獼猴桃潰瘍病菌拮抗菌篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

田雪蓮，尹顯慧,*，龍友華，蔡 滔，李 洪

獼猴桃潰瘍病菌拮抗菌篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

田雪蓮1，尹顯慧1,*，龍友華1，蔡 滔2，李 洪1

（1.貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，貴州 貴陽(yáng) 550004）

目的：從不同地區(qū)獼猴桃根際土壤中篩選拮抗獼猴桃潰瘍病菌的菌株，優(yōu)化其產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件，為獼猴桃潰瘍病的生物防治提供潛在的資源菌。方法：采用平板稀釋法從獼猴桃根際土壤中分離獲得菌株，采用抑菌圈法篩選拮抗菌；通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定；并采用單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件。結(jié)果：從土壤中共分離到288 株放線菌，其中編號(hào)為NA-TXL-1的菌株對(duì)獼猴桃潰瘍病菌的拮抗效果最佳，采用預(yù)防法、治療法進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵原液的防治效果分別為73.06%、55.62%，初步鑒定該菌株為抗生鏈霉菌。其最佳發(fā)酵配方和培養(yǎng)條件為：乳糖30 g/L、酵母粉3 g/L、NaCl 1 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO40.01 g/L，種子培養(yǎng)基為乳糖-酵母粉培養(yǎng)基，接種量為2%，起始pH值為7.0，發(fā)酵原液、上清液、重懸液分別培養(yǎng)5、14、5 d。結(jié)論：經(jīng)鑒定，拮抗菌株為Streptomyces antibioticus。在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，該菌株對(duì)獼猴桃潰瘍病菌具有更好的拮抗效果。

獼猴桃潰瘍病菌；拮抗菌；篩選；鑒定；發(fā)酵條件優(yōu)化

獼猴桃潰瘍病是由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）引起的細(xì)菌性病害[1]。其發(fā)生具有范圍廣、傳播快、致病性強(qiáng)、防治難度大等特點(diǎn)，可在短期內(nèi)造成大面積樹(shù)體死亡，特別是感病品種，當(dāng)年病害暴發(fā)，當(dāng)年或第二年造成全園毀滅慘重?fù)p失的現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮，現(xiàn)已被列為中國(guó)森林植物檢疫性病害，是獼猴桃生產(chǎn)和發(fā)展中的毀滅性病害[2]。目前防治該病主要采取綜合防治和化學(xué)防治相結(jié)合的方法，但防治效果都不理想，特別是化學(xué)農(nóng)藥的過(guò)量使用，使Psa對(duì)一些化學(xué)農(nóng)藥（如硫酸銅和農(nóng)用鏈霉素）產(chǎn)生抗藥性，更對(duì)人類(lèi)健康造成危害[3]。因此，開(kāi)展以生物防治為主的綜合防治研究，對(duì)該病的防治具有重要意義，而篩選高效拮抗菌是進(jìn)行生物防治研究的基礎(chǔ)[4]。

利用拮抗菌防治獼猴桃潰瘍病已有研究報(bào)道。盛存波等[5-6]從根際土壤中篩選出了芽孢桿菌B56-3，稀釋100倍的B56-3發(fā)酵濾液采用噴霧和病斑刮除涂抹相結(jié)合的方法對(duì)潰瘍病的治療效果和病斑治愈率分別可達(dá)86.5%和91.4%。邵寶林等[7]從土壤中分離出防治效果較好的蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）B2。Tu Xuan等[8]篩選出內(nèi)生放線菌gCLA4，21 d的gCLA4對(duì)Psa相對(duì)防治效果可達(dá)66.7%。黃以超等[9]篩選出鏈霉菌屬的孢桿鏈霉菌（Streptomyces sporovirgulis）TGNBSA5，進(jìn)一步研究表明是TGNBSA5的發(fā)酵液中分離出的代謝產(chǎn)物苯甲醇對(duì)Psa有抑菌作用。但目前利用微生物資源對(duì)獼猴桃潰瘍病進(jìn)行生物防治的研究還較少。

