外源ABA對匍枝筋骨草懸浮細胞內源激素及蛻皮甾酮的影響

楊月月+遲德富+宇佳

摘 要 通過分別向匍枝筋骨草懸浮培養體系中添加不同濃度的脫落酸（ABA）并測定添加后不同時間懸浮細胞的生長狀況和生物量，以及蛻皮甾酮（20E）和ABA的濃度變化，篩選出最適宜添加濃度.通過測定懸浮細胞內玉米素（ZR）、赤霉素3（GA3）和吲哚乙酸（IAA）及20E的含量變化，探討ABA對匍枝筋骨草懸浮細胞生長的影響.結果表明，添加0.15 mg·L-1 ABA后細胞生長速度減緩，但在未褐化期ABA促進20E的累積，在第48 h和72 h懸浮細胞中20E含量顯著地高于對照組，但在第96 h懸浮細胞出現褐化現象，20E含量下降極顯著地低于對照組；向匍枝筋骨草懸浮體系中加入外源ABA，懸浮細胞內ABA含量呈上升趨勢，ZR，GA3，IAA含量呈相對下降趨勢；在相同條件下添加ABA抑制劑（Na2WO4），則ABA，ZR，GA3和IAA的變化趨勢與添加ABA相反，對20E的影響不顯著.

關鍵詞 匍枝筋骨草；脫落酸；脫落酸抑制劑；鎢酸鈉；內源激素；蛻皮甾酮（β-蛻皮甾酮）

中圖分類號 Q946；Q813文獻標識碼 A文章編號 1000-2537（2017）04-0026-08

Abstract The optimal concentration of abscisic acid （ABA） was evaluated in this work by adding different concentrations of ABA into the suspension cell cultures system of Ajuga lobata D. Don. The growing status， biomass of suspension cultures cell， concentration of ecdysterone （20E） were measured after adding those substances. Upon the selection of optimal concentration， 0.15 mg·L-1ABA was added into Ajuga lobata D.Don suspension cell culture system， then changes of endogenous phytohormones， such as zeatin（ZR）， gibberellin 3（GA3）， Hetero auxin（IAA） and 20E content were determined with HPLC， and the impact of ABA on plant endogenous hormone content and 20E synthesis in suspension cultures cell of Ajuga lobata D. Don were analyzed. Adding ABA in the suspension cell culture system， we found that the growing speed of suspension cell was decreased， but without browning， ABA promoted the accumulation of 20E. At 48 h and 72 h after the addition of ABA， the content of 20E was significantly higher than that in the control group， and at 96 h after its addition， those treated with suspension cells became browning， and the dry weight of those cells was significantly lower than that of the control group. The content of endogenous ZR， GA3 and IAA in the treated suspension cell was also decreased. After the addition of Na2WO4 into the suspension cell culture system， the change trend of ABA， ZR， GA3 and IAA was opposite to that of adding ABA， and their range of 20E concentration change never reached to the significant difference level as compared with that of the control group.

Key words Ajuga lobata D.Don； abscisic acid （ABA）； ABA inhibitors； Na2WO4； endogenous hormone； ecdysterone （20E，20-hydroxyecdysone）

匍枝筋骨草（Ajuga lobata D. Don）屬唇形目（Lamiales）唇形科（Lamiaceae）筋骨草屬（Ajuga），一年或二年生草本植物[1-2]，具有清熱解毒、涼血平肝的藥用作用[3-4].匍枝筋骨草富含蛻皮甾酮（20E），屬于萜類化合物，通過類異戊二烯生物合成途徑合成[5-6].20E有促進膠元蛋白合成、抗心律不齊、抗疲勞的作用，降膽固醇、血脂、血糖，治療心肌缺血，股骨頭壞死等，也是一種天然的抗癌制劑[7].化妝品中也有應用，具有增強細胞新陳代謝及活化、去斑增白作用[8].在昆蟲防治方面，由于植物中的蛻皮甾酮與昆蟲體內的蛻皮激素結構類似，具有影響昆蟲蛻皮和生長發育的作用，制成植物源殺蟲劑和生長調節劑，是對環境無毒無害的生物類農藥[9].

