不同管理措施對高寒草甸土壤微生物氮素生理群數量影響研究

張建貴，蔣永梅，姚拓*，高亞敏，李海云，蘭曉君，田永亮，李建宏，張英

(1.甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016)

不同管理措施對高寒草甸土壤微生物氮素生理群數量影響研究

張建貴1，蔣永梅1，姚拓1*，高亞敏1，李海云1，蘭曉君1，田永亮1，李建宏1，張英2

(1.甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.青海大學農牧學院，青海 西寧 810016)

從微觀視野認識土壤氮素形成機理，為高寒草甸微生物生長和恢復提供科學依據。本研究采用平板表面涂抹法和稀釋法對瑪曲高寒草甸4種不同管理措施(不圍欄、圍欄、圍欄+施肥、圍欄+補播)土壤微生物氮素生理群數量進行了測定分析，結果表明，1)同一管理措施下，不同空間層次土壤微生物氮素生理群數量變化較大，具有明顯的垂直分布規律，0～10 cm和10～20 cm土層的數量均顯著高于20～30 cm土層(P<0.05)，一般前者是后者的1.23～4.03倍和1.11～2.25倍；且不同土壤微生物氮素生理群之間數量差異顯著，氨化細菌>反硝化細菌>硝化細菌>好氣性固氮菌>嫌氣性固氮菌。2)同一空間層次，不同管理措施土壤微生物氮素生理群間數量差異較大。土壤微生物氮素生理群數量以圍欄+施肥和圍欄+補播草地最高，圍欄草地次之，不圍欄草地最少。3)不同管理措施，土壤銨態氮和硝態氮含量隨著土層深度增加逐漸減少，但圍欄+施肥和圍欄+補播處理均顯著高于其他處理(P<0.05)。可見，圍欄+施肥和圍欄+補播措施對瑪曲高寒草甸土壤微生物氮素生理群數量和不同形態氮素含量有提高效果。

高寒草甸；土壤微生物；氮素生理群；管理措施

高寒草甸具有獨特的服務價值，特別是涵養水源、水土保持功能對整個黃河流域生態安全和可持續發展起著重要作用[1]。瑪曲草原既是青藏高原生態系統重要構成成分之一，又是黃河上游地區主要水源涵養地，享有“中華水塔”美譽[2]。高寒生態區草地具有氣候寒冷，水熱不同期和生態脆弱等獨特特性，破壞后難以恢復。近些年，瑪曲地區由于人口因素、經濟因素、制度因素和文化因素等制約，致使該地區不同程度地出現生態環境日益惡化，天然濕地草場大面積退化、沙化和鹽堿化[3-4]。放牧是草原畜牧業的主要經營方式之一，對于自然環境較為惡劣的高寒草甸而言，早牧、過牧常常導致草地植被的嚴重退化[5]。草畜極端不平衡，如何在提高草地生產力的基礎上遏制草地退化，是目前亟待解決的問題。

草地土壤微生物是草地生態系統分解者亞系統的重要組成部分，是植物養料轉化、有機碳代謝及污染物降解的驅動力，對土壤養分循環具有重要意義。草地土壤微生物的存在，能夠影響草地植被生長發育及改良土壤狀況[6]。土壤微生物氮素生理群可作為土壤質量變化、草地發育與演替的重要指標之一[7]。土壤微生物氮素生理群指具有同種功能的相同或不同形態的一類微生物，能將生物殘體水解為氨基酸和氨，將氨氧化為硝酸，還原一切硝酸鹽以及固定大氣中氣態氮素[6]。因此，土壤微生物氮素生理群具有為植物根際生境提供氮素、調節氮素平衡及氮素循環的作用，定量分析土壤微生物在草地生態系統中的分布與活動規律，可以揭示草地生態系統地下生理生態學的格局和過程，及形成草地管理實踐理論體系[8]。