本研究從不同地區(qū)獼猴桃根際土壤中篩選出一株對(duì)獼猴桃潰瘍病菌有較好拮抗作用的生防菌株，并優(yōu)化了拮抗菌的發(fā)酵條件，以期為該病的生物防治增加新的生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

土壤：2014年11月分別在貴州省修文縣、大方縣、三穗縣、六盤(pán)水，四川蒼溪縣獼猴桃園中采集土壤樣品，風(fēng)干后進(jìn)行菌株分離。

供試植株品種為貴長(zhǎng)獼猴桃。

供試菌株：從修文縣久長(zhǎng)鎮(zhèn)獼猴桃發(fā)病植株上分離，經(jīng)16S rDNA鑒定為獼猴桃潰瘍病菌，基因登記號(hào)為KX769816。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

高氏一號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO40.01 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 拮抗菌的分離篩選

分離：稱(chēng)取土壤10 g，加入有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，200 r/min振蕩60 min，即成10-1菌懸液，然后從所得菌懸液中吸取1 mL加入有9 mL無(wú)菌水的試管中，依次稀釋到10-4和10-5的菌懸液。取0.1 mL 10-4和10-5的菌懸液均勻涂布于高氏一號(hào)、NA平板上，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，然后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)5、2 d，挑取形態(tài)特征相異的單個(gè)菌落，經(jīng)培養(yǎng)純化后作為供試菌株。

初篩：將純化保存的放線菌、細(xì)菌活化后，采用噴霧法進(jìn)行初篩。具體操作如下：將活化的放線菌、細(xì)菌分別接種于高氏一號(hào)、NA培養(yǎng)基中央，于28 ℃培養(yǎng)3 d、6 h后，將過(guò)夜培養(yǎng)16 h的獼猴桃潰瘍病菌1×108CFU/mL菌懸液對(duì)其進(jìn)行噴霧，培養(yǎng)24 h后觀察有無(wú)抑菌圈、測(cè)量抑菌圈大小，篩選出有明顯抑制作用的拮抗菌菌株，編號(hào)保存。

復(fù)篩：取初篩中抑菌效果較好的放線菌，先在高氏一號(hào)平板上活化，后接種于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、120 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)7 d后，獲得發(fā)酵原液。以分離到的致病力最強(qiáng)的獼猴桃潰瘍病菌株為靶標(biāo)菌，采用抑菌圈法測(cè)定其抑菌活性，重復(fù)3 次。28 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑大小，本實(shí)驗(yàn)中所指的抑菌圈直徑均為有效抑菌圈直徑，根據(jù)公式（1）計(jì)算。

式中：濾紙片直徑為6 mm。

1.3.2 拮抗菌NA-TXL-1的鑒定

拮抗菌株的形態(tài)特征[10-11]及生理生化特性的鑒定參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[12]方法進(jìn)行，并與《放線菌的分類(lèi)和鑒定》[13]中相關(guān)菌株特征進(jìn)行比較。16S rDNA序列分析采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取T3-5菌株基因組DNA。采用通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’進(jìn)行菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)回收，交上海生工生物工程有限公司純化并測(cè)序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST程序?qū)λ鶞y(cè)序列進(jìn)行比對(duì)分析，選擇GenBank中與之同源性較高菌種的模式菌株16S rDNA序列，利用Clustal X1.8軟件對(duì)其進(jìn)行多重比對(duì)，分析菌株T3-5與參比菌株之間的序列相似度，并通過(guò)MEGA 4.0軟件的Maximum Parsimony構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行Bootstrap分析檢驗(yàn)，重復(fù)1 000 次。

1.3.3 拮抗菌NA-TXL-1發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.3.1 不同種子培養(yǎng)基對(duì)NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

6 種不同初選種子培養(yǎng)基見(jiàn)表1，每組處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，按照雙層瓊脂法[14]測(cè)定抑菌活性。

