利用分子標記輔助選擇改良浙恢7954的稻米品質

牛凱萌，徐俊波，鐘 亮，王 華，朱 英，*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004； 2.浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江省植物有害生物防控重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021)

利用分子標記輔助選擇改良浙恢7954的稻米品質

牛凱萌1，2，徐俊波2，鐘 亮2，王 華2，朱 英2，*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004； 2.浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江省植物有害生物防控重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021)

浙江省第1個獲得國家植物新品種保護的浙恢7954是雜交稻育種中綜合性狀優異的恢復系，但其直鏈淀粉含量偏高(約25%)，食味品質較差。多年來，通過傳統育種手段改良該品種的稻米品質，收效甚微。利用Wx基因第1內含子剪切處的SNP位點，設計分子標記，以綜合性狀優異且直鏈淀粉含量中低的93-11為供體，借助分子標記輔助選擇技術，通過雜交和多代回交，獲得了直鏈淀粉含量中等，食味品質明顯提升，而粒型、粒重、精米率等其他綜合性狀近似于親本浙恢7954的品系L2和L9，表明成功地改良了浙恢7954的稻米品質。SNP分型結果顯示，除Wx位點外，L2和L9在浙恢7954背景下導入的93-11片段均不到7%。這些中間材料的獲得，為高產優質的雜交稻親本及其雜交組合選育提供了良好的基礎。

浙恢7954；直鏈淀粉含量；蠟質基因；分子標記輔助育種；SNP

水稻是世界上重要的糧食作物之一，全世界近一半的人口以稻米為主食。矮稈育種和雜種優勢的利用使我國水稻產量有了2次大的飛躍，為解決我國糧食問題作出了巨大貢獻。近年來，隨著生活水平的提高，人們對稻米品質的要求也越來越高。實現包括稻米等主要糧食作物在內的農產品供給由量向質的改變，加強農業供給側結構性改革也是新形勢下中央對“三農”工作提出的最新要求[1]。在此背景下，水稻育種的指導思想由過去一味地追求高產向著“優質安全兼顧高產”的方向轉變。

淀粉是稻米的主要成分，含量為70%～90%，由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。直鏈淀粉含量(AC)、糊化溫度(GT)、膠稠度(GC)是衡量稻米蒸煮加工和食用品質優劣的重要理化指標，其中，直鏈淀粉含量起決定性作用。稻米的直鏈淀粉含量受水稻蠟質基因(Wx)控制[2]。研究表明，不同水稻品種直鏈淀粉含量的高低常常由Wx基因第1內含子的剪接效率決定[3]，而第1內含子中供體+1位置的堿基G/T多態性與第1內含子的剪接效率直接相關[4]。含GG型Wx基因的水稻通常具有高直鏈淀粉含量(≥20%)，而含TT型Wx基因的水稻直鏈淀粉含量中低(<20%)。由此，蔡秀玲等[5]開發了一個與稻米直鏈淀粉含量完全連鎖的分子標記PCR-AccI。

浙恢7954是浙江省第1個獲得國家植物新品種保護的水稻品種，也是雜交稻育種中難得的恢復力強、配合力高、綜合性狀優異的恢復系，由其選配出的秈粳亞種間超高產雜交水稻組合Ⅱ優7954，克服了秈粳雜種優勢利用中雜種結實率偏低和充實度較差的難題，在全國得到了廣泛的推廣應用。經農業部鑒定，Ⅱ優7954糙米率、精米率、堿消值3項指標達優質米一級標準，而直鏈淀粉含量偏高，約為25%，達優質米二級標準[6]，仍有遺傳改良的空間。對其Wx基因測序結果表明，該基因第1內含子剪切供體位點為G，可能是造成直鏈淀粉含量偏高的重要因素。93-11是另一個成功用于我國雜交稻兩優培九父本的重要秈稻品種[7]，該品種的品質主要指標達農業部頒發的一級優質米標準，其中直鏈淀粉含量約為17%。對93-11中Wx基因測序結果表明，該基因第1內含子剪切供體位點為T。本研究利用浙恢7954和93-11Wx基因第1內含子剪切供體位點間的多態性，通過分子標記輔助選擇的方法，將來源于93-11的Wx等位基因導入浙恢7954，獲得了直鏈淀粉含量下降至18%左右的改良材料，大大提高了受體材料的食用品質。改良后的浙恢7954可作為親本用于今后高產優質雜交組合的選育。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