脫落酸（abscisic acid，ABA）是一種調節植物生長發育的植物激素[10]，有“逆境激素”之稱.逆境條件會引起植物體內的ABA含量增加，添加外源ABA同樣可誘導植株發生信號傳遞啟動防御系統，抵御外界脅迫[11-12].除此之外，ABA可促使植物中酚類、酮類等次生代謝產物的增加[13-16].鎢酸鈉（Na2WO4）為ABA合成抑制劑，能抑制ABA合成過程中的ABA醛氧化酶（ABA-aldehydeoxidase），使ABA醛不能轉化為ABA，從而抑制植物內源ABA的合成[17].吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）和細胞分裂素（ZR）都是生長類激素，組織培養過程中添加適當濃度的生長類激素可促進植物細胞的分裂、生長和次生代謝產物的積累，其原因是生長類激素促進細胞生長及分裂，影響其代謝，從而次生代謝產物含量上升[18-20].ABA是一種較強的生長抑制劑，其對生長的作用與IAA，GA3和ZR三者相反，它對細胞的分裂與生長起抑制作用[21-24]，卻同樣可以提高次生代謝產物含量，但原因和機制不明.

本研究通過在匍枝筋骨草懸浮培養體系中添加ABA或處理，分析ABA對懸浮細胞的各種內源激素和20E含量的影響，探討ABA和Na2WO4誘導懸浮細胞中內源激素變化與20E合成存在的關系，為ABA誘導蛻皮激素合成的機制研究奠定基礎，也可為利用細胞培養大規模生產植物20E提供一定的理論依據和技術支持.

1 試驗與方法

1.1 材料

愈傷組織由匍枝筋骨草葉片誘導形成，再經懸浮培養得到懸浮細胞.

三重四極桿液質聯用儀（Waters 公司），C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm粒度，Waters 公司）；GA3，IAA，ZR，ABA標準品（Sigma公司）；蛻皮激素標品由上海中醫大學提供.

1.2 方法

1.2.1 懸浮細胞的培養 采用趙曉杰等[25]方法，將筋骨草在固體培養基（MS+2，4-D 0.4 mg/L）上誘導成愈傷組織，然后將愈傷組織在無菌條件下接種到未添加瓊脂的液體培養基內（MS+2，4-D 0.4 mg/L）懸浮培養，接種量為10%（即每50 mL培養基中接種筋骨草細胞鮮質量5 g），pH調至6.0.每隔7 d進行一次繼代.本試驗使用繼代次數為4代的懸浮體系.培養條件：室內光照培養，溫度為25 ℃，光/暗周期：16 h/8 h，光照強度2 000 lux，濕度為70%.搖床速度：110～120 r/min.

1.2.2 生物量的測定 將細胞懸浮液經48 μm細胞篩過濾，將濾出的細胞用濾紙吸干多余水分，60 ℃烘干12 h至恒重后，稱量得到細胞干質量.每個試驗組取5個平行樣品，取其結果計算平均值及標準差.

1.2.3 蛻皮甾酮含量測定 蛻皮甾酮（20E）的提取：取干質量0.2 g，色譜純甲醇5 mL浸泡24 h，超聲1 h后進行微波消解（WT-8000，消解條件T：50 ℃，P：2P0，t：10 min，W：300×2）.有機過濾膜過濾后，濾液直接用于HPLC檢測.每12 h取樣，每試驗組取5個平行樣品.蛻皮甾酮液相圖譜如圖1所示.

20E的檢測條件：20E檢測色譜柱（C18）；紫外可見光檢測波長范圍190～800 nm；檢測波長242 nm；流動相V（甲醛）∶V（水）=1∶1；流動相速度0.8 mL/min，進樣量10 μL.每個樣品重復檢測3次.