表1 6 種初選種子培養(yǎng)基成分Table 1 Compositions of six seed culture media used for primary screening

1.3.3.2 不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

在培養(yǎng)條件不變的情況下，分別用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘油和乳糖等量代替高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中的可溶性淀粉；分別用蛋白胨、牛肉浸汁、硫酸銨、草酸銨、酵母粉等量代替高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中的KNO3；分別用KCl、MgSO4等量代替高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中的NaCl，按照1.3.3.1節(jié)的方法測(cè)定，重復(fù)3 次，確定最佳碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽。

1.3.3.3 營(yíng)養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)

選擇最佳碳源（乳糖）和氮源（酵母粉）以及無(wú)機(jī)鹽（NaCl）的含量共3 個(gè)因素，設(shè)置3 個(gè)水平，選用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)（表2），發(fā)酵實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，抑菌活性按照1.3.3.1節(jié)的方法測(cè)定，將3 次的平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析后獲得最佳發(fā)酵配方。

表2 正交試驗(yàn)因素和水平Table 2 Code and level of factors used fororthogonal array design

表2 正交試驗(yàn)因素和水平Table 2 Code and level of factors used fororthogonal array design

水平因素A乳糖含量/（g/L）B酵母粉含量/（g/L）C NaCl含量/（g/L）1 2010.5 2 3021.0 3 4032.0

1.3.3.4 不同培養(yǎng)條件對(duì)NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

接種量：將NA-TXL-1置于最佳種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后，轉(zhuǎn)接于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，接種量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)5 d后測(cè)抑菌活性；起始pH值：分別調(diào)成5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，28 ℃振蕩在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后測(cè)抑菌活性；培養(yǎng)時(shí)間：將NA-TXL-1接種于優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，接種量0.2%，28 ℃、160 r/min培養(yǎng)，于第5、8、11、14、17、20天分別測(cè)發(fā)酵原液、上清液、重懸液的抑菌活性。

1.3.4 拮抗菌NA-TXL-1的盆栽實(shí)驗(yàn)

當(dāng)獼猴桃實(shí)生苗長(zhǎng)出4～6 片真葉時(shí)，選取生長(zhǎng)比較健壯、植株大小相似的獼猴桃，根系帶土同時(shí)將葉片剪去一半移栽到塑料桶中。實(shí)驗(yàn)將拮抗菌發(fā)酵液分別配制成發(fā)酵原液（濃度1×108CFU/mL）、上清液（經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾）、重懸液（培養(yǎng)原液離心后，棄上清液，經(jīng)滅菌水清洗2 次，濃度1×108CFU/mL）、對(duì)照（無(wú)菌水）共4 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)5 次，于2015年2月下旬進(jìn)行。

預(yù)防法：采用噴霧處理的方法，噴施待測(cè)發(fā)酵濾液，每隔5 d噴施一次。噴施3 次后，于7 d后采用針刺法接種獼猴桃潰瘍病菌（每個(gè)處理接種部位30 個(gè)），接菌后保濕48 h，之后進(jìn)入常規(guī)管理。接種30 d后測(cè)量病斑的直徑，并計(jì)算發(fā)病率和防治效果。

治療法：采用針刺法先接種獼猴桃潰瘍病菌，接菌后保濕48 h，之后每隔5 d噴施一次拮抗菌，共噴施3 次。接種30 d后測(cè)量病斑的直徑，并按公式（2）、（3）計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

其中，獼猴桃潰瘍病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)，無(wú)??；1級(jí)，輕病，1/3以下的枝條發(fā)病或者萎蔫死亡、或者主桿病斑不超過(guò)莖圍1/3；2級(jí)，中病，1/3～1/2的枝條發(fā)病或者萎蔫死亡、或者主桿病斑環(huán)繞莖圍1/3～1/2；3級(jí)，重病，1/2～3/4的枝條發(fā)病或萎蔫死亡、或者主桿病斑環(huán)繞莖圍1/2～3/4；4級(jí)，全株死亡。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離篩選

