基于蛋白信號轉導網絡的組分中藥研究方法學＊

陳文星，王旭，王愛云，陸茵＊＊

基于蛋白信號轉導網絡的組分中藥研究方法學＊

陳文星1,2，王旭1,2，王愛云1,2，陸茵1,2＊＊

（1.南京中醫藥大學藥學院南京210023；2.江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室南京210023）

組分中藥已被認為是中藥復方用藥的一個重要發展方向，但其方法學研究還處于創新階段。現代醫學認為導致疾病的因素多種多樣，指示疾病的特征也是多樣化，因而治療疾病單從單一靶點入手有失偏頗，而針對多個靶點同時用藥成為現代醫學臨床的共識。本方法基于中醫證候的復雜性、蛋白信號轉導通路網絡的多靶點特性和中醫方劑組方原則，提出一種簡化的組分中藥的篩選研究方法。并結合腫瘤的中醫認識，以及現有中藥有效成分抗腫瘤的研究成果，詳細闡述該方法的具體運用。該方法可為中藥效應成分的有效利用及新藥發現拓展研究思路。

蛋白信號轉導網絡方劑組方原則組分中藥方法學

中藥現代化研究已經進入攻堅階段，由于技術手段、理論方法等的限制，中藥新活性成分的發現及中藥新藥的創制仍然沒有太多突破[1]。中藥研究在多個“五年計劃”的支持下已有了長足的進步與發展，大部分常用中藥當中的各類成分基本已經明確，且多數成分的藥理活性也已經被發現，但是這些具有藥理活性作用的中藥成分最終形成藥物的卻很少[1]。組分中藥的概念正是在這一背景下順勢而生。組分中藥是一種中藥復方創新模式[2，3]，它強調以中醫藥理論為基礎，通過化學和生物學的系統表征來篩選中藥有效單體成分的組合。它既是對傳統中藥的繼承，又是對傳統中藥的發展。但目前有關組分中藥如何組合的方法學研究還處于創新階段[4，5]。本文結合中醫基礎理論及現代網絡藥理學的研究思路對組合中藥的方法學研究進行探討。

1 網絡藥理學闡釋中藥作用方式的優勢及難點

隨著研究的深入，“一個藥物、一個靶標、一種疾病”的傳統新藥研發模式已經發生了轉變[6]。單成分、單靶點的藥物作用模式已經被臨床證實是存在局限性的，因為疾病的病因是多方面的，疾病的臨床表現形式也是多方面的，基于表現形式的指標觀測也是變化多樣的。因而學界逐漸形成了針對多靶點、應用多成分的作用模式來治療疾病的思路，與之相對應的就是網絡藥理學的誕生[7,8]。網絡藥理學趨向將疾病看成是多因素、多靶點的網絡調控綜合而成。現在基于網絡藥理學的研究正處于上升時期，如中藥復方的網絡藥理學研究[9]、基于計算機的網絡藥理學新藥研究靶標發現[10]、基于系統生物學的網絡靶標研究[11]等。現代研究對于中藥產生藥理作用的方式基本趨向一致：典型的多成分、多靶點、多途徑的作用方式。而這種方式剛好與網絡藥理學的模式吻合，這為中藥藥理的研究帶來了很好的機遇與優勢。

但網絡藥理學也存在明顯的復雜性，網絡藥理學是從系統生物學和生物網絡平衡的角度闡釋疾病的發生發展過程，從改善或恢復生物網絡平衡的整體觀角度認識藥物與機體的相互作用。結合系統生物學，網絡藥理學緊緊圍繞生物網絡的構建和分析，通過生物網絡的連接性、冗余性和多效性的分析揭示藥物的有效性、毒性和代謝特性，是建立在高通量組學數據分析、計算機虛擬計算及網絡數據庫檢索基礎上的研究策略。如果基于網絡藥理學這種復雜的理論體系，純粹從其理論體系出發來分析中藥多成分、多靶標、多節點的網絡調控模式給中藥研究帶來了一定的困難，基于網絡藥理學來篩選組合中藥也會困難重重。那么如果能將網絡藥理調控簡單化，但又能起到特征性的代表作用會給這方面的研究提高效率。

2 疾病、證候及蛋白信號轉導通路

從遺傳學上來看待生物中心法則，核酸始終是處于主導地位；而從疾病角度來看待生物中心法則，則蛋白質是最重要也是最直觀的決定因素。多數的疾病都有其對應的蛋白質分子標志物。同時，許多疾病的誘發因素多種多樣，導致疾病相關的蛋白分子也具有多樣性。而蛋白質的調控在本級層面也是屬于網絡調控，受到多分子的調節。因此，研究疾病網絡相對應的蛋白分子調控網絡對于闡釋疾病的成因、發展及治療非常重要[14]。從根本上說，正是由于疾病蛋白調控信號通路的網絡屬性才促成網絡藥理學的孕育而生。那么將復雜的網絡藥理學簡化成相對簡單的蛋白信號轉導通路來考慮也應該是可行的。