標準曲線的繪制：配置濃度為0.8，0.4，0.2，0.1，0.05 g/L的蛻皮甾酮（20E）標準品溶液，檢測方法同上.以峰面積的平均值為縱坐標，質量濃度為橫坐標，得β-蛻皮甾酮回歸方程為：y=18 498x+226.2，相關系數為0.999. 根據液相色譜檢測試樣20E相應峰面積，由標準曲線回歸方程求出β-蛻皮甾酮含量.

1.2.4 內源激素含量測定 內源激素的提取：每試驗組取5個平行樣品.稱取樣品1.0 g于研缽中，加入10 mL -20 ℃過夜的80%甲醇水溶液，研磨成漿，轉入PP管中密封，4 ℃冷浸過夜.離心得上清液，殘渣加入5～8 mL 80%甲醇水溶液，冷浸2 h后離心得上清液，合并兩份清液，室溫以水泵旋蒸除去大部分甲醇，加入15 mL正己烷脫色3次，棄有機相，再換油泵將剩余溶劑旋干.加入pH 3.5的甲酸溶液2 mL，過C18 SPE柱，甲醇洗脫，收集液旋干，以移液器加入2.0 mL流動相（含0.1%甲酸），經濾膜過濾后測試.每個樣品重復檢測3次.

內源激素的檢測：參考鐘冬蓮等方法[26-27].色譜條件，流動相V（乙腈）∶V（水）=3∶7；流速：0.2 mL/min；進樣量：2.0 μL；色譜柱溫度：35 ℃.質譜條件采用全掃描圖譜，選擇離子定量進行分析.離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子方式檢測； 離子噴射電壓：5.5 kV；溫度：300 ℃；源內氣體：N2，壓力：379 kPa；氣簾氣體（N2）壓力：69 kPa；掃描方式為多重反應監測（MRM）；碰撞氣（N2）壓力：Medium.內激素質譜圖見圖2.

標準曲線的繪制：分別配置濃度為0.8，0.4，0.2，0.1，0.05 g/L的ZR，GA3，IAA和ABA標準品溶液，以各內源激素對應峰面積的平均值為縱坐標，質量濃度為橫坐標，得內源激素回歸方程（見表1）.根據質譜檢測的試樣ZR，GA3，IAA和ABA相應峰面積，由標準曲線回歸方程求出內源激素含量.

1.2.5 ABA及ABA抑制劑最佳濃度的篩選 按照方法1.2.1的條件培養7 d，分別向懸浮體系中添加0.05，0.10，0.15，0.20 mg/L ABA 后每24 h進行取樣，每個處理取3個平行樣，按照1.2.3方法檢測試樣的20E含量，根據標準曲線回歸方程求出β-蛻皮甾酮含量.β-蛻皮甾酮含量最高的處理組為最佳ABA添加濃度.

同樣條件培養7 d，分別向懸浮體系中添加0.50，0.75，1.00，1.25 mg/L Na2WO4，每24 h取樣，每個處理取3個平行樣，按照1.2.4方法檢測試樣ZR，GA3，IAA和ABA含量，根據液相色譜檢測的相應峰面積，由標準曲線回歸方程求出內源激素含量.

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0軟件對所測數據統計分析，用平均值和標準誤差表示測定結果，分別對ABA處理及Na2WO4處理結果進行單因素方差分析.采用Excel 2010繪圖.

2 結果

2.1 ABA及ABA抑制劑對匍枝筋骨草懸浮細胞生長影響及最佳濃度的篩選

2.1.1 ABA對匍枝筋骨草懸浮細胞生長影響 根據前期預實驗探究，設定 0.05，0.10，0.15，0.20 mg/L不同梯度ABA，向匍枝筋骨草懸浮體系中添加不同濃度ABA后，前72 h生長狀況較為良好，懸浮培養體系為淡黃色，組織均一松散.第96 h懸浮培養的細胞出現褐化，懸浮培養體系為紅褐色.生長狀況如圖3（彩圖見封三）所示.