表3 拮抗菌對(duì)獼猴桃潰瘍病菌的抑菌活性Table 3 Antibiotic activity of antagonistic isolates against Pseudomonas syringaepv.actinidiae

圖1 拮抗菌NA-TXL-1抑菌效果Fig. 1 Inhibitory effect of strain NA-TXL-1

采用平板稀釋法從不同地區(qū)獼猴桃根際土壤中共分離出288 株放線菌、649 株細(xì)菌，采用噴霧法篩選出了16 株對(duì)獼猴桃潰瘍病菌有抑菌活性的拮抗放線菌（表3），其中抑菌圈直徑10～20 mm有9 株，20～30 mm有5 株，40～50 mm有2 株，為Jh16、NATXL-1，而分離出的649 株細(xì)菌對(duì)獼猴桃潰瘍病菌均無(wú)抑制效果。通過(guò)抑菌圈法復(fù)篩，表明菌株NA-TXL-1對(duì)獼猴桃潰瘍病菌的拮抗作用最顯著，初篩、復(fù)篩直徑分別達(dá)到50.3、21.0 mm（圖1）。

2.2 拮抗菌株NA-TXL-1的鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)特征

圖2 掃描電子顯微鏡下拮抗菌株NA-TXL-1的形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of strain NA-TXL-1 under SEM

拮抗菌株NA-TXL-1在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上呈白色卵圓形，菌落緊密，不透明，表面皺褶，常以鏈狀排列，菌落灰色，有黃色素產(chǎn)生。在掃描電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，孢子絲螺旋形，長(zhǎng)圓形，表明光滑，纖細(xì)直長(zhǎng)，相互纏繞，基內(nèi)菌絲多分支，不斷裂，孢子上有泡狀物和膨大物（圖2）。

2.2.2 菌株生理生化特性由表4可知，拮抗菌NA-TXL-1能產(chǎn)生H2S、黑色素，能使牛奶凝固，但不能使明膠液化、淀粉水解，纖維素不分解；能夠利用葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖，但不能利用L-阿拉伯糖、D-甘露醇。而標(biāo)準(zhǔn)Streptomyces antibioticus能產(chǎn)生輕度明膠液化、淀粉水解不明顯，拮抗菌NA-TXL-1實(shí)驗(yàn)中由于現(xiàn)象不明顯故判定為陰性。

表4 拮抗菌株NA-TXL-1的生理生化實(shí)驗(yàn)Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strain NA-TXL-1

2.2.3 16S rDNA鑒定

圖3 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的NA-TXL-1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of strain NA-TXL-1 based on 16S rDNA sequences

NA-TXL-1菌株經(jīng)測(cè)序分析，16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 300 bp，測(cè)序結(jié)果提交GenBank注冊(cè)，登錄號(hào)為KX822009。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性檢索，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。通過(guò)Maximum Parsimony系統(tǒng)分析，NA-TXL-1與S. antibioticus（NRRL B-1701）聚在一起，支持率為100%。綜合形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA序列分析，將拮抗放線菌NA-TXL-1鑒定為抗生鏈霉菌（S. antibioticus）。

2.3 拮抗菌NA-TXL-1發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 不同種子培養(yǎng)基對(duì)NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

圖4 不同種子培養(yǎng)基對(duì)菌株NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig. 4 Effect of different seed media on inhibitory activity of submerged cultured NA-TXL-1

由圖4可知，拮抗菌NA-TXL-1以E為種子培養(yǎng)基時(shí)，菌體生長(zhǎng)較好，對(duì)獼猴桃潰瘍病菌的抑制作用最顯著，抑菌圈為22.3 mm，較D高氏一號(hào)培養(yǎng)基提高了12.77%，差異極顯著；其次為種子培養(yǎng)基D、C，而以A、B、F為種子培養(yǎng)基時(shí)，抑菌效果最差，差異不顯著。因此，該菌株的最適種子培養(yǎng)基為E。

