生物工程有限公司),反轉錄合成第一鏈 cDNA (RT 試劑盒,寶生物工程有限公司)。根據 GeneBank 中黑線倉鼠(CricetulusBarabensis)、牛(Bostaurus)、非洲爪蟾(Xenopusleavis)、歐非肋突螈(Pleurodeleswaltl)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis) HSP70 cDNA 序列設計簡并引物(上游引物 5′-GCAMCYAAAGGAGTCGYAGT- 3′,下游引物 5′-TYTCGTGKATCTGAGMTTTG- 3′)進行片段克隆,根據測序獲得的片段序列設計上游引物 5′-GACCTCGGCACTACCTACTC- 3′,下游引物 5′-GTCAAAGTCTTCTCCACCCA- 3′；根據非洲爪蟾、灰樹蛙(Hylaversicolor)、日本樹蛙(Buergeriajaponica)的 β-actin 序列設計上游引物 5′-TGGAGAAGATCTGGCATCAC- 3′,下游引物 5′-TCATGAGGTAGTCTGTCAGG- 3′,PCR 反應程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,56 ℃ 退火 30 s,72 ℃ 30 s,共 30 循環；72 ℃ 延伸 10 min。PCR 產物電泳并測定 HSP70 和 β-actin 積分光密度比值。

1.6 數理統計與分析

采用 SPSS 17.0 統計軟件包進行數據統計分析。對免疫、抗氧化和 Hsp70mRNA 表達等相關指標進行 Kolmogorov-Smirnov 正態分布檢驗,符合正態分布進行單因素方差分析(One-Way ANOVA),組內差異利用最小差異法(Least Significant Difference, LSD)檢驗；同一取樣期對照組和處理組間差異采用獨立樣本t檢驗(Independent-sample T-test)分析；數據以平均值±標準誤(Mean±S E)表示,顯著水平均為 0.05。

2 結果

2.1 免疫指標

冷暴露(4 h 和 12 h)顯著抑制了棘胸蛙外周血細胞吞噬活性(P<0.05)(圖1)和脾巨噬細胞呼吸爆發強度(P<0.05)(圖1),而胃溶菌酶活力在冷暴露 12 h 后才出現顯著下降(P<0.05),并明顯低于對照組(P<0.05)(圖1)。當返回到 22 ℃ 環境后 12 h,3種免疫指標均恢復到初始和對照組水平(P>0.05)。經過 7 d 的反復冷暴露,外周血細胞吞噬活性和脾巨噬細胞呼吸爆發強度均回升到了初始和對照組水平(P>0.05),但胃溶菌酶活力無法恢復到初始和對照組水平(P<0.05)。

圖1 冷暴露和恢復對棘胸蛙外周血吞噬活性、脾臟呼吸爆發強度及胃溶菌酶活力的影響Fig.1 The effect of cold exposure and recovery on peripheral blood phagocytic activity, splenic respiratory burst and gastric lysozyme activity in the giant spiny frog (Q. spinosa)數據以Mean±S E表示(n=5—6)；* 表示同一時間對照組與處理組間差異顯著(P<0.05)；不同英文字母表示處理組內不同處理時間差異顯著(P<0.05)

2.2 氧化還原狀態指標

經過 4 h 的冷暴露后,棘胸蛙肝組織內 MDA 含量顯著升高(P<0.05),但 12 h 后 MDA 含量則降至初始和對照組水平(P>0.05)(圖2)。肝臟 SOD 活力和 GSH 含量隨冷暴露時間的延長而逐漸升高(圖2),并顯著高于對照組(P<0.05)；當轉入 22 ℃ 環境后 12 h,SOD 活力仍保持較高活力,但 GSH 含量則恢復到初始和對照組水平(P>0.05)。經過反復冷暴露后的第7天,雖然肝臟 SOD 活力和 GSH 含量一直保持較高水平,但是在冷暴露第12小時 肝組織內 MDA 含量仍高于對照組(P<0.05),隨后在 22 ℃ 環境下 12 h 后又恢復至初始和對照組水平(P>0.05)。

