貴州不同居群滇重樓引種后種質變化研究

吳平+周單單+段雪瀅+潘偉+沈昱翔

摘要：研究了貴州不同居群滇重樓引種后物候期、產量和有效成分的變化。采用觀察法記錄引種后的物候期變化；采用切割法測定其根狀莖增長速率；采用HPLC法測定其藥材中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的含量。結果表明：滇重樓引種后物候期有一定變化，倒苗期提前尤為明顯；根狀莖生物量增長率相近；引種后藥材中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ的含量差異不顯著，但有增加的趨勢；滇重樓倒苗期受環境影響明顯；根莖生長速率與栽培環境關系密切；而有效成分含量亦是環境因素主導。通過改變可控因素（環境因子）來對滇重樓進行優質高產栽培是可行的途徑。

關鍵詞：HPLC；滇重樓；引種；品質評價

中圖分類號：S567

文獻標識碼：A 文章編號：16749944（2017）15011803

1 引言

滇重樓（Paris polyphylla Smith var yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.）為延齡草科重樓屬植物，分布于我國云南、貴州等省[1]。滇重樓是著名藥用植物，以根莖入藥，為《中國藥典》2015版收載重樓基源之一[2]，傳統醫學認為其具有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚的功效，臨床廣泛運用于疔瘡癰腫，咽喉腫痛，毒蛇咬傷，跌撲傷痛，驚風抽搐等癥，療效確切[3]。現代研究表明，滇重樓根莖含有多種甾體皂苷，具有止血、鎮痛、抗炎、修復胃粘膜損傷等作用[4～6]，近年來還報道其具有抗腫瘤的活性[7]。2015年版中國藥典規定了薯蕷皂苷類重樓Ⅰ、Ⅱ和偏諾皂苷類化合物Ⅵ、Ⅶ的含量測定方法及限度用以全面反映重樓內在質量。由于近年來重樓的需求迅速增長，重樓野生資源急劇減少。本文對不同居群樣品藥材進行收集和引種栽培，采用高效液相色譜等方法對引種栽培前后的滇重樓藥材進行品質評價，考察環境對滇重樓栽培適應度、產量和有效成分的影響，為人工栽培滇重樓替代野生資源，滿足市場需求奠定基礎。

2 儀器與試劑

2.1 藥材來源

收集的滇重樓樣品涵蓋了貴州具有滇重樓種群自然分布的地區，樣品均為自采或購買具有地上部分植株，便于鑒定的樣品。標本存放于安順學院標本室。

2.2 引種苗圃詳細信息

每個產地滇重樓除干燥部分作為藥材樣品保存外，將帶頂芽根莖作為種源引種栽培于位于安順學院苗圃中。栽培基質選用混合均一的山基土與廢棄菌包，搭建蔭棚以模擬其自然生境栽培并對其進行物候期觀察，于2015年11月采挖栽培兩年后樣品，對進行其有效成分等進行評價。

2.3 儀器與試劑

高效液相色譜儀（美國Water）、分析天平、微型植物試樣粉碎機、自動進樣器，超純水，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號分別為111590-200402，111591-200402，111592-200402，111593-200402）。

3 方法與結果

3.1 物候期觀察

在栽培期間，對引種成活后植株的出苗時間、花期、果熟期、倒苗期進行觀察并記錄，每個產地至少記錄10株，取平均值。

3.2 根莖生物量累計速率的測定

滇重樓根莖生長速率f=近2年根莖重量/前2年根莖數量，結果見表1。

3.3 重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量測定

色譜條件為 AgelaVenusilXBP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-水（B），進行梯度洗脫（0～40 min、30%～60%A，40～50 min、60%～30%A）檢測波長203 nm；柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL。取混合對照品和供試品溶液分別進樣，理論板數按重樓皂苷Ⅰ的的峰計算≥4×103（圖1），精密吸取混合對照品溶液，分別進樣4、6、8、10、12、14 μL，記錄峰面積。以對照品進樣量為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算各產地的滇重樓的回歸方程（表2）。精密稱取22份不同產地的滇重樓樣品粉末月0.5 g，平行稱取3份按照上述方法測定樣品中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量，測定結果見（表2）。