但是蛋白分子調控網絡中的各個節點分子既可以調控多個分子，同時也被多個分子所影響，各種分子之間的相互作用都會影響到周圍分子，這也給研究帶來了很多的不確定性。那么在復雜的調控網絡信號通路中，有沒有一些是占主導地位，而另外一些是次要一點的呢？中醫認為疾病證候均有主證及兼證之分，現代醫學也對疾病分主要指標及次要指標，即在中西醫系統中對疾病的看法均有主次之分。因而可將現代醫學認識的疾病根據主要指標和次要指標分別對應于主要疾病網絡和次要疾病網絡，而主次疾病網絡又可對應主次蛋白信號通路，最后將之與中醫的主證及兼證相對應，形成整個貫通中西醫的網絡對應圖，這就將錯綜復雜的疾病網絡簡化為疾病主網絡及旁網絡，然后再對應為主蛋白網絡信號轉導通路和旁信號通路。

3 中藥方劑組方原則及組分中藥

中藥方劑的應用是基于獨特的中國傳統醫學文化內涵和認識思想所創造出的。中藥方劑君、臣、佐、使的組方原則和中醫的治病理論是密切結合的，從而形成傳統的中醫藥理論。君藥為針對主證發揮治療作用的藥物，臣藥為輔助君藥治療主證的藥物，而佐藥為治療兼證或制約君藥偏性的藥物，使藥則多為引經或起調和作用的藥物。如何將這些理論與現代研究方法相結合并指導研究和臨床始終是一個值得我們思考的難題。

基于此，有學者提出組分中藥的概念，即以中醫藥理論為基礎，遵循中醫方劑組方原則，將中藥有效部位或單體有效成分進行配伍而成的復方制劑。組分中藥制劑既保留了中醫藥復方聯合用藥的傳統特點，又能很好的體現現代藥學的先進性。組分中藥是由結構清晰的中藥效應成分組成，因而易于建立定性和定量的質量控制標準，同時利于進行藥效、作用機制、藥物代謝動力學等研究[4，5]。

隨著現代醫學的發展，基于網絡藥理學特征的多靶點和多途徑的聯合治療模式在醫學中得到迅猛發展，這種模式與中藥方劑的用藥原則從現在看來是非常契合的[12,13]，而與組分中藥模式則是完全契合的。可以說，組分中藥與網絡藥理學雖然是基于不同的理論基礎提出的，但有異曲同工之妙。那么，如果將中藥方劑的組分中藥與網絡藥理學結合并演化出既有網絡藥理學特征（蛋白信號轉導網絡）又具備中醫藥理論基礎的一種針對效應的一種理論篩選方法，應該是對中醫藥理論研究的創新發展。

4 基于中醫理論和組方原則的組分中藥理論框架

基于以上的分析，提出該方法的理論框架：結合蛋白信號轉導網絡、中醫理論和中藥方劑的組方原則形成一個簡化的基于以上三方的藥物篩選理論模型（圖1）。首先根據中醫理論，疾病證侯可分為主證和兼證；而從現代疾病網絡上來看，也可以把疾病網絡分為主疾病網絡（主網絡）和旁疾病網絡（旁網絡），而主網絡對應主信號通路，旁網絡對應旁信號通路；因而，主證即對應主信號通路，兼證對應旁信號通路。這樣就將傳統的中醫疾病證候與現代醫學的疾病網絡及蛋白信號轉導通路大致聯接。其次根據中醫“君、臣、佐、使”的方劑組方原則，選擇相對于君藥的主成份作用主信號通路，相對于臣藥的次成分輔助君藥作用主信號通路，相對于佐藥的輔成分作用旁信號通路，相對于使藥的調和成分起到調和諸藥和降低毒性等作用。簡言之，即按照中藥方劑的組方原則并結合中醫的證侯理論，將多個分別針對不同蛋白信號通路的單成分組合在一起，發揮組方的優勢，針對疾病網絡，產生聯合作用（圖1）。該理論的兩個關鍵點是：①相對于證侯的疾病網絡及主、次信號通路的確定，該方面可首先確立與證候相關的疾病，通過系統檢索多個疾病生物學數據庫，收集與疾病發生、發展及治療緊密相關的靶點，再根據靶點確定蛋白信號轉導通路；②針對不同蛋白信號調節通路的單成分的選擇，針對已有的文獻報道及數據庫，確定某一成分作用的關鍵靶蛋白及其相關蛋白信號通路，并進行綜合優化選擇。

該理論的意義在于形成基于中藥方劑用藥原則和蛋白信號轉導網絡的活性組合物篩選新方法，同時形成獨特的證侯與蛋白信號通路對應相關理論，以及篩選出既符合中醫藥理論特色，又有現代臨床應用價值的活性成分組合。以下從具體實施方案展開討論。