2.3.2 不同碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽對(duì)NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響

圖5 不同碳源（A）、氮源（B）對(duì)NA-TXL-1發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig. 5 Effecst of different carbon and nitrogen sources on inhibitory activity of submerged cultured NA-TXL-1

以所選6 種碳源的培養(yǎng)基得到的NA-TXL-1菌株發(fā)酵原液對(duì)獼猴桃潰瘍病菌均有一定的抑菌活性，其中以乳糖為碳源的發(fā)酵液抑菌效果最好，抑菌圈大小均值為22.3 mm，大于高氏一號(hào)中可溶性淀粉的抑菌圈（20.3 mm），但差異不顯著；其次由高到低依次是甘油、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖（圖5A）。因此，選用乳糖作為碳源。所選用的6 種氮源中，以酵母粉為氮源的發(fā)酵液具有最好的抑菌效果，抑菌圈為23.0 mm，其中酵母粉與牛肉浸汁的抑菌效果均優(yōu)于對(duì)照（KNO3），而硫酸銨抑菌活性較差，酵母粉與硝酸鉀差異極顯著（圖5B）。因此，選用酵母粉作為氮源。選用NaCl、KCl、MgCl2作為無(wú)機(jī)鹽，其抑菌圈直徑分別為20.0、16.7、17.3 mm，NaCl與其他處理差異顯著，因此選用NaCl作為無(wú)機(jī)鹽。

2.3.3 拮抗菌NA-TXL-1營(yíng)養(yǎng)條件的優(yōu)化

表5 拮抗菌NA-TXL-1發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)及結(jié)果Table 5 Orthogonal array design with experimental results for optimization of culture medium for enhanced antagonistic activity of

表5 拮抗菌NA-TXL-1發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)及結(jié)果Table 5 Orthogonal array design with experimental results for optimization of culture medium for enhanced antagonistic activity of

試驗(yàn)號(hào)A乳糖含量/（g/L）抑菌圈直徑/mm 12010.521.0±0.6 22021.019.7±0.3 32032.020.7±0.7 43011.022.3±0.3 53022.022.0±0.6 63030.521.7±0.3 74012.020.3±0.3 84020.521.0±0.6 94031.023.8±0.7 k120.46721.20021.233 k222.00020.90021.667 k321.43321.80021.000 R1.5330.9000.667 B酵母粉含量/（g/L）C NaCl含量/（g/L）

由表5可知，3 個(gè)因素對(duì)獼猴桃潰瘍病菌的抑菌圈影響大小為A乳糖含量＞B酵母粉含量＞C NaCl含量，最佳水平組合為A2B3C2。因此確定NA-TXL-1發(fā)酵培養(yǎng)基配方為乳糖 30 g/L、酵母粉 3 g/L、NaCl 1 g/L、K2HPO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO40.01 g/L。

2.3.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

圖6 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株NA-TXL-1發(fā)酵濾液抑菌活性的影響Fig. 6 Effect of different culture conditions on inhibition activity of submerged cultured NA-TXL-1

選擇合適的接種量有利于菌體形成群體優(yōu)勢(shì)而縮短延遲期。由圖6A可知，當(dāng)接種量在4%～10%，拮抗菌NA-TXL-1大量繁殖，但抑菌效果卻較差，抑菌圈直徑在4.3～10.3 mm之間，而按2%的接種量，其抑菌圈直徑最大，為20.8 mm，與其他處理差異極顯著。因此，選擇的最佳接種量為2%。

pH值會(huì)影響微生物對(duì)培養(yǎng)基中一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用及代謝物的合成，本研究在確定發(fā)酵培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵pH值進(jìn)行了優(yōu)化。從圖6B可以看出，當(dāng)pH值為5、10，拮抗菌NA-TXL-1未生長(zhǎng)繁殖，無(wú)抑菌效果，隨著pH值的升高，抑菌效果先升高后降低，在pH值為7時(shí)，抑菌效果最好，抑菌圈為24.0 mm，其次是pH值為8，抑菌圈為19.3 mm，說(shuō)明NATXL-1適合在中性偏堿的環(huán)境中生長(zhǎng)，其最適pH值為7。