國內外一些學者從不同角度出發，對高寒草甸保護、退化機理及退化后治理措施進行大量研究。劉若萱等[9]提出雖然大氣中氮含量很多，但很多植物不能直接轉化利用，然而某些固氮微生物具有固定大氣中氮素的能力。Mekuria等[10]研究表明，圍欄有利于植被恢復，也可改善土壤營養狀況；李文等[11]和魚小軍等[12]研究表明，經封育、灌溉及補播幾種方式改良荒漠草原后，補播改良草地效果顯著。盡管許多學者對高寒草甸的退化恢復進行了大量的研究，但有關草地土壤微生物氮素生理群數量分布的研究鮮有報道。本研究通過4種不同管理措施對瑪曲高寒草甸土壤氮素生理群數量及土壤銨態氮和硝態氮含量進行比較分析，旨在為探尋不同管理措施研究土壤微生物活動布局和植物作用機制及其改良、復壯和科學管理提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究地自然概況

本研究選擇瑪曲縣大水種畜廠(E 100°45′45″-102°29′00″，N 33°06′30″-34°30′15″)作為研究區域，境內海拔在3200～3500 m之間，地處青藏高原東部邊緣，位于甘肅省甘南藏族自治州西南部。瑪曲縣氣候屬明顯的高原大陸性高寒濕潤區。受海拔影響，高寒多風雨(雪)，無四季之分，僅有冷暖之別。冷季長達314 d，漫長而寒冷；暖季51 d，短暫而溫和。雨水集中，日照充足，輻射強烈，無絕對無霜期。年平均氣溫1.2 ℃，平均風速2.5 m/s，牧草生長期190 d。年平均日照2583.9 h，日照率為61%。瑪曲高寒草甸土壤為亞高山草甸土，草地類型以莎草科嵩草屬(Kobresia)和禾本科針茅屬(Stipa)、羊茅屬(Festuca)、早熟禾屬(Poa)的一些種及菊科風毛菊屬(Saussurea)、槖吾屬(Ligularia)和瑞香科狼毒屬(Stellera)等屬的植物為主，并伴有高山唐松草(Thalictrumalpinum)、莓葉委陵菜(Potentillafragarioides)、鈍裂銀蓮花(Anemoneobtusiloba)、細葉亞菊(Ajaniatenuifolia)、火絨草(Leontopodiumnanum)和花苜蓿(Medicagoruthenica)等[13]。

1.2 樣地設置及土壤樣品采集

2010年5月在研究區設置了4個等面積共為20 hm2樣地 (每個樣地內設3個重復)，采取了不圍欄(自由放牧)、圍欄、圍欄+施肥和圍欄+補播4種管理措施。自由放牧家畜為綿羊，放牧強度約為14只/hm2。施肥選用復合肥磷酸二銨撒施，施肥量為10 kg/hm2。選取當地常用的垂穗披堿草(Elymusnutans)、草地早熟禾(Poapratensis)和中華羊茅(Festucasinensis)，補播比例為6∶2∶2，總播量為10.2 kg/hm2。采樣時間為2010年8月，分別在各樣地內采用5點法，用土鉆分別采集0～10 cm、10～20 cm和20～30 cm的土樣，每個樣地5次重復，剔除植株根系和石頭等雜物，并將各點土樣分層混合，按四分法取1 kg左右新鮮土樣裝入滅菌信封袋或無菌聚乙烯袋并密封，土壤帶回實驗室后立即進行各類微生物分離(4 ℃保存不超過24 h)、計數及土壤氮素測定。

1.3 研究方法

將10 g新鮮土樣用無菌水配成不同濃度梯度懸浮液：接種于盛有滅菌固體的培養皿中，用無菌刮刀涂抹均勻，每個濃度3個重復，恒溫(28 ℃)培養3 d，選取每皿菌落數為15～150的1個稀釋度統計菌落數，采用平板表面涂抹法計數；將各梯度土壤懸浮液1 mL分別接入已滅菌含15 mL液體培養基的試管中，每個稀釋度設置3次重復。另取3支試管接種1 mL無菌水作為對照，于28～30 ℃人工氣候箱中培養14 d，檢查是否有菌生長，如有細菌生長，一般有氣泡出現，培養液渾濁，采用稀釋培養法測定并計算每g干土中的菌數[14-15]。