浙恢7954作為改良的受體親本，93-11作為改良的供體親本。水稻材料在夏季和冬季分別種植于浙江省農業科學院杭州海寧基地和海南陵水基地，每行6株，植株間隔20 cm。

1.2 葉片基因組DNA的提取

基因組DNA提取參照Murray等[8]的方法進行。

1.3 PCR及AccⅠ酶切反應

參照蔡秀玲等[5]的方法并做適當修改。所用上游引物為Wx-AccI-F:5′-GCTTCACTTCTCTGCTTGTG-3′，下游引物為Wx-AccI-R:5′-CATGATTTAACGAGAGTTGAAC-3′。PCR體系為：2 ×TaqMaster Mix 10 μL，Wx-AccI-F和Wx-AccI-R各20 pmol，DNA模板1 μL，加無菌ddH2O補足到20 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

酶切反應采用NEB的產品試劑，每20 μL酶切體系加入：AccⅠ酶2 U，CutSmart Buffer 2 μL，PCR擴增產物10 μL，加無菌ddH2O補足到20 μL。37 ℃酶切1 h。酶切產物用2%的凝膠100 V電泳20 min。

1.4 谷粒外觀性狀的測量

采用萬深SC-E型大米外觀品質檢測分析系統，測量谷粒的粒長、粒寬以及長寬比等性狀，每次300粒，重復3次。取1 000粒谷粒使用METTLER TOLEDO公司的PL303101千分之一天平測量千粒重，重復3次。

1.5 谷粒加工品質的測定

根據國標GB1350—2009的方法測定種子的精米率和整精米率。

1.6 直鏈淀粉含量的測定

參照Juliano等[9]的方法做適當修改，具體方法為：谷粒去殼、脫糙，磨成粉，過100目篩，37 ℃過夜烘干。稱取25 mg樣品粉末，加入0.5 mL無水乙醇，加4.5 mL 1 mol·L-1的NaOH，沸水浴至粉末全部溶解。加水定容至50 mL，混勻。吸取2.5 mL，加入25 mL水，加0.5 mL 1 mol·L-1的乙酸，加入I-KI試劑0.5 mL，定容至50 mL，放置10 min，混勻，在620 nm處測光密度。同期的空白對照配置為：加入225 μL 1 mol·L-1的NaOH，加入25 mL水，加入1 mol·L-1乙酸0.5 mL，加入0.5 mL的I-KI試劑，定容至50 mL，使用BeckMan Coulter DU730分光光度計測量620 nm處的吸光度。標準曲線的繪制：在中國水稻研究所購得淀粉標樣，37 ℃過夜烘干，稱取25 mg，加入0.5 mL無水乙醇，加4.5 mL 1 mol·L-1的NaOH，沸水浴至粉末全部溶解。后續步驟和樣品步驟相同。

1.7 稻米食味品質的評測

選擇來自全國各地的志愿者20名，志愿者根據自己的口味喜好盲評打分，滿分10分。

1.8 SNP分型方法

采用Qiagen核酸提取試劑盒從水稻葉片中提取基因組，經RNA酶消化，確保DNA濃度≥50 ng·μL-1，總體積≥20 μL，D260/D280為1.8～2.1。將提取的DNA交由深圳市作物分子設計育種研究院做RiceSNP9K芯片掃描，平均每50 Kb約有1個SNP。芯片掃描結束后，分別對浙恢7954 vs L2和浙恢7954 vs L9進行了全基因組差異分析，并繪制了L2和L9的染色體重組圖譜。