合適的培養(yǎng)時(shí)間有助于獲得最佳的抑菌效果，確定發(fā)酵原液、上清液、重懸液最佳發(fā)酵時(shí)間。從圖6C可知，發(fā)酵原液、上清液、重懸液在不同培養(yǎng)時(shí)間抑菌效果有一定差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵原液、重懸液抑菌活性逐漸降低，上清液抑菌效果先增后降，其中培養(yǎng)5 d，菌體產(chǎn)生的抑菌活性成分較少，上清液抑菌效果不明顯，說(shuō)明拮抗菌NA-TXL-1在5 d時(shí)主要是菌體本身產(chǎn)生抑菌作用；培養(yǎng)5 d，發(fā)酵原液、重懸液抑菌效果均最佳，分別為24.3、17.7 mm，與培養(yǎng)8 d差異不顯著；但在11～20 d，發(fā)酵原液、重懸液抑菌效果均逐漸降低，其中重懸液在20 d時(shí)無(wú)抑菌活性；而上清液在14 d抑菌圈最大，為16.0 mm，其中11、17 d抑菌效果差異不顯著。

2.4 拮抗菌株NA-TXL-1的盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 拮抗菌NA-TXL-1不同處理液的盆栽實(shí)驗(yàn)Table 6 Effect of NA-TXL-1 in preventing and controlling Pseudomonas syringaepv.actinidiae in pot cultivated plants

由表6可知，拮抗菌NA-TXL-1采用預(yù)防法與治療法對(duì)獼猴桃潰瘍病的防控效果均較好。其中采用發(fā)酵原液噴霧防治效果最佳，預(yù)防法、治療法的防治效果分別為73.06%、55.62%，其次是重懸液，防治效果較差的是上清液，除了預(yù)防法中的發(fā)酵原液與重懸液差異不顯著，其他均達(dá)極顯著水平，說(shuō)明拮抗菌NA-TXL-1菌體對(duì)獼猴桃潰瘍病的防控效果最好，代謝產(chǎn)物次之。

3 討 論

目前，采用生防菌對(duì)植物病害進(jìn)行防治以其廣闊的應(yīng)用前景而迅速發(fā)展為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。鏈霉菌（Streptomyces）是一種可產(chǎn)生多種抗生素、天然代謝產(chǎn)物、植物激素等活性物質(zhì)的高等放線菌，對(duì)提高植物的抗病、抗逆性能具有重要作用，具有開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥的潛力[15-17]。目前已有學(xué)者分離到對(duì)植物病害取得良好防治效果的鏈霉菌。陸錚錚等[18]從煙草根圍土壤中篩選出3 株對(duì)煙草青枯病菌具有較好抑制效果的鏈霉菌。王飛等[19]分離出對(duì)香蕉枯萎病病原菌拮抗性能最好的諾爾斯氏鏈霉菌（S. noursei）8N-10。涂璇等[20]從植物內(nèi)生放線菌中篩選出對(duì)供試12 種靶標(biāo)真菌均具有較好的抑菌效果的淡紫灰鏈霉菌（S. lavendularectus）。本研究使用抗生鏈霉菌拮抗獼猴桃潰瘍病菌，報(bào)道抗生鏈霉菌拮抗植物病害，所獲得的菌株NA-TXL-1具有較高的殺菌活性，進(jìn)一步驗(yàn)證了鏈霉菌是植物病害生物防治的良好資源，具有較大的開(kāi)發(fā)潛能。