1.3.1 微生物氮素生理群數量測定 氨化細菌數量測定采用蛋白胨瓊脂培養基，好氣性固氮菌數量測定采用阿須貝(Ashby)培養基，均以平板表面涂抹法計數。計算公式[6]：N=M×鮮土重/干土重，其中：M=a×u/v，N為每g干土的菌數；M為每g鮮土的菌數；v為每個培養皿中加懸浮液體積(本研究為50 μL)；a為培養皿中平均菌落數；u為稀釋倍數。

硝化細菌數量測定采用改良的斯蒂芬遜(Stephenson)培養基，反硝化細菌數量測定采用組合培養基[14]，嫌氣性固氮菌數量測定采用玉米面培養基，采用稀釋法測定。每g干土中的菌數計算公式[6]：菌數=近似菌落數×稀釋倍數/干土(%)，其中，干土(%)=(干土重/鮮土重)×100。

1.3.2 土壤銨態氮和硝態氮測定 用四分法取出一部分新鮮土樣并過2 mm篩，帶回實驗室立即測定NH4+-N和NO3--N含量，NH4+-N采用氯化鉀浸提-靛酚藍比色法測定[16]；NO3--N采用酚二磺酸比色法測定[16]。

1.4 數據分析

采用Excel 2010整理、計算數據以及制作柱形圖，采用SPSS 19.0軟件進行方差分析(One-way ANOVA)、相關性分析。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物氮素生理群數量分布特征

2.1.1 氨化細菌數量分布特征 1)同一管理措施，不同空間層次土壤氨化細菌數量不同。上層(0～10 cm)均顯著高于下層(20～30 cm)(P<0.05)，0～10 cm氨化細菌數量是20～30 cm的2.01～2.65倍；10～20 cm氨化細菌數量是20～30 cm的1.43～1.98倍。2)不同管理措施，相同空間層次土壤氨化細菌數量不同。如0～10 cm圍欄+施肥顯著高于不圍欄、圍欄和圍欄+補播(P<0.05)。3)不同管理措施下，土壤氨化細菌總數量：圍欄+施肥>圍欄+補播>圍欄>不圍欄(圖1)。

圖1 不同管理措施下氨化細菌數量的空間動態Fig.1 Space dynamic of ammonifiers amount under different management measures NF: 不圍欄No-fenced; E: 圍欄Enclosed; EF: 圍欄+施肥Enclosed with fertilization; ES: 圍欄+補播Enclosed with sowing; 不同小寫字母表示同一土層不同管理措施差異顯著(P<0.05)。下同。Different small letters indicate significant differences at the 0.05 level among different management measures in the same depth of soil. The same below.

2.1.2 硝化細菌數量分布特征 1)同一管理措施，不同空間層次土壤硝化細菌數量不同。上層(0～10 cm)均顯著高于下層(20～30 cm)(P<0.05)，0～10 cm硝化細菌數量是20～30 cm的1.66～3.18倍；10～20 cm數量是20～30 cm的1.32～2.11倍。2)不同管理措施，相同空間層次土壤硝化細菌數量不同。如0～10 cm圍欄+施肥、圍欄+補播均顯著高于不圍欄和圍欄(P<0.05)。3)不同管理措施下，土壤硝化細菌總數量：圍欄+施肥>圍欄+補播>圍欄>不圍欄(圖2)。

2.1.3 反硝化細菌數量分布特征 1)同一管理措施，不同空間層次土壤反硝化細菌數量不同。上層(0～10 cm)均顯著高于下層(20～30 cm)(P<0.05)，0～10 cm反硝化細菌數量是20～30 cm的1.58～2.33倍；10～20 cm反硝化細菌數量是20～30 cm的1.43～1.83倍。2)不同管理措施，相同空間層次土壤反硝化細菌數量不同。如10～20 cm圍欄+施肥、圍欄+補播均顯著高于不圍欄和圍欄(P<0.05)。3)不同管理措施下，土壤反硝化細菌總數量：圍欄+補播>圍欄+施肥>圍欄>不圍欄(圖3)。