2 結果與分析

2.1 親本浙恢7954、93-11中Wx基因型的鑒定及其種子直鏈淀粉含量

分別以浙恢7954和93-11的基因組DNA為模板，利用引物Wx-AccI-F、Wx-AccI-R進行擴增，獲得目的Wx基因片段。測序結果表明：浙恢7954中Wx基因第1內含子供體+1位點為G，93-11中Wx基因第1內含子供體+1位點為T。用同樣的引物進行PCR-AccI分析，結果如圖1所示，該對引物PCR擴增Wx基因產物大小為458 bp。GG型Wx基因(浙恢7954)PCR擴增產物經過AccⅠ酶切后，會形成2個大小分別為57和401 bp的片段，而TT型Wx基因(93-11)的PCR擴增產物無法被AccⅠ有效酶切，兩者之間的差異可用2%的凝膠電泳區分。上述結果表明，浙恢7954與93-11的Wx基因第1內含子確實存在多態性(圖1)，PCR-AccI分子標記可用于區分這一多態性。

分別對浙恢7954、93-11成熟種子的直鏈淀粉含量進行了測定，結果顯示，浙恢7954的直鏈淀粉含量為24.8%，93-11的直鏈淀粉含量為16.8%(圖3)，表明GG型水稻的直鏈淀粉含量明顯高于TT型。

2.2 PCR-AccI分子標記輔助育種

如圖2所示，以浙恢7954為母本，93-11為父本，先經過1次雜交，雜交后代與浙恢7954回交5次。每次回交前用PCR-AccI分子標記檢測Wx基因的基因型，選擇GT型單株與浙恢7954回交，BC5F1自交1代，F2群體再用PCR-AccI分子標記檢測Wx基因的基因型，篩選TT型單株(圖2)。2016年夏季，在大田種植多份TT型改良株系及單株，篩選株型、生育期等各項綜合指標與受體親本浙恢7954較一致的TT型株系4個，并對其直鏈淀粉含量進行了測定。結果表明，所選的4個TT型株系的直鏈淀粉含量均與供體親本93-11相近(圖3)。本文選擇其中2個株系L2和L9為代表(直鏈淀粉含量分別為17.1%和19.5%)，進行下一步分析。

1～8分別為回交BC5F2群體的不同單株；M為DNA Marker1-8， BC5F2 progeny; M， DNA Marker圖1 PCR-AccI分析Fig.1 PCR-AccI analysis

圖2 分子標記輔助育種策略Fig.2 Strategy of molecular marker associated breeding

圖3 各水稻品種的直鏈淀粉含量Fig.3 Determination of amylose content of different rice varieties

2.3 谷粒的粒型和千粒重

粒型是一個與水稻產量、品質都息息相關的重要性狀。對L2、L9和2個親本的粒長、粒寬、長寬比及千粒重進行了測定，結果如圖4所示。親本93-11的長寬比和千粒重較浙恢7954大，說明2個親本在粒型和千粒重上存在著明顯差異。L2和L9在粒型和千粒重上與浙恢7954非常接近，與93-11存在著明顯差異。

2.4 精米率和整精米率

整精米率是最重要的稻米加工品質，與直鏈淀粉含量、食味品質和堊白度并列為稻米4項定級指標。L2和L9的精米率分別達到89.8%和88.4%，整精米率分別為87.0%和83.1%，與浙恢7954非常接近(圖5)。而供體親本的93-11的整精米率相對較低，這與其本身的粒長較長、長寬比較大有關。L2和L9的整精米率高，說明L2和L9與浙恢7954一樣，具有優良的加工品質。

2.5 稻米的食味品質

對稻米的食味品質進行盲評打分，新品種的綜合評分為7分，接近于93-11的7.4分，浙恢7954僅4.8分。說明在蒸煮品質上，改良的新品種相對于浙恢7954有較大提高。

