攜帶wcaG毒力基因ST19 產酸克雷伯菌致白血病患者死亡的分析

丁 慧，胡龍華，鐘橋石，杭亞平，劉衍伶，俞 鳳，陳艷慧，胡曉彥，張黎明，章白苓，張 楠，王小中

攜帶wcaG毒力基因ST19 產酸克雷伯菌致白血病患者死亡的分析

丁 慧，胡龍華，鐘橋石，杭亞平，劉衍伶，俞 鳳，陳艷慧，胡曉彥，張黎明，章白苓，張 楠，王小中

目的了解1例高黏液表型(HMV)產酸克雷伯菌致白血病患者的死亡原因。方法采用Vitek 2 Compact全自動微生物儀進行菌株鑒定及藥敏試驗，黏液絲試驗檢測HMV表型，PCR方法及基因測序檢測主要的高毒力莢膜血清型基因(K1、K2、K5、K20、K54、K57)和毒力基因(rmpA、wcaG、allS、kfu、aerobactin、mrkD、fimH、uge、wabG、cf29a)，多位點序列分析(MLST)對該菌株進行分子分型。結果白血病患者血液及肺組織分離株均為產酸克雷伯菌，MLST分型為同一型ST19，該菌株對所測藥物均敏感，具有高黏液表型，只檢測到wcaG毒力基因，其他毒力基因和所測莢膜血清型基因均陰性。結論攜帶wcaG毒力基因是ST19產酸克雷伯菌致白血病患者死亡的主要原因，應引起臨床關注。

產酸克雷伯菌；毒力；白血病；黏液；多位點序列分析

克雷伯菌屬是臨床常見條件致病菌，主要包括肺炎克雷伯菌和產酸克雷伯菌，既能引起醫院感染，也可造成社區感染，也是醫院感染部門的重點監控菌株，主要引起免疫功能低下患者的下呼吸道、泌尿系統、腹腔及血流等感染。過往臨床關注最多的是多重耐藥克雷伯菌的感染，尤其是耐碳青霉烯類抗菌藥物的克雷伯菌感染[1]。但近幾年，一種?？晌＜盎颊呱母叨玖Ψ窝卓死撞母腥径饛V泛關注，北美、歐洲等多地均有報道，尤其令人驚奇的是，其感染主要發生于亞裔患者，臨床主要表現為肝膿腫、嚴重肺炎、眼肉炎及顱內感染[2]。此類菌株的特點是毒力強，可引起免疫功能正常者嚴重感染，但耐藥性不強，通常對臨床常用抗菌藥物均敏感，臨床醫生在抗感染時易忽視。最近我們分離到一株高毒力產酸克雷伯菌，現將結果報道如下，希望能引起臨床醫生及臨床微生物工作者的關注。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 患者，男，27歲，工人。因“發現白細胞低15月”于2015年9月9日入住南昌大學第二附屬醫院血液內科，經骨髓穿刺細胞學等相關檢查，確診為急性淋巴細胞白血病(ALL)，于9月16日行VDLP方案化療同時給予阿莫西林/克拉維酸預防感染。9月27日患者進入化療粒細胞缺乏階段并且發熱，體溫最高至39℃，給予哌拉西林/他唑巴坦鈉、阿米卡星聯合氟康唑抗感染治療，患者體溫間斷波動于38 ℃左右。10月26日患者突發高熱達39 ℃，咳嗽咳黃色膿痰，伴右側胸痛。查體：咽紅，扁桃體可見2個小潰瘍，頸軟，雙肺呼吸音粗，右肺聞及較多濕羅音，心律齊，腹軟，肝脾肋下未觸及，雙下肢病理征陰性。血常規：白細胞27.65×109/L，中性粒細胞90.7%,淋巴細胞4.3%。血沉129 mm/h，降鈣素原0.53 ng/mL。胸部CT：右肺上葉見一含氣空洞，內壁不規整，右肺見大片狀實變影及磨玻璃影，邊界不清。結核桿菌T細胞檢測陰性，真菌D及GM實驗均陰性。血培養示：產酸克雷伯桿菌?；颊吒腥究刂撇患眩瑢⒖咕幬镎{整為頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、替考拉寧聯合米卡芬凈。為進一步明確病因，11月3日行經皮肺穿刺活檢術，取3塊病理組織行活檢及細菌培養。11月5日17:45分患者胸悶、氣喘，轉至呼吸科ICU。19:33分患者臨床死亡。11月6日組織黏膜細菌培養示：產酸克雷伯菌。