添加ABA后，細胞生物量增長速度與對照組相比較緩慢，添加的ABA濃度越高，其細胞生物量增長速度越緩慢（圖4）.添加0.05和0.10 mg/L的ABA與對照差異不顯著.添加0.15 mg/L ABA的第96 h與對照差異顯著（p<0.05）， 添加0.20 mg/L ABA第48 h及第96 h時細胞干重與對照組差異顯著（p<0.05）.

計算出懸浮體系中蛻皮激素的總含量（細胞干質量×單位量中蛻皮激素含量），做進一步篩選試驗，蛻皮激素含量變化如圖5所示.添加0.05 mg/L ABA組中蛻皮激素含量變化與對照差異不顯著；添加0.10 mg/L ABA組在第48 h蛻皮激素含量高于對照組，與對照差異顯著（p<0.05）；添加0.15 mg/L ABA組中蛻皮激素含量在第48 h與72 h與對照差異顯著，分別高于對照組28.73%（p<0.01）和18.73%（p<0.05）.第96 h細胞褐化，蛻皮激素含量較第72 h低但高于對照組；0.20 mg/L ABA處理組蛻皮激素含量呈先上升后下降趨勢，分別第96 h低于對照組且差異顯著（p<0.05）.因此選出最佳ABA添加濃度為0.15 mg/L.

2.1.2 ABA抑制劑對匍枝筋骨草懸浮細胞生長影響及最佳濃度的篩選 添加不同濃度Na2WO4后ABA含量變化如圖6所示，添加0.50，0.75，1.00 mg/L Na2WO4后細胞干質量有所上升，添加1.25 mg/L Na2WO4后細胞干質量呈下降趨勢，在第72 h與第96 h與對照差異顯著.

添加不同濃度Na2WO4后ABA含量下降，變化如圖7所示.經0.50 mg/L Na2WO4處理后細胞中ABA含量與對照差異不顯著，0.75 mg/L Na2WO4處理后的第72 h與第96 h與對照差異顯著（p<0.05）.經1.00 mg/L Na2WO4處理后的第48 h與對照差異顯著（p<0.05），第72 h與第96 h與對照差異極顯著（p<0.01）.經1.25 mg/L Na2WO4處理后細胞內ABA含量與對照差異極顯著.但是，在0.50，0.75及1.00 mg/L Na2WO4等3種濃度處理后的24，48和72 h，匍枝筋骨草懸浮細胞的生長均未表現出明顯的不正常狀況，而在1.25 mg/L Na2WO4處理后的72 h和第96 h，懸浮細胞生長量明顯下降.因此認為1.00 mg/L為向匍枝筋骨草懸浮培養體系中添加Na2WO4的最適濃度.

2.2 外源ABA及ABA抑制劑對細胞內激素影響

2.2.1 外源ABA及ABA抑制劑對ZR含量影響 如圖8，向懸浮培養體系中添加0.15 mg/L外源ABA后，懸浮細胞內ZR含量呈下降趨勢，到第72 h和第96 h，ZR的含量與對照相比差異極顯著，低于對照組27.25%（p<0.01）和30.10%（p<0.01）.向懸浮培養體系中添加1.00 mg/L Na2WO4后24～72 h，懸浮細胞中ZR含量與同期對照相比略有上升，但是上升幅度未達到差異顯著的水平.而到了第96 h，懸浮細胞中的ZR含量高于對照組12.23%（p<0.05），差異顯著.