腎臟組織 MDA 含量升高的幅度要明顯大于肝臟(圖2),且處理組在第1天 和第7天 的各個時間點的 MDA 含量均顯著高于初始和對照組水平(P<0.05)(圖2)。與肝臟類似,腎臟 SOD 活力隨冷暴露時間逐漸升高,當轉入 22 ℃ 環境后 12 h 活力最高(P<0.05)；經過反復冷暴露后,在低溫下第12小時 略有升高(P<0.05),但返回到 22 ℃ 后 12 h 又降至初始和對照組水平(P>0.05)(圖2)。但腎臟 GSH 含量在各個階段與對照組間均無統計差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 冷暴露和恢復對棘胸蛙組織MDA含量、SOD活力及GSH含量的影響Fig.2 The effect of cold exposure and recovery on tissue MDA content, SOD activity and GSH content of the giant spiny frog (Q. spinosa)

2.3 肝臟 Hsp70 mRNA 表達

肝臟 Hsp70 mRNA 表達量在低溫下受到了顯著抑制(P<0.05),轉入 22 ℃ 環境下 12 h 后表達量雖有所增加(P>0.05),但未能恢復到初始水平(P<0.05)。經過反復冷暴露后, Hsp70 mRNA 表達依然受到顯著抑制(P<0.05)(圖3)。

圖3 冷暴露和恢復對棘胸蛙肝臟Hsp70mRNA相對表達量的影響Fig.3 The effect of cold exposure and recovery on relative Hsp70 mRNA expression in liver of the giant spiny frog (Q. spinosa)

3 討論

3.1 免疫功能

蛙類血液和免疫器官內含有大量的吞噬細胞。嗜中性粒細胞是外周血中最主要的吞噬性白細胞,而巨噬細胞是脾臟內最主要的吞噬細胞,該細胞會消耗大量氧氣并產生 ROS 來消滅吞入胞內的病原生物,這一過程稱為呼吸爆發,其反應強度可反映出機體的免疫狀態。這些吞噬細胞的吞噬活性一方面表現出溫度依賴性,另一方面在低溫馴化下可能產生適應性改變。林蛙(Ranatemporaria)外周血吞噬活性隨環境溫度的下降而降低,當溫度降至 5 ℃ 時白細胞的數量顯著減少[25]。豹蛙(Ranapipiens)在 2 ℃ 低溫下6h后外周血細胞吞噬活性和脾巨噬細胞呼吸爆發強度均顯著下降[26]。虎紋蛙(Hoplobatrachusrugulosus)經急性低溫(2 ℃, 6 h)處理后其外周血細胞吞噬活性和脾巨噬細胞呼吸爆發強度也均受到顯著抑制[27]。上述結果與本研究相一致,而且棘胸蛙在 22 ℃ 環境下恢復 12 h 后外周血細胞吞噬活性和脾巨噬細胞呼吸爆發強均恢復到對照組水平,但胞外酶溶菌酶活力無法得到恢復,同樣說明這些細胞免疫的溫度依賴性。低溫導致的免疫抑制可能是由于溫度改變了免疫細胞膜的流動性和穩定性以及 ROS 的產生,從而影響到吞噬功能的發揮；還可能是因為低溫通過激活 HPA 引起促腎上腺激素(ACTH)升高,進而促進 GC(如魚類為皮質醇,而兩棲類為皮質酮)的大量分泌[10-11],而 GC 是體內重要的免疫抑制劑。如將鯉魚(Cyprinuscarpio)從 20 ℃ 迅速移至 12 ℃ 水環境 2 h 后血清皮質酮含量明顯增加[5]。又如在金頭鯛(Sparusaurata)白細胞的培養基中加入皮質醇可以明顯抑制其呼吸爆發和吞噬活性[12]。然而,魚類和兩棲類等變溫脊椎動物吞噬細胞的免疫功能在長期低溫馴化條件下會得到恢復甚至強化。如林蛙在持續低溫(5 ℃)下白細胞可以更迅速地達到活性峰值[25]。本研究發現棘胸蛙血液和脾臟內吞噬細胞經過連續 7 d 的反復冷暴露同樣可以恢復到初始和對照組水平。類似地,法國火蠑螈(Salamandrasalamandra)和蟾蜍(Bufobufo)在經低溫(5 ℃)馴化后其巨噬細胞的內吞作用要比暖馴化個體更加有效[28]。對魚類的研究也有較多類似的報道[29-30]。值得注意的是,虹鱒[31]和紅大馬哈魚(Oncorhynchusnerka)[33]在低溫下加強了吞噬細胞活性,但免疫細胞的總量并未發生顯著變化,只是頭腎中具有免疫活性的細胞進入體液循環,從而增加了吞噬細胞的數量和總吞噬活力。然而,豹蛙經低溫馴化后其血液內嗜中性粒細胞的比例升高,鏡檢發現這些細胞多為單葉核或雙葉核,從而推測這些嗜中性粒細胞是在低溫適應中新近形成的[26]。因此,變溫脊椎動物吞噬細胞的低溫適應機制可能存在較大的物種差異,值得深入研究。

