蘋果白蘭地釀造中釀酒酵母與異常漢遜酵母的相互作用

曾朝珍，康三江，李明澤，張霽紅，張海燕，張 芳

(甘肅省農業科學院農產品貯藏加工所，甘肅蘭州730070)

蘋果白蘭地釀造中釀酒酵母與異常漢遜酵母的相互作用

曾朝珍，康三江，李明澤，張霽紅，張海燕，張 芳

(甘肅省農業科學院農產品貯藏加工所，甘肅蘭州730070)

通過構建釀酒酵母與異常漢遜酵母在富士蘋果汁中的共培養發酵體系，采用兩種酵母混合接種和順序接種的發酵方式，比較不同培養體系中的生物量和發酵力的變化，分析兩種酵母之間的相互作用。結果表明，共培養發酵體系中，異常漢遜酵母的生長受到了釀酒酵母生長的抑制，釀酒酵母的接種方式對共培養體系發酵力的影響大于異常漢遜酵母。

蘋果白蘭地； 釀酒酵母； 異常漢遜酵母； 混菌發酵； 相互作用

傳統食品發酵中大都具有多種微生物共同參與發酵的特征，微生物間的相互作用對食品的質量起著至關重要的作用[1]。非釀酒酵母曾被認為是果酒釀造過程中的腐敗酵母，對酒的品質起到不利的作用[2]，但是隨著對果酒釀造研究的深入，非釀酒酵母對果酒品質至關重要的作用已得到肯定[3]。蘋果白蘭地是以蘋果汁為原料經釀酒酵母發酵并蒸餾后得到的一種新型水果類白酒[4]，單一菌種發酵對蘋果白蘭地酒的品質雖有一定程度的保證，卻降低了蘋果白蘭地酒產品的獨特性和風味的多樣性。多種酵母在發酵過程中的相互協作，可以有效增加蘋果白蘭地酒風味的多樣性，但也可能影響蘋果白蘭地酒質量的穩定性[5-7]。混菌發酵中微生物之間的相互作用最終導致在發酵不同階段酵母菌特定的生長規律，通過鑒別培養基了解這種動態的變化規律有利于蘋果白蘭地酒自然發酵過程中的微生物學控制，也可以為后續發酵風味的調節提供依據。本文研究異常漢遜酵母與釀酒酵母間的相互作用特征，不僅可為蘋果白蘭地的釀造工藝提供理論基礎，而且對實現蘋果白蘭地液態發酵的穩定性和可操控性打下堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種：釀酒酵母32168和異常漢遜酵母31399，由中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供。

培養基：種子培養基為麥芽汁培養基；發酵培養基為富士蘋果汁。

試劑：蛋白胨、酵母浸粉、生化試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司；葡萄糖、分析純，天津凱通化學試劑有限公司。

儀器設備：2WY-2102型恒溫培養箱、ZHJHC11128型超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；TD50002型電子天平，余姚市金諾天平儀器有限公司；B204LED型生物顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限公司；YXQ-LS-75G型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；Breville-BJE500F型榨汁機，澳大利亞鉑富公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 釀酒酵母與異常漢遜酵母的相互作用研究

（1）釀酒酵母與異常漢遜酵母的純培養及共培養體系中生長特征的測定。在蘋果汁發酵培養基中分別接入異常漢遜酵母和釀酒酵母及混合接入發酵培養基中，接種濃度均為1×106cfu/mL，在25℃下厭氧靜置發酵直至發酵結束。

（2）不同接種比例對釀酒酵母與異常漢遜酵母相互作用的影響。在蘋果汁發酵培養基中接入異常漢遜酵母和釀酒酵母，異常漢遜酵母接種濃度為1×106cfu/mL，釀酒酵母接種濃度分別為1×104cfu/mL、1×105cfu/mL、1×106cfu/mL，即釀酒酵母與異常漢遜酵母分別以1∶1、1∶10、1∶100的比例，在25 ℃下厭氧靜置發酵直至發酵結束。

（3）接種方式對釀酒酵母與異常漢遜酵母相互作用的影響。①將異常漢遜酵母與釀酒酵母分別以1×106cfu/mL、1×105cfu/mL同時接入蘋果汁發酵培養基中進行混合發酵（同時接種），作為對照；②先接入濃度為1×106cfu/mL的異常漢遜酵母培養2 d，以達到其旺盛生長期，后接入濃度為1×105cfu/mL的釀酒酵母進行混合發酵（順序接種Ⅰ）；③先接入濃度為1×105cfu/mL的釀酒酵母培養1 d，以達到其旺盛生長期，后接入濃度為濃度為1×106cfu/mL的異常漢遜酵母進行混合發酵（順序接種Ⅱ）。

（4）接種量對釀酒酵母與異常漢遜酵母相互作用的影響。在不同培養方式條件下，將釀酒酵母與異常漢遜酵母以6%、7%、8%的不同接種量接入到蘋果汁發酵培養基中進行酒精發酵，在25℃下厭氧靜置發酵直至發酵結束。