圖2 不同管理措施下硝化細菌數量的空間動態Fig.2 Space dynamic of nitrifiers amount under different management measures

圖3 不同管理措施下反硝化細菌數量的空間動態Fig.3 Space dynamic of denitrifying bacteria amount under different management measures

2.1.4 好氣性固氮菌數量分布特征 1)同一管理措施，不同的空間層次土壤好氣性固氮菌的數量不同。上層(0～10 cm)均顯著高于下層(20～30 cm)(P<0.05)，0～10 cm好氣性固氮菌的數量是20～30 cm的1.23～4.03倍；10～20 cm好氣性固氮菌的數量是20～30 cm的1.11～2.55倍。2)不同管理措施，相同空間層次土壤好氣性固氮菌數量不同。20～30 cm圍欄+施肥和圍欄+補播均顯著高于圍欄、不圍欄(P<0.05)。3)不同管理措施下，土壤好氣性固氮菌總數量：圍欄+補播>圍欄+施肥>圍欄>不圍欄(圖4)。

2.1.5 嫌氣性固氮菌數量分布特征 1)同一管理措施，不同的空間層次土壤嫌氣性固氮菌的數量不同。上層(0～10 cm)均顯著高于下層(20～30 cm)(P<0.05)，0～10 cm嫌氣性固氮菌數量是20～30 cm的1.56～3.70倍；10～20 cm嫌氣性固氮菌數量是20～30 cm的1.18～1.65倍。2)不同管理措施，相同空間層次土壤嫌氣性固氮菌數量不同。20～30 cm圍欄+施肥和圍欄+補播均顯著高于圍欄、不圍欄(P<0.05)。3)不同管理措施下，土壤嫌氣性固氮菌總數量：圍欄+施肥>圍欄+補播>圍欄>不圍欄(圖5)。

圖4 不同管理措施下好氣性固氮菌數量的空間動態Fig.4 Space dynamic of aerobic NFB amount under different management measures

圖5 不同管理措施下嫌氣性固氮菌數量的空間動態Fig.5 Space dynamic of anaerobic NFB amount under different management measures

2.2 不同管理措施對土壤銨態氮和硝態氮的影響

1)同一管理措施，不同的空間層次土壤銨態氮和硝態氮含量不同。0～10 cm和10～20 cm銨態氮和硝態氮含量均顯著高于20～30 cm。0～10 cm銨態氮和硝態氮含量分別是20～30 cm的1.48～1.72倍和2.48～3.21倍；10～20 cm銨態氮和硝態氮含量分別是20～30 cm的1.14～1.42倍和1.53～1.87倍。2)不同管理措施，銨態氮和硝態氮在0～10 cm圍欄+施肥均顯著高于圍欄+補播、圍欄和不圍欄(P<0.05)。3)不同管理措施下，土壤銨態氮(除20～30 cm外)和硝態氮總含量：圍欄+施肥>圍欄+補播>圍欄>不圍欄(表1)。

表1 不同管理措施對 NH4+-N和NO3--N含量的影響

NF: No-fenced; E: Enclosed; EF: Enclosed with fertilization; ES: Enclosed with sowing; 表中數據為3個重復的平均值±標準差；不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。Data in the Table are the average of three replicates±standard deviation; Different small letters mean significant differences atP<0.05 level.

2.3 土壤不同形態的氮素量與微生物氮素生理群數量的相關性

銨態氮和硝態氮含量與土壤氮素生理群數量均呈極顯著正相關關系(P<0.01)。不同管理措施，銨態氮含量與氨化細菌、硝化細菌、反硝化細菌、好氣性固氮菌和嫌氣性固氮菌數量呈極顯著正相關關系(P<0.01)，相關系數R值依次為0.786、0.873、0.781、0.808和0.820(圖6)；硝態氮含量與氨化細菌、硝化細菌、反硝化細菌、好氣性固氮菌和嫌氣性固氮菌數量呈極顯著正相關關系(P<0.01)，相關系數R值依次為0.841、0.725、0.708、0.780和0.747(圖7)。

