多肽固相合成中2-CTC樹脂首位氨基酸連接效率影響因素的研究

(大連民族學院 生物技術與資源利用 教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600)

多肽固相合成中2-CTC樹脂首位氨基酸連接效率影響因素的研究

李容慶，張麗影 ，于 洋，藍浩銘，曲 寧

(大連民族學院 生物技術與資源利用 教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600)

采用五種結構差異較大的Fomc保護氨基酸分別與2-氯三苯甲基氯樹脂進行縮合反應，通過考察最終產物氨基酸取代度的差異探討影響2-CTC樹脂首個氨基酸連接效率的因素。結果表明，保護氨基酸的位阻效應對于連接反應的影響占首位；當氨基酸結構類似時，氨基酸分子中取代基的誘導效應對樹脂取代度的影響更強。

2-氯三苯甲基氯樹脂；Fomc-aa-CTC；取代度

多肽固相合成法(Solid Phase Peptide Synthesis, SPPS)因具有操作簡便，副產物少，易于純化等優點，自創立以來被廣泛應用到多肽的合成研究中，尤其是可作為藥物使用的短肽的實際生產[1-3]。在固相合成過程中，載體樹脂的結構及性能對肽鏈之間的聚集及縮合反應的進行影響巨大，進而影響目標肽的產率和純度。目前肽固相合成中最常用的樹脂有Wang 樹脂、HMBA-AM樹脂、PAM樹脂和2-氯三苯甲基(2-CTC)樹脂等。2-CTC樹脂因能有效抑制外消旋及二酮哌嗪生成等副反應的發生[4-6]、反應條件較其他樹脂更為溫和以及產物純度高等，目前已逐步成為多種多肽藥物工業化生產的載體[7]。當采用2-CTC樹脂作為載體合成肽時，首位Fomc保護的氨基酸與樹脂的連接效率直接影響到后續保護氨基酸的用量以及最終目標肽的產率。因此，本論文選擇五種不同結構的Fomc保護氨基酸與2-CTC樹脂進行取代反應，考察了樹脂的溶脹情況及保護氨基酸的結構對最終2-CTC樹脂取代度的影響，為今后以2-CTC為載體固相合成多肽提供一些理論支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

紅外光譜分析：美國IR Prestige-21型紅外光譜儀，KBr壓片法；紫外分光光度計：日本島津UV-2450型紫外光譜儀。

2-氯三苯甲基氯樹脂(2-CTC樹脂)，Fomc-Gly-OH，Fomc-Tyr-OH，Fomc-Phe-OH，Fomc-His(Trt)-OH，Fomc-Asp(OtBu)-OH，吉爾生化(上海)有限公司；N,N-二異丙基乙胺(DIEA)，上海阿拉丁試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、無水甲醇、乙醇均為分析純，天津科密歐化學試劑有限公司；哌啶，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Fmoc-aa-CTC樹脂的制備

樹脂溶脹：取1mmol 2-CTC樹脂傾入反應容器內，DCM溶脹一定時間，隨后用20mL DMF洗滌3次，每次2min，抽干。

首位氨基酸的連接：將2mmol Fmoc保護的氨基酸，冰浴條件下溶解在DMF中的DIEA(2mL/12mmol)溶液分別加入反應器其中，室溫下氮氣吹掃反應2h，隨后用20ml DMF洗滌3次，每次2min。制得Fmoc-aa-CTC。

封閉未反應位點：用20mL DCM: 甲醇: DIEA=80: 15: 5的溶液洗滌樹脂2次，每次10min。用無水甲醇(10mL)洗滌3次，每次2min。室溫減壓干燥至恒重。

1.2.2 Fmoc氨基酸連接CTC樹脂的替代度檢測

稱取干燥恒重的Fmoc-aa-CTC，2份各10.0mg，分別置于1.5mL的離心管中。向離心管中加入1mL，20%的哌啶/DMF溶液。室溫震蕩20min，脫去Fmoc保護基。取200μL上清液置于3mL比色皿中，用DMF定容，搖勻待測。取200 μL 20%的哌啶/DMF溶液置于3mL比色皿中，用DMF定容搖勻，作為空白對照。在紫外分光光度計301nm處測定吸光光度(A)，并根據下式計算樹脂取代度。

式中，A為3次測取吸光度值的平均值；15為稀釋倍數；e為Fmoc結構基團在301nm處的特征吸收值；m為稱取樹脂質量(單位為mg)；S為每克樹脂中連接的氨基酸的毫摩數。取平均值測得Fmoc-aa-CTC樹脂的取代度。

2 結果與討論

2.1 Fmoc-aa-CTC紅外光譜分析

(a)Fomc-Gly-CTC; (b)Fomc-Asp(OtBu)-CTC; (c) Fomc-His(Trt)-CTC; (d)Fomc-Phe-CTC; (e)Fomc-Tyr-CTC

圖1為五種Fomc保護的氨基酸與2-CTC樹脂反應后產物的紅外光譜譜圖，其中(a)-(e)分別代表Fomc-Gly-CTC、Fomc-Asp(OtBu)-CTC、Fomc-His(Trt)-CTC、Fomc-Phe-CTC和Fomc-Tyr-CTC。2-CTC樹脂(圖2)是在聚苯乙烯微球表面連接多個2-氯三苯甲基氯基團。其與Fomc保護氨基酸連接后，在樹脂中引入了肽鍵，因此可通過檢測各樹脂紅外光譜圖中是否出現羰基以及亞氨基的特征峰來確定是否將Fomc保護氨基酸成功連接到2-CTC樹脂上。