1.2.2 分析方法

酵母菌落總數的測定：參照GB 4789.2—2010[8]菌落總數計數方法，直接采用稀釋涂布YPD平板測定發酵過程中兩種酵母的數量變化。

酵母發酵力的測定[9]：采用失重法，以二氧化碳揮發產生的失重來衡量酵母發酵力的大小，每隔24 h稱重1次，直至發酵結束。

2 結果與分析

釀酒酵母與異常漢遜酵母的相互作用研究。

2.1 釀酒酵母與異常漢遜酵母的純培養及共培養體系中生長特征的測定

在蘋果汁發酵培養基中等量（接種量6%，接種比例1∶1）接種異常漢遜酵母和釀酒酵母，并以各自的純培養為對照，在25℃條件下發酵7 d后，測定純培養及共培養體系中不同酵母的生物量及二氧化碳失重量，結果見圖1、圖2、圖3。

圖1 純培養及共培養體系中異常漢遜酵母細胞總數的變化

圖2 純培養及共培養體系中釀酒酵母細胞總數的變化

圖3 純培養及共培養體系中酵母發酵力的變化

純培養及共培養發酵過程中兩種酵母細胞數量的動態變化過程見圖1、圖2。由于共培養發酵時兩種酵母競爭利用碳源[10]，釀酒酵母優先利用葡萄糖而迅速增殖，異常漢遜酵母營養不足導致其生長緩慢,故共培養發酵時釀酒酵母數量較高；當異常漢遜酵母單獨培養時,由于沒有生長所需營養物質的競爭壓力，異常漢遜酵母能夠較好的繁殖并獲得較高的細胞水平；此外，當異常漢遜酵母和釀酒酵母在共培養體系中發酵時，由于營養物質和生存空間的限制，各自的最大生物細胞總量都低于單菌種純培養的水平。

當釀酒酵母與非釀酒酵母混合發酵時，非釀酒酵母會抑制釀酒酵母的發酵性能。圖3結果表明，釀酒酵母單菌種發酵整個系統的發酵力最強，而共培養發酵整個系統的發酵力與釀酒酵母單菌種培養相近但相對略低，異常漢遜酵母單菌種培養發酵性能相對最差。

2.2 不同接種比例對共培養體系中異常漢遜酵母生長及發酵力的影響

由于等比例接種時，釀酒酵母表現出對異常漢遜酵母較強的抑制作用。因此，通過降低釀酒酵母的接種量來研究不同接種比例條件下釀酒酵母對異常漢遜酵母生長的作用及酵母發酵力的影響。結果見圖4、圖5（注：對照是指異常漢遜酵母的純培養；接種比例為異常漢遜酵母與釀酒酵母的接種濃度之比）。

圖4 不同接種比例對共培養體系中異常漢遜酵母生長量變化的影響

圖5 不同接種比例對共培養體系中酵母發酵力變化的影響

由于釀酒酵母對異常漢遜酵母的抑制作用，因此，降低釀酒酵母的接種濃度，研究了不同接種比例對共培養體系中酵母生物量及發酵力的影響。由圖4可知，即使將釀酒酵母的接種量降低100倍，共培養體系中異常漢遜酵母的生長仍會受到很強的抑制作用。導致這一現象的原因可能是由于酵母的快速增殖而導致發酵環境呈酸性[11]，從而導致異常漢遜酵母生長受抑制。圖5結果表明，隨著釀酒酵母的接種量降低倍數增加，共培養發酵整個系統的發酵力也隨之降低，但都強于異常漢遜酵母單菌種培養的發酵力，說明釀酒酵母對共培養發酵整個系統的發酵力影響大于異常漢遜酵母。

2.3 不同接種方式對共培養體系中酵母菌生物量變化及發酵力的影響

當非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵時，因為其不耐酒精及對營養物質的低競爭力等原因，其生物細胞會在接種的3～4 d后出現大量衰亡，而其過早衰亡對蘋果白蘭地香氣形成的貢獻就很有限。因此，本試驗為了延長非釀酒屬酵母的生長時間，在接種順序上進行了對比試驗，研究了不同接種方式對共培養體系中酵母菌生物量變化及發酵力的影響，結果見圖6、圖7。

圖6 不同接種方式對共培養體系中酵母生長量變化的影響

由圖6結果可以看出，同時接種與順序培養Ⅱ體系中的異常漢遜酵母與釀酒酵母的生長規律相近，兩個培養體系中釀酒酵母的生物細胞量都在發酵前兩天迅速增殖，而異常漢遜酵母都呈現生物細胞量下降的趨勢，說明在釀酒酵母強發酵力的體系中，非酵母屬酵母的生長確實受到抑制；而先接種異常漢遜酵母的順序培養Ⅰ體系中，異常漢遜酵母能在發酵前期迅速增殖，之后隨著發酵進行及釀酒酵母的接入，異常漢遜酵母生物細胞量開始下降。這可能與混合發酵體系中營養物質的競爭效應、有毒物質的形成濃度[12-14]以及細胞的群體感應[15]等因素有關，這從生物量的角度說明混合培養發酵時以非酵母屬酵母先接種、培養一段時間后再接入發酵力強的釀酒酵母的方式是非常必要的。而圖7結果表明，順序培養Ⅰ體系的發酵力明顯弱于同時培養與順序培養Ⅱ體系的發酵力，說明釀酒酵母的接種方式對共培養體系的發酵力影響大于異常漢遜酵母。