3.2 氧化還原狀態

非應激狀態下棘胸蛙肝臟 MDA 平均含量要高于腎臟,但初次低溫脅迫后肝臟 MDA 含量上升的幅度卻小于腎臟,且在第12小時 降至初始和對照組水平,這說明肝臟比腎臟能更快地緩解氧化壓力,這可能與肝臟 SOD 活力和 GSH 含量升高有關,而腎臟僅 SOD 活力有所升高。與此不同的是,虎紋蛙在低溫(2 ℃)下處理 6 h 后,肝臟和腎臟 MDA 含量并未出現明顯變化,SOD 活力僅在肝臟中有小幅升高,GSH 在肝臟和腎臟中濃度卻同時出現了應激性升高[27]。在魚類中,北海鱈(Zoarcesvivparus)在遭受急性低溫脅迫后肝臟 SOD 活性沒有明顯變化,只有 GSH 含量顯著增加[33]。這暗示 GSH 是非酶類抗氧化物質,其抗氧化作用在低溫下比酶類抗氧化物可能更具優勢或更為重要。此外,蛙經低溫馴化后轉入高溫環境后,隨著體溫的回升,有氧呼吸代謝逐步加強同樣可以導致氧化壓力的增加。在本研究中,在 22 ℃ 環境下恢復 12 h 后肝臟可以有效減少 MDA 含量,但腎臟無法降低 MDA 含量,這可能與腎臟無法增加 SOD 活力和 GSH 含量有關。Bagnyukova 等[34]測定了經長期低溫馴化(5 ℃, 2 個月)后的湖蛙(Ranaridibunda)在溫度迅速回升過程中機體的氧化壓力,發現溫度回升(20 ℃, 1 h 和 24 h)雖然對肝臟 MDA 含量無顯著影響,但可導致羰基蛋白(CP)(可反映蛋白氧化損傷程度)含量的增加,而對腎臟 MDA 和 CP 含量則全無顯著影響,說明腎臟的抗氧化能力要強于肝臟,進一步分析發現湖蛙肝臟 SOD 和谷胱甘肽還原酶(GR)活力在第24小時 均顯著升高,而腎臟過氧化氫酶(CAT)和 GR 活力顯著升高。因此,酶類和非酶類抗氧化物在不同器官內對溫度變化的反應存在物種差異,這直接反映了魚類和兩棲類等變溫脊椎動物在應對溫度極端變化過程中的氧化防御能力。