圖2 2-CTC樹脂

從圖1(a)-(e)中可見，Fomc-aa-CTC樹脂分別在1734.00、1732.07、1724.36、1724.36和1728.29 cm-1處出現了非常明顯的羰基特征吸收峰，在3429.43、3431.36、3423.64、3427.50和3429.43 cm-1處出現了亞氨基的特征吸收峰。證明在2-CTC樹脂上成功連接了Fomc保護的氨基酸。因氨基酸結構的差異，各峰出現的位置稍有不同

2.2 氨基酸結構對Fmoc-aa-CTC樹脂取代度的影響

選擇五種性質差異較為明顯的Fomc保護氨基酸分別與2-CTC樹脂進行縮合反應，保護氨基酸的種類、結構及最終樹脂的取代度分別列于表1。從表中可知，Fomc-Gly-OH在五種保護氨基酸中體積最小，在與2-CTC樹脂反應過程中，其空間位阻最小，因此Fmoc-Gly-CTC取代度最高，為0.824 mmol/g；Fomc-His(Trt)-OH和Fomc-Asp(OtBu)-OH除Fomc保護基外，分子中還存在著氨基保護劑和羧基保護基，分子體積較大，因此它們二者最終的取代度明顯減小。而Fomc-Tyr-OH和Fomc-Phe-OH的差別主要在苯環上存在的羥基，羥基的誘導效應使Fomc-Tyr-OH與2-CTC反應時的親核能力增強，因此最終產物的取代度高于Fomc-Phe-OH。從五種Fmoc-aa-CTC樹脂取代度結果可見，位阻效應對于縮合反應的影響占首位；當氨基酸結構類似時，氨基酸分子中取代基的誘導效應占主導。

表1 保護氨基酸的結構及Fmoc-aa-CTC樹脂的取代度

2.3 樹脂溶脹時間對Fmoc-aa-CTC樹脂取代度的影響

2-CTC樹脂以交聯的聚苯乙烯微球為載體，在其表面接枝2-氯三苯甲基氯形成能夠與Fomc保護的氨基酸連接的位點。在縮合反應進行前，需對2-CTC樹脂進行溶脹，樹脂充分溶脹，連接的基團最大伸展從而使反應位點最大程度的裸露在外，提高連接效率。本論文以Fomc-Phe-OH與2-CTC樹脂的連接反應為例，考察了樹脂溶脹時間對最終產物取代度的影響，結果列于表2。從表2中可以看出，隨著溶脹時間的延長，Fomc-Phe-CTC樹脂的取代度先增大，后減小，溶脹1h后反應得到的樹脂取代度最高，為0.798mmol/g。出現這種現象是因為，樹脂溶脹0.5h時還未達到最大溶脹，反應位點裸露不充分，因此取代度最小，隨著溶脹時間的延長，樹脂達到最大溶脹，但溶脹時間過長，樹脂表面連接的2-氯三苯甲基氯基團可能發生脫落，使反應活性位點減小，最終樹脂取代度降低。因此，制備Fmoc-aa-CTC樹脂時，最適溶脹時間為1h。

表2 不同溶脹時間下Fomc-Phe-CTC樹脂的取代度

3 結論

本文選擇五種結構不同的Fomc保護氨基酸分別與2-CTC樹脂進行縮合反應，制備了不同的Fmoc-aa-CTC樹脂，考察了氨基酸結構和樹脂溶脹時間對樹脂取代度的影響。紅外光譜表明，五種Fomc保護氨基酸均成功連接到2-CTC樹脂上。保護氨基酸的位阻效應對于縮合反應的影響占首位，但當其結構類似時，氨基酸分子中取代基的誘導占主導。縮合反應前樹脂的溶脹時間顯著影響著最終Fmoc-aa-CTC樹脂的氨基酸取代度，1h為最佳溶脹時間。

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(本文文獻格式：李容慶，張麗影 ，于 洋，等.多肽固相合成中2-CTC樹脂首位氨基酸連接效率影響因素的研究[J].山東化工，2017，46(04)：11-13.)

Study on the Influencing Factors of the First Amino Acid Linkage Efficiency with 2-CTC Resin in the Solid Phase Synthesis of Peptide

LiRongqing,ZhangLiying*,YuYang,LanHaoming,QuNing

(College Of Life Science, Key Laboratory of Biological and Chemical Engineering,State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education, Dalian 116600，China)

In order to explore the influencing factors of the first amino acid linkage effiiency of 2-Chlorotritylchloride resin in the peptide solid phase synthesis, five kinds of different Fomc protection amino acids were used to react with 2-CTC resin, and the substituting degree of five Fomc-aa-CTC were determined. The results showed that the steric effect of the protectied amino acids have greatest impact on the substituting degree. While when the protectied amino acids having similar structure, the inducing effect of substituents in the amino acid became more important.

2-Chlorotritylchloride Resin；Fomc-aa-CTC；substituting degree

2016-12-07

大連民族學院大學生創新訓練項目(X2013040)

通訊作者：張麗影，zhangly@dlnu.edu.cn。

TQ464.7

A

1008-021X(2017)04-0011-03