圖7 不同接種方式對共培養體系中酵母發酵力變化的影響

2.4 釀酒酵母接種量對發酵過程中異常漢遜酵母生長及發酵力的影響

2.4.1 同時培養方式下釀酒酵母接種量對異常漢遜酵母生長及發酵力的影響

本研究就釀酒酵母初始接種量對發酵過程中異常漢遜酵母生長及發酵力的影響開展試驗，采用逐漸提高釀酒酵母接種量的方式，在同時培養條件下研究非釀酒酵母與釀酒酵母在3種初始接種量下它們的相互作用。結果見圖8、圖9。

由圖8結果可以看出，3種釀酒酵母接種量方式的發酵體系中，盡管異常漢遜酵母的接種量也在隨著增加，但是異常漢遜酵母生物細胞量卻隨著釀酒酵母接種量的增加而降低，說明和純培養相比較，共培養體系中異常漢遜酵母的生長同樣受到釀酒酵母的抑制；而圖9結果表明，共培養體系的發酵力隨著釀酒酵母接種量的增加而增加；純培養體系的發酵力隨著異常漢遜酵母接種量的增加而增加，但整體發酵能力低于對應的共培養體系。

2.4.2 順序培養方式下釀酒酵母接種量對異常漢遜酵母生長及發酵力的影響

圖8 同時培養體系中不同接種量對異常漢遜酵母生長量變化的影響

圖9 同時培養體系中不同接種量對酵母發酵力變化的影響

本研究在順序培養方式下，采用逐漸提高釀酒酵母的接種量的方式，研究非釀酒酵母與釀酒酵母在3種初始接種量下的相互作用。結果見圖10、圖11。

圖10、圖11結果表明，順序培養方式下異常漢遜酵母生長及酵母發酵力的變化規律與同時培養方式下的相似，但就生物細胞量及發酵力而言，順序培養方式下的異常漢遜酵母的生物細胞量與對應的發酵力大小都高于同時培養方式下相對應的量。

3 結論

圖10 順序培養體系中不同接種量對異常漢遜酵母生長量變化的影響

圖11 順序培養體系中不同接種量對酵母發酵力的影響

3.1 共培養發酵體系中，異常漢遜酵母的生長受到了釀酒酵母生長的抑制，其最大細胞生物總量顯著低于單菌種純培養的水平，而異常漢遜酵母對釀酒酵母的生物量及發酵力的影響不明顯。

3.2 共培養發酵時以異常漢遜酵母先接種、培養一段時間后再接入發酵力強的釀酒酵母的方式是非常必要的，但對于發酵力而言，釀酒酵母的接種方式對共培養體系發酵力的影響大于異常漢遜酵母。

3.3 本研究只是針對釀酒酵母與異常漢遜酵母相互作用特征方面做了研究，而從分子水平對釀酒酵母與異常漢遜酵母間相互作用機制的相關研究還需進一步開展。

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Interaction between Saccharomyces cerevisiae and Hansenula anomala during Apple Brandy Fermentation

ZENG Chaozhen,KANG Sanjiang,LI Mingze,ZHANG Jihong,ZHANG Haiyan and ZHANG Fang
(Agricultural Product Storage and Processing Research Institute,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China)

The co-culture fermentation systems of Saccharomyces cerevisiae and Hansenula anomala for Fuji apple juice had been constructed.The change in biomass and fermenting power in different systems was compared by using mixed inoculation or sequential inoculation of the two yeast strains.Besides,the interaction between the two yeast strains was analyzed.The results suggested that the growth of Hansenula anomala was inhibited by Saccharomyces cerevisiae in the co-culture system,and the inoculation method of Saccharomyces cerevisiae had greater effects on the fermenting power than that of Hansenula anomala.

apple brandy;Saccharomyces cerevisiae;Hansenula anomala;mixed fermentation;interaction

TS262.38；TS261.1；TS261.4

：A

1001-9286（2017）08-0032-06

10.13746/j.njkj.2017111

現代農業產業技術體系建設專項資金資助（CARS-28）；甘肅省農業生物技術研究與應用開發項目（GNSW-2016-20）；甘肅省2015年度“隴原青年創新人才扶持計劃”項目。

2017-04-27

曾朝珍(1981-)，男，助理研究員，碩士，研究方向為食品科學。

康三江（1977-），男，研究員，本科，研究方向為果蔬貯藏加工技術。

優先數字出版時間：2017-06-23；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170623.1517.011.html。