3 討論與結論

草地群落植被的差異會引起土壤微生物氮素生理群數量的變化，土壤微生物氮素生理群具有固定大氣中氮素的能力，能將氣態氮素轉變為植物利用的形態，對土壤氮素補充和平衡、存在與調節，對土壤結構、肥力以及草地植物“四度一量”的恢復具有重要意義[16]。

圖6 銨態氮含量與微生物氮素生理群數量的相關性Fig.6 Correlation analysis between ammonium nitrogen content (ANC) and the number of nitrogen physiological microorganisms group

圖7 硝態氮含量與微生物氮素生理群數量的相關性Fig.7 Correlation analysis between nitrate nitrogen content (NNC) and the number of nitrogen physiological microorganisms group

不同空間層次高寒草甸土壤微生物氮素生理群數量具有明顯的垂直分布規律。這與何芳蘭等[17]、熊淑萍等[18]研究結果一致，這是因為草本植物根系多分布在表層土壤，而且根系是植物吸收營養的主要器官，也是微生物最活躍的活動場所。同時，根際各類群微生物趨向性聚居在植物根系并通過各自的代謝活動，分解轉化根系分泌物和脫落物，從而為植物生長創造了汲取豐富有效養分的環境[19]。此外，還與土壤氮素生理群自身的特性有關，表層土壤中聚積有大量的凋零物，有充分的營養源，加之水分、熱量、酸堿度和通氣狀況較好[20]，利于各類微生物的生長和繁殖。

不同管理措施土壤微生物氮素生理群數量差異很大。圍欄+施肥增加了該草地群落蓋度和草產量[13]，蘇潔瓊等[21]研究結果表明，施用復合肥磷酸二胺對高寒草甸植物群落的恢復具有明顯的效果。可能是因為施肥使草地土壤有機質含量升高，水熱條件和通氣狀況較好，有充分的營養源促進氮素生理群的生長，從而施肥對氨化細菌、硝化細菌和嫌氣性固氮菌的數量比其他管理措施顯著增多。圍欄+補播增加草地的覆蓋度、草群密度、高度和地上生物量，使土壤的養分狀況得到改善，使反硝化細菌和好氣性固氮菌快速生長，代謝旺盛，繁殖速度加快[22]。圍欄減少了家畜的踐踏和肆虐啃食以及人為活動的干擾，防止土壤退化和結塊，從而提高水分利用率，促進草地植被恢復，為氮素生理群的生長繁殖提供了適宜的水分、氧氣和營養物質[23]。不圍欄由于家畜過度采食和踐踏，優良牧草品質和數量降低，然而雜草大量出現，破壞草地；同時土壤較緊實，通氣狀況差，偏酸性(pH 6.78)[13]，故氮素生理群數量少。

不同管理措施對土壤氮素形態含量影響不同。不同形態氮素量的高低主要受土壤環境條件、微生物種類、放牧、施肥和補播等因素的影響[24-26]。在高寒草甸地區，由人類生產活動干擾，一定程度破壞草地生長，加劇養分流失[27]。載畜量超過一定承受能力，使生物群落結構破壞，適口性差，富含高氮量的植物減少，富含低氮量的植物增多，進而抑制氮素循環。通過不同管理措施對土壤銨態氮和硝態氮含量的研究，草地圍欄后草產量增加，一方面，聚集了大量的凋落物，土壤表面枯落物和根系分泌物的輸入，提高土壤全氮含量[16]；另一方面，提高土壤微生物活性，增強土壤氮素轉化利用，提高氮素利用率。此外，植物枯體在微生物分解過程中產生的酸類物質，可以使土壤中那些難溶性物質向有效性方向轉化，從而促進有效氮的增加[28-29]。

土壤微生物數量與土壤氮素形態有相關性。土壤微生物數量與銨態氮含量相關性最大、最小的細菌數量分別是硝化細菌、反硝化細菌，與硝態氮含量相關性最大、最小的細菌數量分別是氨化細菌、反硝化細菌。這一結果顯示，大量的氨化細菌使該草地死亡的生物體含氮物質轉化為氨基酸和氨的過程相對較為容易[30-31]，可能是一些好氣性固氮菌、嫌氣性固氮菌將氣態氮轉化成銨態氮補充了銨態氮的含量，也有可能氨化作用所產生的銨鹽本身已適于作為綠色植物的養料，但綠色植物更適合的養料是硝酸鹽[32]。

