楊梅素對精氨酸激酶結構與功能的影響

褚 靖，汪勁松，張新潮，王衛東，潘繼承

(湖北師范大學生命科學學院，湖北 黃石 435002)

楊梅素對精氨酸激酶結構與功能的影響

褚 靖，汪勁松，張新潮，王衛東，潘繼承

(湖北師范大學生命科學學院，湖北 黃石 435002)

精氨酸激酶(arginine kinase，AK)是無脊椎動物能量代謝關鍵酶，楊梅素是一種黃酮類物質，具有多種生物活性。本文研究的是楊梅素對AK結構和功能的影響，采用AK活性分析、熒光光譜、圓二色光譜等技術研究楊梅素對精氨酸激酶結構與功能影響。研究結果表明：楊梅素可以有效地抑制AK活性，并導致AK二級結構和構象發生明顯變化。為設計開發生物殺蟲劑提供了理論依據。

楊梅素； AK ； 抑制劑 ； 結構； 功能

精氨酸激酶 (Arginine Kinase，AK) 是無脊椎動物體內參與細胞能量代謝的一種磷酸原激酶，是磷酸原激酶家族中的重要一員。 通過催化可逆性的反應

在ATP和精氨酸之間運輸高能磷酸鍵，以此來調節細胞內ATP的水平[1-3]。反應產生的ADP可以作為合成ATP的前體物質，磷酸精氨酸可以作為合成ATP的高能磷酸鍵供體，通過這個可逆反應來維持體內ATP的穩態[4-6]。AK是節肢動物體內唯一的磷酸原激酶，在昆蟲肌肉劇烈運動時，磷酸精氨酸是唯一能在合成ATP時提供磷酰基的供體。當昆蟲劇烈運動時，可以提供大量能量，且能維持ATP的恒定水平[4，7-9]，當昆蟲靜止時，磷酸精氨酸又可以作為能量緩存庫[10]。綜上所述，AK是無脊椎動物能量代謝的關鍵性酶，它控制了無脊椎動物的整個生命活動的能量系統，維持無脊椎動物體內的能量動態平衡，AK的活性對無脊椎動物的生命活動至關重要。抑制AK的活性，能有效抑制無脊椎動物的能量代謝，使無脊椎動物的能量代謝過程發生紊亂，最終導致無脊椎動物的死亡。黃酮類物質是一種廣泛分布在植物界的多酚類物質，是柑橘類水果和其他食物的主要成分，在許多國家作為健康飲食[10]。黃酮類物質具有多種生物學功能，包括抗癌癥，防癌癥，抗骨質疏松，降血脂，降血壓，有益于心腦血管等功能。本文報道的是黃酮類物質楊梅素對精氨酸激酶結構與功能的影響，以期為開發新型生物殺蟲劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

含有AK基因大腸桿菌Rosseta，由本實驗室構建并保存；LB培養基( 1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0)；IPTG ( 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷) 購自Sigma公司，瓊脂糖親和柱(Ni)購自Novagen公司，其它所用試劑均為國產分析純。

1.2 實驗儀器

Ultrospec 4300 pro型紫外分光光度計(Amersham bioscience)，熒光分光光度計F4500，圓二色光譜儀J-810，AKTA Purifier層析儀，高壓滅菌鍋(型號ZDX-35，上海申安醫療器械廠)

1.3 實驗方法

AK的制備：取本實驗室已構建成功的含有pET-21b-AK的E.coli BL21甘油菌20 μL接種于6 mL的LB試管培養基(已加入氨芐，工作濃度為100 μg/mL)，置于37 ℃搖床，恒溫培養12 h；向大體積LB培養基中加入0.5%已活化好的菌液，置于37 ℃搖床，恒溫培養2-3 h；擴大培養至菌液OD值在0.6～0.8之間時，向菌液中加入IPTG使其工作濃度為0.2 mM，置于20 ℃搖床，恒溫培養12 h；將誘導后的菌液離心(5000 rmp，10 min)收集細胞沉淀，以蒸餾水洗沉淀一次；將細胞沉淀重懸于細胞裂解液中，于冰浴中超聲破壁，于4 ℃，離心(12000 rpm，10 min)，取上清，即為粗蛋白提取液；采用His-tag/Ni親和層析方法純化，SDS-PAGE分析。