圖1 基于中醫理論、方劑組方原則和蛋白信號轉導網絡的組合中藥篩選模式圖

5 基于上述組分中藥篩選方法進行抗腫瘤組合物研究

以抗腫瘤組合藥物研究為例對這一理論進行充分的展開闡述。中醫對于腫瘤的理論認識已經形成了較長時間，普遍的觀點認為腫瘤是熱毒郁積而成，或者是血瘀證所導致，或者是二者兼有[15]。因而治法通常采用清熱解毒、活血化瘀或二者兼用[15，16]。應用到本方法則可形成：如將熱毒做為主證，則將血瘀做為兼證；或者將血瘀做為主證，則熱毒做為兼證。熱毒治療用清熱解毒法，因此成分從清熱藥中選擇；血瘀證則選擇活血化瘀類中藥中的成分。還可以看到，目前研究較多的有明顯抗腫瘤活性的中藥單體成分大部分出自這兩類藥，因此該研究具有很好的研究基礎。在蛋白信號通路選擇上，選擇MAPK（絲裂原激活的蛋白激酶）通路[17]對應于熱毒證侯。現代醫學認為熱毒主要是指外源性的病原微生物包括腫瘤細胞，而清熱藥中絕大多數活性成分均能抑制微生物、細胞的增殖，而MAPK是主要的控制細胞增殖的蛋白信號通路。而對應于血瘀證侯的信號通路可選擇Wnt/catenin[18]。當然，前面我們也談到，相對應于證侯的信號通路選擇是該方法中的關鍵點，這應該是一個比較新的研究領域，沒有太多的經驗可以借鑒。因此對于這部分我們會采取多組合篩選的模式，即根據特點組合多條信號通路，然后用相應組分進行組合篩選，這也是本方法中的實驗重點。那么相對于細胞增殖的信號通路還可以選擇mTOR（哺乳動物雷帕霉素靶蛋白）[19]、細胞凋亡通路[20]、細胞周期通路[20]等；而針對血瘀證的信號通路還可以選擇血管生成通路[21]、酪氨酸激酶通路[21]等。對于使成分（使藥）的選擇可基于以下要點：中藥復方中使藥通常是藥性調和藥，如甘草。而甘草現在認為主要是其中的甘草次酸有雌激素樣作用[22]，起到中和作用，因此還可以選擇一些中藥的類雌激素類成分；當然還有一些使藥為引經藥，則可選擇相應引經藥味中的主要成分[23,24]；另外，使藥還可能是一類促進免疫功能的成分。使藥的作用不可或缺，實驗中主要根據其特點來選擇成分。表1為根據已有的中藥成分的抗腫瘤研究結果按照本文方法進行組合的實例。實際研究當中還會發現很多中藥成分對多條蛋白信號通路均有作用，組合時可分別考慮。

表1 基于蛋白信號轉導網絡的組分篩選組合實例

6 總結與展望

組分中藥既是中醫方劑思想的繼承，又能與網絡藥理學不謀而合。然而如果忽略中醫藥的基礎理論，或者沒有將中醫藥理論充分的與現代理論結合起來而單純的將中藥效應成分組合在一起是難于得到理想的結果的。本文方法在組分中藥的基礎之上，借用網絡藥理學中的蛋白信號轉導通路與中醫證候可能的對映關系，提出一種新的針對中藥已知活性成分的組分中藥篩選的探索方法，期望通過這種方法創制有明確活性且有臨床應用價值的中藥活性成分組合。該方法同時也是嘗試對中醫證侯給出一個合理的現代解釋，至少從效應肯定的角度來反證中醫證候可能的現代意義。目前對于組分中藥的方法學研究越來越多，研究者從多方面提出各種各樣的研究模式[25,26]，極大的豐富了組分中藥的研究，有利于中藥的臨床應用以及中醫理論的發展。

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Methodology Exploration for Multi-component Chinese Medicine Based on Protein Signal Transduction Network

Chen Wenxing1,2,Wang Xu1,2,Wang Aiyun1,2,Lu Yin1,2
(1.School of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China;2.Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica,Nanjing 210023,China)

Multi-component Chinese medicine has been considered an important developmental direction for traditional Chinese medicine(TCM)formula.Nowadays,it is unfit to target a molecule for preventing or curing a disease because it resulted from multiple of factors and resulted in many indications.Thus,the idea focusing on the multiple targets for therapy is increasingly accepted by physicians and scientists.Here,we conceived a new simplified method for screening the active multi-component Chinese medicine based on the complexity of Chinese medicine,the multi-target property of protein signal transduction and the principle of Chinese medicine prescription.Combined with the traditional knowledge on tumor and latest antitumor research results of Chinese medicine and its compounds,the method was concretely illustrated.It helps us to transform the herbal compounds to new complex drugs targeting multiple signaling.

Protein signal transduction network,principle of Chinese medicine prescription,multi-component Chinese medicine,methodology

10.11842/wst.2017.05.001

R28

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：王晶）

2017-05-09

修回日期：2017-05-20

＊國家自然科學基金委面上項目（81673725）：利用“遺傳協同致死”模式研究丹參微量弱效多成分的效應倍增機制，負責人：陸茵；國家自然科學基金委面上項目（81673648）：基于Warburg效應探究破血藥化瘀散結抑制腫瘤轉移的分子基礎，負責人：陳文星；江蘇省“青藍工程”，負責人：陳文星；江蘇省中藥學優勢學科（PKPD）。

＊＊通訊作者：陸茵，教授，博士生導師，主要研究方向：腫瘤藥理。