1.2 主要儀器和試劑 Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定系統和藥敏系統(法國梅里埃生物公司)，MG48G PCR儀(杭州朗基科學有限公司)，DYC-6C電泳儀和凝膠成像儀(北京六一公司)。PCR試劑購于通用生物有限公司，相關擴增引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.3 細菌培養鑒定與藥敏實驗 患者寒戰時由病房護士以無菌技術抽取雙側肘靜脈血液各10 mL注入BACT/ALERT 3D 需氧中和抗生素培養瓶中，送至微生物室并及時放入血培養儀中。待陽性報警后再抽取瓶中標本接種血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、中國藍瓊脂平板以及涂片革蘭染色，平板放置5% CO2環境孵育18～24 h?；顧z粘膜組織研磨成組織碎片，接種環挑取適量碎片接種以上3種平板，挑取純培養物采用法國生物梅里埃公司 Vitek 2 Compact 全自動細菌鑒定儀進行菌株鑒定及藥敏試驗，結果按照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI 2015年版)推薦標準進行判讀。標準菌株為大腸埃希菌ATCC25922 和肺炎克雷伯菌ATCC700603。

1.4 高黏液性(hypermucoviscosity,HM)表型檢測 將產酸克雷伯菌接種于哥倫比亞血瓊脂平板上 35 ℃培養過夜，次日用接種環輕拉菌落，測量 “拉絲”長度>5 mm 判為是 “拉絲”陽性，即高黏液菌株; ≤5 mm判為是 “拉絲”陰性。實驗需重復2次結果才可確認[3]。

1.5 PCR檢測毒力基因 PCR擴增K1、K2、K5、K20、K54、K57、rmpA、wcaG、allS、kfuBC、aerobactin、fimH、uge、wabG、cf29a毒力基因。上、下游引物序列見表 1。反應體系參見文獻[4]。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳進行分析。陽性產物送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序，測序結果上傳 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/網站比對分析。

1.6 多位點序列分型( MLST) PCR擴增rpoB、phoE、mdh、infB、pgi、tonB和gapA7 個產酸克雷伯菌的管家基因，引物序列和反應體系參照文獻[5]。擴增陽性產物送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序，測序結果上傳 http://pubmlst.org/網站進行比對確定 MLST 類型。

2 結 果

2.1 細菌培養鑒定與藥敏結果 血培養及肺組織培養的菌株經鑒定均為產酸克雷伯菌，且藥敏結果一致。ESBLS陰性，對哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、替加環素、頭孢哌酮、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢西丁、阿米卡星、左氧氟沙星、慶大霉素、磺胺甲基口噁唑均敏感。

2.2 HM結果 “拉絲”長度均>5 mm, “拉絲”實驗陽性，表明兩株產酸克雷伯菌具有高黏液表型屬于高黏液菌株。

2.3 毒力基因及分子分型結果 PCR基因擴增并序列分析未檢測到莢膜血清基因(K1、K2、K5、K20、K54、K57)和rmpA, 檢測到wcaG基因。MLST分型均為ST19。

3 討 論

男性患者，27歲，因反復外周血白細胞數低，于2015年9月9日入住血液內科，經骨髓穿刺細胞學等相關檢查，確診為急性淋巴細胞白血病(ALL)，于9月16日行VDLP方案化療，考慮到患者免疫功能低下，同時給予阿莫西林/克拉維酸預防感染。9月27日22時，患者在無咳嗽咳痰、畏寒寒戰，且無其他明顯誘因情況下出現發熱，體溫最高至39 ℃，急查血常規及血培養，血常規：白細胞 0.22×109/L，中性粒細胞4.6%，淋巴細胞90.9%；血培養陰性。結果表明，患者已進入粒細胞缺乏階段，且有發熱表現，需加強抗感染治療，將抗感染藥物調整為哌拉西林/他唑巴坦鈉、阿米卡星聯合氟康唑，在醫護人員的精心呵護和其他支持治療的情況下，患者體溫間斷波動于38 ℃左右。10月26日患者再次出現高熱，體溫高達40 ℃，扁桃體可見2個小潰瘍，伴咳嗽咳黃色膿痰，雙肺呼吸音粗，右肺聞及較多濕羅音，胸部CT右肺上葉見一含氣空洞，內壁不規整，右肺見大片狀實變影及磨玻璃影，邊界不清；血常規白細胞27.65×109/L，中性粒細胞90.7%, 淋巴細胞4.3%，血培養及穿刺肺組織培養均為產酸克雷伯菌，菌株對所測藥物均敏感，且經MLST證實為同一株菌，依據病原體藥物敏感試驗結果及患者臨床表現，將抗菌藥物調整為頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、替考拉寧聯合米卡芬凈，雖然菌株對臨床常用抗菌藥物均高度敏感，臨床也進行了積極的抗感染治療，但令人遺憾的事還是發生了，患者于11月5日出現室顫，經搶救無效而死亡。有文獻曾報道白血病患者由于糖皮質激素和免疫抑制劑的使用、各種侵入性操作、住院時間長等因素，易發生醫院感染，感染好發于呼吸道，以革蘭陰性桿菌為主[6]。