圓二色光譜分析：終濃度為22 μM的AK與不同濃度的黃酮類化合物混勻，于37 ℃恒溫水浴30 min，測定圓二色光譜。

熒光光譜分析：終濃度為22 μM的AK與不同濃度的黃酮類化合物混勻，于37 ℃恒溫水浴30 min，激發波長295 nm, 掃面波長范圍300-400 nm, 測定其內源熒光。ANS熒光檢測：向上述體系中各加入1～3 μL ANS(蛋白濃度約為ANS濃度的25倍)，避光反應30 min, 參數設定為激發波長380 nm, 掃描波長范圍400～600 nm,測定ANS熒光光譜。

AK活性分析：將黃酮類化合物與AK混勻，置于30℃水浴10 min，參照文獻[11]測定AK活性。

2 研究結果

2.1 AK活性分析

圖1 黃酮類化合物與AK反應后測活曲線

由圖1可以分析出楊梅素抑制AK活力的能力最強，其次是黃芩苷，槲皮素，山奈酚，小檗堿，而甘草酸二鉀并沒有表現出抑制AK活力的效果。

2.2 內源熒光圖譜

圖2 楊梅素與AK作用的內源熒光圖

由圖2可以看出，隨著楊梅素濃度的增加，內源熒光強度下降，表明楊梅素導致AK色氨酸殘基(Trp)微環境改變。

2.3 ANS熒光圖譜

圖3 不同濃度的楊梅素對AK的ANS熒光發射強度的影響

由圖3可以看出，AK與不同濃度楊梅素反應之后，其外源熒光峰強逐漸減弱，并且呈濃度依耐性，隨著楊梅素濃度的增加，峰強越來越小，這說明AK與楊梅素作用之后其表面的疏水性減弱。

2.4 圓二色光譜

圖4 楊梅素AK與作用的圓二色光譜

由圖4可以看到，加入楊梅素與AK作用之后，AK在215nm、222nm處的負橢圓度消失，AK的α螺旋、β折疊都有明顯減少，表明楊梅素對AK的二級結構有明顯影響。

3 討論

上述研究結果表明，楊梅素、黃芩苷、槲皮素、山奈酚、小檗堿等化合物對精氨酸激酶都表現出不同程度的抑制能力，其中楊梅素展現出的抑制AK的能力最強，進一步的研究結果表明，2×10-4M楊梅素對AK活性的抑制率可以達到70%。圓二色和熒光光譜研究結果表明，楊梅素可以導致AK二級結構及其構象發生顯著改變。上述研究結果為設計新型殺蟲劑提供了一定的理論依據。

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(本文文獻格式：褚 靖，汪勁松，張新潮，等.楊梅素對精氨酸激酶結構與功能的影響[J].山東化工，2017，46(04)：39-40，45.)

The Effects of Myricetin on Arginine Kinase's Structure and Function

ChuJing,WangJinsong,ZhangXinchao,WangWeidong,PanJicheng

(College of Life, Hubei Normal University, Huangshi 435002, China)

Arginine Kinase (AK) plays the key role in invertebrate energy metabolism. Myricetin is a kind of flavonoids compounds, with multiple biological activities. This paper focused on the effects of myricetin on AK's structure and function by the means of activity assay, fluorescence and circular dichroism spectrum. The research results indicated that myricetin could effectively inhibit AK's activity and cause the obvious conformation changes, which also provide important clues for rational designing and developing biological insecticide.

myricetin; arginine kinase; structure;function

2016-12-28

褚 靖(1990—), 湖北孝感人，碩士研究生,從事蛋白質結構與功能的研究；通信作者：潘繼承，教授。

Q55

A

1008-021X(2017)04-0039-02