3.3 應激蛋白 HSP70

HSP70 是一類最保守、分布最廣泛的熱休克蛋白家族,作為應激保護性蛋白可提高細胞對氧化損傷的耐受程度,而且在降低炎癥反應、協助抗原遞呈等方面具有重要作用[35]。對雙團棘胸蛙(Paayunnanensis)的研究表明,在低溫 15 ℃ 處理 9 h 后肝臟 Hsp70 表達量顯著增加[36]。然而,在本研究中棘胸蛙肝臟 Hsp70 mRNA 的表達在低溫下不僅沒有出現應激性升高,還受到了強烈抑制。這可能是因為 4 ℃ 低溫已經超出了棘胸蛙體內 Hsp70 mRNA 表達可以響應的溫度范圍,所以推測 HSP70 在此低溫下所發揮的應激保護和免疫調節作用的溫度范圍有限。

綜上所述,棘胸蛙遭遇首次急性冷暴露后非特異性免疫功能受到明顯的抑制,同時機體內的氧化水平明顯增加,但經歷反復應激后外周血細胞和脾臟吞噬功能產生了適應性升高,而且不同器官內抗氧化能力也存在不同程度的升高。然而,HSP70 作為應激性蛋白,該基因在整個冷暴露過程中不但始終沒有出現高表達,而且被顯著抑制,因此推測 HSP70 在此低溫下無法起到相應的應激保護作用。

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Stress response and adaptive tolerance of the giant spiny frog (Quasipaaspinosa) to repeated acute cold exposure

XIE Zhigang1,2,*, WANG Yongpeng1, WANG Na1, ZHENG Rongquan1,2

1ZhejiangProvincialkeyLaboratoryofWildlifeBiotechnologyandProtectiveUtilization,CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China2XingzhiCollege,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China

To explore physiological stress response and adaptive tolerance of a stream-dwelling anuran, the giant spiny frog (Quasipaaspinosa), to extreme changes in environmental temperature, we investigated how repeated acute cold (4℃) exposure affects non-special immune responses, redox state, and heat shock protein 70 (Hsp70) mRNA expression. Acute cold exposure inhibited peripheral blood phagocytic activity (after 4 h or 12 h,P<0.05), respiratory bursts of spleen macrophages (after 4 h or 12 h,P<0.05), and gastric lysozyme activity (after 12 h,P<0.05). All immune responses increased to initial and control levels (P>0.05) after the frogs were moved back to 22℃ for 12h. Both blood phagocytic activity and spleen respiratory bursts recovered to initial and control levels (P>0.05) after 7 days of cold exposure. Acute cold stress increased hepatic and renal lipid peroxidation product malondialdehyde (MDA) content, but the degree of increase in MDA in the kidney was obviously larger than that in the liver. Hepatic superoxide dismutase (SOD) activity and glutathione (GSH) content showed acute and adaptive increases (P<0.05), while only SOD activity increased in the kidney, which suggested that anti-oxidative defense was stronger in the liver than in the kidney in this frog. The expression level of Hsp70 mRNA in liver was not acutely increased, while it was significantly inhibited (P< 0.05). In conclusion, some non-special immune functions and the hepatic oxidative defense system inQ.spinosacan adapt, to varying extents, to repeated acute cold exposure.

Quasipaaspinosa; cold exposure; immunity; antioxidative defense; Hsp70

國家自然科學基金資助項目(30800129, 31270457)

2016- 03- 29; 網絡出版日期:2017- 03- 02

10.5846/stxb201603290570

*通訊作者Corresponding author.E-mail: xiezhigang@zjnu.cn

頡志剛,王永鵬,王娜,鄭榮泉.棘胸蛙(Quasipaaspinosa)對重復急性冷暴露的生理應激與適應耐受.生態學報,2017,37(14):4778- 4785.

Xie Z G, Wang Y P, Wang N, Zheng R Q.Stress response and adaptive tolerance of the giant spiny frog (Quasipaaspinosa) to repeated acute cold exposure.Acta Ecologica Sinica,2017,37(14):4778- 4785.