2.2.2 外源ABA及ABA抑制劑對GA3含量的影響 如圖9，向懸浮培養體系中添加0.15 mg/L外源ABA后，懸浮細胞內GA3含量呈下降趨勢.添加后的第48 h，懸浮細胞內GA3的下降幅度與同期對照相比差異顯著.到第72 h和第96 h，GA3的下降幅度進一步加大，分別低于對照組34.91%（p<0.01）和34.45%（p<0.01），均與其同期對照相比差異極顯著.向懸浮系統添加1.00 mg/L Na2WO4后的第24 h，懸浮細胞內GA3含量呈上升趨勢，在添加后的72 h和96 h，懸浮細胞內GA3含量均與同期對照相比極顯著上升（p<0.01）.

2.2.3 外源ABA及ABA抑制劑對IAA含量的影響 如圖10，向懸浮培養體系中添加0.15 mg/L外源ABA后，懸浮細胞內IAA含量呈下降趨勢.在添加后的第24，48，72 h，IAA的下降水平與同期對照相比差異顯著（p<0.01）；第96 h IAA的水平與同期對照相比差異極顯著.添加1 mg/L Na2WO4后細胞內IAA含量上升，第48 h與對照差異顯著（p<0.05），第72 h和96 h IAA含量均與同期對照相比上升極顯著（p<0.01）.

2.2.4 外源ABA及ABA抑制劑對ABA含量的影響 如圖11，向懸浮培養體系中添加0.15 mg/L外源ABA后的第24 h和第48 h，細胞內的ABA含量與同期對照相比呈現了小幅上升的狀態，但上升幅度未達到差異顯著的程度；在添加后的第72 h和第96 h，細胞內的ABA含量繼續上升，分別比同期對照提高46.29%（p<0.01）和49. 61%（p<0.01），并且均達到差異極顯著水平.向懸浮培養體系中添加1 mg/L Na2WO4后，懸浮細胞內ABA含量一直呈下降趨勢.在添加后的第24 h，ABA含量比同期對照略有下降，但未達到差異顯著水平.到第48 h，ABA含量比同期對照下降了24.90%（p<0.05），處于差異顯著狀態；在添加后的第72 h和第96 h，ABA含量分別比同期對照下降了44.61%（p<0.01）和52.24%（p<0.01），均處于極顯著下降狀態.

2.3 外源ABA及ABA抑制劑對蛻皮甾酮含量的影響

在懸浮培養體系中添加0.15 mg/L外源ABA和1 mg/L Na2WO4后，20E含量變化如圖12所示.添加外源ABA后24 h，匍枝筋骨草懸浮細胞中20E含量略有上升，但與同期對照相比，未達到差異顯著水平；在添加后的48 h，懸浮細胞中20E含量極顯著地高于同期對照的水平（p<0.01）；第72 h，20E含量顯著地高于同期對照（p<0.05）；第96 h細胞褐化死亡，20E含量極顯著地低于同期對照組的水平（p<0.01）.向懸浮培養體系中添加Na2WO4后，20E含量在第24，48，72或96 h分別出現了與同期對照相比略微升高或略微下降的波動，但是這種波動始終未達到差異顯著的水平.

3 討論

3.1 外源ABA及ABA抑制劑對細胞內激素影響

本試驗添加外源ABA后，ZR，IAA和GA3含量下降，而ABA含量升高.該現象與其他外施ABA的實驗結果非常相似，如研究發現在盆栽煙草（Nicotiana tabacum L.）的葉片上噴施ABA后，抑制了煙草葉片中內源激素IAA 與GA3的合成[21].在3年生紫花苜蓿（Medicago sativa）的植株上噴施ABA后，其頂芽和第一展開葉中ABA 含量均隨外源ABA 噴施濃度水平的提高而增加，IAA和GA3 含量則表現出與ABA 相反的遞減趨勢[22].ABA處理柱花草的結果表明，ABA處理植株的ABA含量升高，IAA，GA1+3和iPAs的含量降低[23].其原因是植物激素具有相互調節功能，ABA的含量增多對生長類激素產生抑制作用[28].