綜上可見，4種不同管理措施不同程度改變土壤微生物數量及不同形態氮素量，其中，土壤圍欄+施肥和圍欄+補播恢復效果最好，能夠大幅度提高土壤微生物數量，在瑪曲高寒草甸土壤恢復和管理過程中可作為最佳的管理措施進行推廣。然而，本研究只考慮了氮元素相關的土壤微生物數量因素，在今后的研究中需要增加土壤微生物量和微生物固氮量指標,進一步完善。

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Effects of different management strategies on the number of soil nitrogen microorganism groups in an alpine meadow

ZHANG Jian-Gui1, JIANG Yong-Mei1, YAO Tuo1*, GAO Ya-Min1, LI Hai-Yun1, LAN Xiao-Jun1,TIAN Yong-Liang1, LI Jian-Hong1, ZHANG Ying2

1.CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinisteryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China； 2.AgricultureandAnimalHusbandryCollegeofQinghaiUniversity,Xining810016,China

Understanding the micro-mechanisms of soil nitrogen formation can provide useful information about the growth and recovery of microorganisms in an alpine meadow. In this study, soil samples were collected from the alpine meadow in Maqu from sites under four types of management; unfenced, enclosed, enclosed with fertilization, and enclosed with sowing. The number of soil nitrogen microorganism groups was determined by the plate colony count and MPN (most probable number) methods. The number of nitrogen bacterial groups decreased with increasing soil depth at all sites. The number of nitrogen bacterial groups was significantly higher in the 0-10 cm and the 10-20 cm soil layers (P<0.05) than in the 20-30 cm soil layer (1.23-4.03 times and 1.11-2.25 times that in the 20-30 cm soil layer, respectively). There were also significant differences in abundance among the microorganism groups. The groups were ranked, from most abundant to least abundant, as follows: ammonifiers>denitrifying bacteria>nitrifiers>aerobic nitrogen-fixing bacteria (aerobic NFB)>anaerobic nitrogen-fixing bacteria (anaerobic NFB). In the same soil layer, there were significant differences in the abundance of bacterial groups among the different management strategies. The nitrogen bacterial groups were most abundant in the enclosed fertilized grassland and enclosed sown grassland, less abundant in enclosed grassland, and least abundant in the unfenced grassland. The amounts of ammonium nitrogen and nitrate nitrogen decreased with increasing soil depth in all treatments, and were significantly higher in enclosed fertilized grassland and enclosed sown grassland (P<0.05) than in enclosed grassland and unfenced grassland. These results show that, in the alpine meadow, the number and types of soil microorganisms and the contents of different forms of nitrogen can be increased by enclosure with sowing and enclosure with fertilization.

alpine meadow; soil microorganism; the physiological bacteria group of nitrogen; management measures

10.11686/cyxb2016433

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-11-15；改回日期：2017-02-10

國家自然科學基金資助項目(31360584)和國家科技支撐技術(2009BAC53B06)資助。

張建貴(1991-)，男，甘肅靖遠人，在讀碩士。E-mail: zhangjgyx@yeah.net*通信作者Corresponding author. E-mail: yaotuo@gsau.edu.cn

張建貴, 蔣永梅, 姚拓, 高亞敏, 李海云, 蘭曉君, 田永亮, 李建宏, 張英. 不同管理措施對高寒草甸土壤微生物氮素生理群數量影響研究. 草業學報, 2017, 26(8): 65-73.

ZHANG Jian-Gui, JIANG Yong-Mei, YAO Tuo, GAO Ya-Min, LI Hai-Yun, LAN Xiao-Jun, TIAN Yong-Liang, LI Jian-Hong, ZHANG Ying. Effects of different management strategies on the number of soil nitrogen microorganism groups in an alpine meadow. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(8): 65-73.