3.4 對引種前后的數據進行相關性分析

使用SPSS軟件對滇重樓引種前后4種皂苷含量和總皂含量進行方差分析，數據表明引種后滇重樓中皂苷含量差異不顯著但均有增加的趨勢，結果見表3。

4 討論

于2014年至2015年兩年時間內，對滇重樓引種后主要物候特征、生物學性狀進行了觀察記錄，發現滇重樓栽培過程中不同居群植株表現出一定物候期的差異，這些差異并未隨著栽培的時間表現出顯著趨同性，表明不同居群間物候期差異存在，且這些特性可能是遺傳主導型；倒苗期較野生居群提前近30 d，其他物候期基本沒變化，故此推斷可能會影響根莖生物量的累計，因此對引種的樣品根莖增長速率f值進行測量和計算后，發現樣品根莖都能夠正常增重，f≥1，最高值f=1.33；且整體根莖生物量累計速率有趨同的趨勢，提示滇重樓根莖生物量累計可能與栽培環境關系密切。

實驗以甲醇-乙腈流動相體系梯度洗脫所得到的色譜圖基線比較平穩，色譜峰數較多，分離效果好、靈敏度高；由表3可知，不同產地不同居群滇重樓藥材品質存在較大差異，其中總皂苷含量最高的是產自其中興義市烏沙鎮舍格村；結果表明，貴州省滇重樓資源品質具有如下特點：其一是其有效成分含相對較高，且品質穩定，本實驗對22份樣品中的4種重樓皂苷進行了含量測定，達到藥典要求的有產自貴定縣都六鄉的樣品2、產自興義市烏沙鎮的樣品5以及普定縣雞場鄉的樣品7三個品質最好，4種皂苷總含量超過2%；貴州省滇重樓4種皂苷總含量平均值為1.23%，高于藥典要求值（0.60%）1倍有余；其二是它的自然分布環境海拔較云南等地低，僅1000余m海拔即可適應生長，并且對海拔、土壤、光照、水分等生態因子不甚嚴苛生態幅較大。

不同產地滇重樓藥材中有效成分的含量引種前后有一定差異；通過測量引種前后有效成分含量變化發現，滇重樓在合適的栽培條件下，有效成分含量有增高趨勢，但差異顯著，引種栽培后絕大部分樣品能滿足藥典要求，說明人工栽培滇重樓提供藥用切實可行；但4種重樓皂苷含量變化并無顯著規律，可能是由于測試樣品的樣本之間個體差異造成，但是整體而言，有效成分含量在栽培過程中也表現出趨同的趨勢。本研究將不同居群滇重樓引種到相同環境，進行了長達兩年的栽培和觀察，得出滇重樓有效成分含量是受環境因素主導，因此提示我們可以通過改變可控因素（各環境因子）來對滇重樓進行栽培以達到優質高產的目的。

參考文獻：

[1]李 恒.重樓屬植物[M].北京：科學出版社，1998：35～37.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M] .北京：中國醫藥科技出版社，2015：243～244.

[3]何 俊，張 舒，王 紅，等.滇重樓植物的研究進展[J].云南植物研究，2006，28（3）：271～276.

[4]Chen CX，Zhang YT，Zhou J.Studies of the saponin components of plants in YunnanⅥ ：Steroid glycosides of Paris polyphylla var yunnanensis [J].Acta Bot Yunnan，1983，5（1）：91～97.

[5] Chert CX，Zhou J，1992.Two new steroid saponins of Paris polyphylla var yunnanensis [J].Acta Bot Yunnan，14（1）：111～113.

[6]張宵霖，劉月嬋.重樓的研究與應用[J].中國中醫藥科技，2000，7（5）：346～347.

[7]石小楓，杜德極.重樓總皂甙H22動物移植性腫瘤的影響[J].中草藥，1992，15（3）：33～36.

Abstract：Abstract Objective：To study the changes of phenological period、yield and content of active ingredient after the introduction of different paris polyphylla var.yunnanensis in Guizhou.Methods：The morphological changes were record by observational method；The growth rate of rhizome were determined by cutting method；The content of Saponins Ⅰ、 Ⅱ、Ⅵ and Ⅶ variety in paris polyphylla var.yunnanensis were determined by HPLC.results：The phenological pheriod of the paris polyphylla var.yunnanensis had certain change after the introduction and withering stage is especially obvious in advance； the growth rate of rhizomes biomass were close；The contents of Saponins Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ and Ⅶ were not varies greatly.Conclusion：The withering stage of the paris polyphylla var.yunnanensis were affected significantly by surroundings； It is concluded that the growth rate of rhizome is closely related to the cultivation surroundings，and the active ingredient content is also affected by the environmental factor.Therefore，it is a feasible way to achieve the purpose of excellent production for paris polyphylla var.yunnanensis by changing the controllable factors （environmental factors）.

Key words： HPLC；Paris polyphylla var yunnanensis；Domestication；quality evaluation