2.6 浙恢7954改良系的全基因組背景掃描

通過SNP分型比較，對浙恢7954 vs L2和浙恢7954 vs L9進行了全基因組差異分析，并繪制出L2和L9的染色體重組圖譜(圖6)。結果表明，L2和L9的Wx基因所在的6號染色體1.8 Mb處都有93-11片段導入，證明這2個改良品種的TT型Wx基因確實來自于93-11。與此同時，除了Wx位點所在片段外，L2和L9在其他染色體上也分別有不程度的93-11片段導入。

圖4 谷粒的粒型和千粒重Fig.4 Grain shape and thousand-grain weight

圖5 谷粒的精米率和整精米率Fig.5 Measurement of head rice rate and milled rice rate

A，L9、L2、浙恢7954和93-11的全基因組關聯分析；B，浙恢7954與L9主要染色體SNP位點差異；C，浙恢7954與L2主要染色體SNP位點差異A， Genome-wide association study among improved varieties and their parents; B， SNP-typing between ZH7954 and L9; C， SNP-typing between ZH7954 and L2圖6 浙恢7954改良系的全基因組檢測Fig.6 Genome-wide association study of ZH7954 improved varieties

L2和L9來自浙恢7954的遺傳背景比重分別為93.7%和93.4%。L2和L9的相同點為，在1號、2號、5號和10號染色體上，兩者都為浙恢7954純合遺傳背景；不同點為，L2的93-11導入片段主要集中在3號、6號、9號、11號和12號染色體上，而L9的93-11導入片段主要集中在6號、7號、8號和9號染色體上。

3 討論

直鏈淀粉含量高低是決定稻米品質的關鍵因素之一。傳統育種方法改良這一性狀時，需要在分離群體中對收獲的種子進行直鏈淀粉含量測定，耗時費力，效率低下。究其原因，一方面，由于水稻種子是雙受精的產物，胚乳細胞受三倍體基因型的控制。另一方面，與株高等其他性狀的遺傳不同，品質性狀在雜交F1或其他雜合體植株上結的不同種子間存在著遺傳分離與基因劑量效應[10]。因此，用常規育種方法進行品質性狀改良就顯得較為繁瑣，這也是目前水稻品質改良落后于其他性狀改良的主要原因之一。而利用分子標記輔助選擇的方法改良稻米直鏈淀粉含量有以下優點：首先，該分子標記所檢測的Wx第1內含子供體+1位的多態性，是決定不同水稻品種直鏈淀粉含量的重要遺傳因素。其次，通過檢測植株的基因型來預知成熟種子中直鏈淀粉含量的高低，可避免繁瑣的品質測定工作。最后，以單株為單位，在營養生長期即可預選單株作為雜交或繼續回交的親本，減少了盲目性，也無需等待植株結籽后再測定直鏈淀粉的表型，避免了遺傳分離與基因劑量效應的影響，可以大大提高育種效率。

浙恢7954是浙江省農業科學院自主培育的雜交水稻恢復系，它產量高，配合力強，株型、穗型、開花習性等綜合性狀優異，由其選育的II優7954、協優7954、錢優1號等雜交組合均獲得國家新品種審定。從2000年至今，上述3個雜交組合在全國推廣面積達360萬hm2，總計增收效益36億元。近年來，隨著高產優質水稻新品種的不斷呈現，浙恢7954在水稻品種的競爭中優勢逐漸喪失。即便如此，但就其穩產性和配合力而言，浙恢7954所配組合如今仍有競爭力。因此，很有必要在保留浙恢7954其他優異性狀的前提下，通過定向改良其食味品質，用改良型浙恢7954來延續原浙恢7954雜交組合的生命力，進一步挖掘浙恢7954的經濟和社會價值。本文利用水稻Wx基因的PCR-AccI分子標記，將9311的Wx等位基因(Wxb)導入浙恢7954中，獲得直鏈淀粉含量下降至約18%的TT型浙恢7954。從種子的粒長、粒寬、千粒重等指標來看，TT型浙恢7954的2個株系L2和L9的性狀更接近受體親本浙恢7954。而從口感測定的結果來看，TT型浙恢7954的口感明顯改善，綜合食味評分更接近供體親本93-11。通過SNP分型技術對L2和L9遺傳背景進行研究，發現2個品系的主要遺傳背景有93%來自于浙恢7954。推測L2和L9中控制浙恢7954粒型、千粒重、精米率和整精米率絕大多數主效位點都坐落在這93%的基因組內，而位于第6號染色體上控制直鏈淀粉含量的主效位點Wx，來自于供體親本93-11。雖然L2和L9還有7%的遺傳背景來自于93-11，但考慮到93-11本身也是性狀非常優異的品種，這些導入的片段對于L2和L9來講，成為遺傳累贅的可能性較小。接下來，將對這些改良型株系的雜交配合力、產量等性狀進行測定，以期選育出高產優質的雜交稻親本及其雜交組合。