產酸克雷伯菌是克雷伯菌屬中僅次于肺炎克雷伯菌的臨床常見病原菌，為條件致病菌，感染致患者死亡并不常見，況且該患者血液及肺穿刺組織分離株對臨床常用抗菌藥物均敏感，臨床依據藥敏試驗結果選用了強有力的抗菌藥物，但還是未能控制感染而致患者死亡。有研究報道，高毒力克雷伯菌感染難控制，易致患者死亡，黏液表型是鑒定分離株是否為高毒力的重要條件[7]。本研究結果表明，血液及肺組織分離株均為MH表型，具有MH表型的菌株更易引起侵襲性感染，若為血流感染，則更易隨血流播散至全身其他各重要器官，形成多發性膿腫及多器官衰竭，如肝膿腫、膿胸、腦膜炎及眼內炎等，嚴重危及患者的生命。Lee C H等曾報道具有高黏液表型的克雷伯菌在引起的侵襲性感染中，能更有效抵抗補體和吞噬細胞殺傷作用、降低對血清殺傷作用的敏感性，并在動物實驗中證實有更強的毒力[8]。

令人奇怪的是，此次分離獲得的高黏液產酸克雷伯菌6種常見的莢膜血清型基因均陰性，是否還有其他莢膜血清基因介導，還有待進一步研究。為了進一步了解其毒力，在此次研究中我們還同時檢測了產酸克雷伯菌鐵攝取系統相關的毒力基因(allS、kfu、aerobactin)、粘附因子(mrkD)、毒素因子相關基(fimH、uge、wabG、cf29a、rmpA、wcaG)共10種密切相關的毒力基因，只檢測到wcaG.。wcaG.主要功能為編碼細菌莢膜的海藻糖, 使細菌躲避巨噬細胞的吞噬作用，同時編碼抗炎因子激活蛋白，并且與細菌毒素的產生有密切關系[9]。有趣的是，本研究菌株毒力強，短時間內致感染患者死亡，但其對臨床常用抗菌藥物均敏感，且為非產ESBLs菌?？赡苁歉叨玖陻y帶毒力基因的質粒較大，同時獲取耐藥質粒較困難，或是毒力基因與耐藥基因具有不相容性，獲得毒力基因同時丟失耐藥基因，從而產生黏液表型和對抗菌藥物敏感的特性。另有報道，非產ESBL株比產 ESBL 株耐藥性弱，但毒力更強，能更有效抵抗血清殺傷作用[10]。

此次分離獲得的產酸克雷伯菌為ST19，屬于發育樹分類中的A群，其毒素與抗生素相關性出血性結腸炎發生發展密不可分[11]。產酸克雷伯菌釋放的毒素可引起抗生素相關性出血性結腸炎，嚴重者可引起敗血癥休克或死亡[12]。

綜上所述，對克雷伯菌屬引起的血流等嚴重感染，臨床除積極抗感染治療外，還應密切關注患者病情進展；臨床微生物工作者不僅要對菌株進行藥物敏感試驗，還應觀察菌落的黏液表型，并進行黏液表型檢測，黏液表型檢測方法操作簡單，結果易判讀，普通臨床微生物實驗均能開展，必要時還需對菌株進行相關毒力基因檢測，并將結果及時與臨床溝通，警惕高毒力克雷伯菌的感染。

表1 基因引物序列、產物大小及退火溫度Tab.1 Primers product size and annealing temperature used in this study

續表

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HU Long-hua，Email:longhuahu@163.com

DeathcausedbyST19KlebsiellaoxytocawithwcaGvirulencegeneinleukemicpatient

DING Hui， HU Long-hua, ZHONG Qiao-shi, HANG Ya-ping, LIU Yan-ling, YU Feng, CHEN Yan-hui, HU Xiao-yan, ZHANG Li-ming, ZHANG Bai-ling, ZHANG Nan, WANG Xiao-zhong

(ClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,JiangxiProvinceKeyLaboratoryofLaboratoryMedincineNanchang330006,China)

We investigated the cause of a leukemia patient induced by infect in a strain ofKlebsiellaoxytocawith hypermucoviscosity (HMV) phenotype. Identification and drug susceptibility of the isolate were carried out with VITEK-2 compact system. HMV phenotype was detected by string-test. The major high virulence capsular serotypes (K1, K2, K5, K20, K54 and K57) and virulence factors (rmpA,wcaG,allS,kfu,aerobactin,fimH,uge,wabGandcf29a) were detected by polymerase chain reaction and DNA sequencing. Molecular typing was performed by multilocus sequence typing (MLST). Results showed that the isolates of blood and lung tissue wereKlebsiellaoxytocabelonged to ST 19, which were sensitive to the antibiotics used in test, expressing the HMV phenotype. The virulence genewcaGwas found, while other virulence genes and the major high virulence capsular serotypes were negative. It indicates that ST19Klebsiellaoxytocawith wcaG virulence gene is the main reason causing leukemic patient death.

Klebsiellaoxytoca; virulence;leukemic; mucous; multilocus sequence typing (MLST)

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.08.018

胡龍華, Email:longhuahu@163.com

南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西省醫學檢驗重點實驗室，南昌 330006

R378

：A

：1002-2694(2017)08-0753-04

2017-02-14編輯：劉岱偉