添加ABA抑制劑Na2WO4后，ABA含量大幅度下降，ZR，GA3和IAA含量小幅度上升.其原因是，Na2WO4抑制了ABA合成過程中的ABA醛氧化酶，使ABA醛不能轉化為ABA[17]，因而抑制懸浮細胞內ABA的生物合成，降低了細胞中的ABA含量，也增強了細胞進一步分裂和生長的勢頭，所以出現了ZR，GA3和IAA含量上升的現象.本研究的現象與周碧燕等的研究結果相似，以ABA 合成抑制劑Na2WO4處理柱花草，ABA含量降低，IAA，GA1+3和iPAs 的含量升高[23].本試驗添加Na2WO4后懸浮細胞內ABA，ZR，GA3和IAA的變化規律，進一步說明了內源ABA對其他內源激素的影響，及細胞中各種內源激素協調平衡.

匍枝筋骨草懸浮細胞褐化的現象也與內激素的變化有關，玉米素ZR是細胞分裂素，可促進細胞分裂并使細胞體積擴大；生長素IAA通過細胞核的分裂來進行組織的生長；赤霉素GA3則通過縮短細胞分裂周期的G1期和S期來加速細胞分裂[28-29].在添加了外源ABA后，此時用于縮短分裂周期、促進細胞核分裂、刺激細胞分裂的相應激素含量降低，細胞的生長發育變緩，促使懸浮細胞提前進入到衰老及死亡進程[29].

3.2 外源ABA及ABA抑制劑對蛻皮甾酮含量的影響

蛻皮甾酮（20E）是甾酮類化合物，是匍枝筋骨草次生代謝產物.以往研究表明組織培養過程中添加適當濃度的生長類激素可促進植物細胞的生長和次生代謝產物的積累，其原因是生長類激素促進細胞生長及分裂，影響其代謝，從而次生代謝產物含量上升[18-20].ABA是生長抑制劑，但也有增加植物次生代謝產物的作用，可以誘導綠原酸、酚類、黃酮類和萜類物質的增加，其原因與ABA的脅迫作用介導植物啟動防御系統引起植物應激反應從而導致次生代謝產物增加有關[30].文獻研究也有同樣的發現，丹參酮與匍枝筋骨草的20E同是萜類物質，都是通過MVA途徑和DOXP/MEP途徑等2條支路完成合成[31].研究表明，ABA可提高丹參酮含量[16，31]，外源添加200 μmol/L ABA到丹參發根培養體系中，誘發 H2O2和O-2的迸發，同時發現外源ABA提升了丹參酮合成中的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）基因的表達量和酶的活性，從而促進丹參酮的積累[31]，產生該現象的原因與上述表達的植物應激反應有關[32].在本試驗中發現添加ABA后細胞生長激素GA3，ZR和IAA含量下降，但可增加20E含量，可以說明ABA誘導20E含量增加與生長素類激素加快細胞生長及分裂而引起的次生代謝產物增加的作用無關，而是ABA介導植物啟動防御系統引發的結果，且在以往的實驗中已驗證ABA可以促使匍枝筋骨草的防御系統啟動[33].但是ABA如何調控信號因子、影響次生代謝產物通路的機理，還需要通過代謝組學及基因組學進一步加以研究.

到目前為止沒有檢索到添加ABA抑制劑Na2WO4后，如何影響植物萜類含量變化的相關研究.本研究也只是發現，盡管在匍枝筋骨草懸浮培養體系中添加Na2WO4后，出現了ZR，GA3和IAA含量上升及ABA含量下降的現象.但是在添加后24～96 h懸浮細胞中20E的含量與同期對照相比出現了小幅波動，而且波動過程始終未達到顯著差異的水平，說明由于ABA含量下降導致其他生長類激素含量上升，但未達到促進匍枝筋骨草蛻皮激素積累的程度，影響作用不大.其原因尚需要從添加Na2WO4后對懸浮細胞合成20E相關的各種激素水平、關鍵前體物質的濃度、多種酶的活性等方面加以深入地研究.

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