作為第3代分子標記技術的SNP具有數量多、遺傳穩定等優點。而SNP芯片技術的發展則解決了傳統SNP檢測方法的數量少、效率低等缺點，可以快速、精確地分析出植物的全基因組遺傳圖譜，在構建作物遺傳圖譜方面具有其特有的優勢。近10年來，隨著技術和資源的發展，在基因組研究水平上發展出來的現代植物育種技術被稱為基因組育種，基因組育種可以讓育種人員更直觀地了解育種過程中植株的遺傳背景，方便其選育出理想的基因型和表型材料，因而具有廣泛的應用前景。

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(責任編輯 侯春曉)

Improving rice quality of ZH7954 by molecular marker-assisted selection

NIU Kaimeng1，2， XU Junbo2， ZHONG Liang2， WANG Hua2， ZHU Ying2，*

(1.CollegeofChemistryandLifeScience，ZhejiangNormalUniversity，Jinhua321004，China; 2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl，InstituteofVirologyandBiotechnology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

Zhehui7954 (ZH7954) is an elite restorer line with high combining ability for three-lineindicahybrid rice production. However， the amylose content of ZH7954 was high (25%)， which resulted in poor eating and cooking quality. Improvement of rice quality of ZH7954 was hard to achieve by using traditional breeding strategies. In this study， a codominant molecular marker named PCR-AccI was developed based on the G/T SNP at the first intron splicing site of riceWxgene which mainly determines the amylose biosynthesis in rice endosperm. Here， an elite parental line 93-11 with intermediate AC (17%) and T-typeWx(calledWxb) were used as donors. Two lines L2 and L9 were obtained with intermediate AC but similar phenotype to ZH7954 by backcross and molecular marker-assisted selection. Both of them had better eating and cooking quality than receptor line ZH7954， while the appearance quality， such as grain shape， grain weight and milled rice rate were almost identical to ZH7954. These results suggested that the quality of ZH7954 was successfully improved through combining the traditional breeding and marker assisted selection. Data from SNP-typing showed that less than 7% of genome from 93-11 was integrated to ZH7954 in both L2 and L9. The combining ability would be further tested and such intermediate lines might be the valuable materials to generate elite restorer line with high yield and good quality in the future.

ZH7954; amylose content;Wxgene; marker-assisted selection; SNP

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.08.01

2017-03-09

科技部國家重點研發計劃(2016YFD0100900)；浙江省自然科學基金委杰出青年基金項目(LR14C02001)

牛凱萌(1992—)，男，山東濱州人，碩士研究生，研究方向為稻米品質改良與分子育種。E-mail: niukaimeng47@163.com

*通信作者，朱英，E-mail: yzhuzaas@163.com

S511

A

1004-1524(2017)08-1227-07

牛凱萌， 徐俊波， 鐘亮， 等. 利用分子標記輔助選擇改良浙恢7954的稻米品質[J]. 浙江農業學報， 2017， 29(8): 1221-1227.