鏈霉菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)多為次級(jí)代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量的高低不僅與菌種自身的性能相關(guān)，而且還要有最佳的發(fā)酵條件，因此，發(fā)酵條件的優(yōu)化對(duì)鏈霉菌產(chǎn)生目標(biāo)代謝物必不可少[21]。本研究采用單因素和正交試驗(yàn)進(jìn)行NATXL-1菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化，結(jié)果表明NA-TXL-1菌株最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽分別為乳糖、酵母粉、無(wú)機(jī)鹽，初始pH 7、接種量2%時(shí)，發(fā)酵液的抑菌活性顯著提高。這與前人報(bào)道的淡紫灰鏈霉菌（S. lavendulae）[22]、極暗黃鏈霉菌（S. fulvissimus）[23]、加利利鏈霉菌（S. galilaeu）[24]產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的發(fā)酵條件有所不同，這說(shuō)明同一菌屬的不同種類(lèi)菌株產(chǎn)生拮抗活性物質(zhì)的種類(lèi)及代謝途徑有可能不同，從而導(dǎo)致培養(yǎng)條件的不同。此外，本研究對(duì)抗生鏈霉菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，但尚未考慮交互作用和發(fā)酵成本，故后續(xù)將重點(diǎn)放在發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的利用情況與發(fā)酵液活性之間的關(guān)系及大規(guī)模的發(fā)酵條件進(jìn)行研究。

鏈霉菌對(duì)植物病害的生防作用機(jī)制包括分泌抗菌物質(zhì)、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間、直接寄生病原菌和誘導(dǎo)植物抗性等方面[25-28]。本研究篩選出的抗生鏈霉菌NA-TXL-1，其發(fā)酵原液、上清液、重懸液均對(duì)Psa有較好的抑制作用，在培養(yǎng)5～11 d時(shí)，發(fā)酵原液抑菌活性優(yōu)于上清液，而14～20 d，上清液抑菌活性卻高于發(fā)酵原液，分析其可能的原因主要有兩方面：第一，抗生鏈霉菌NA-TXL-1開(kāi)始是直接寄生病原菌產(chǎn)生拮抗作用，而后是通過(guò)分泌的抗菌物質(zhì)產(chǎn)生拮抗作用；第二，優(yōu)化后的發(fā)酵條件更有利于該菌產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，發(fā)酵時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)，產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)增多。同時(shí)也說(shuō)明生防作用機(jī)制可能不是單方面的，而是幾種方式共同作用的結(jié)果，而NA-TXL-1生防機(jī)制可能是菌株直接寄生病原菌和分泌抗菌物質(zhì)共同作用。此外，本研究將對(duì)NA-TXL-1進(jìn)行抗菌物質(zhì)的分離純化與鑒定，并對(duì)活性物質(zhì)的抗菌機(jī)理進(jìn)行探索，以期為獼猴桃潰瘍病致病機(jī)理及田間防治研究提供理論支持。

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Screening, Identification and Optimization of Fermentation Conditions for Antagonistic Actinomycetes against Pseudomonas syringae pv. actinidiae

TIAN Xuelian1, YIN Xianhui1,*, LONG Youhua1, CAI Tao2, LI Hong1
(1. Instictute of Crop Protection, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. Guizhou Provincial Supervision and Testing Center for Agricultural Product Quality Supervision, Guiyang 550004, China)

Aims: To isolate and screen the antagonistic strains with inhibitory activity against Pseudomonas syringae pv. actinidiae from a soil sample collected from the rhizosphere of kiwifruit in different areas and to optimize the fermentation conditions for enhanced production of antibacterial substances. Methods: Antagonistic strains were isolated by pour plate method, screened by inhibition zone method, and identified by morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis. The optimal medium composition and fermentation conditions were optimized by onefactor-at-a-time and orthogonal array design methods. Results: A total of 288 actinomycetes strains were isolated, among which strain NA-TXL-1 exhibited the strongest inhibitory activity against Pseudomonas syringae pv. actinidiae. The effects of the fermentation broth in preventing and controlling Pseudomonas syringae pv. actinidiae in pot cultivated plants were 73.06% and 55.62%, respectively. Strain NA-TXL-1 was identified as Streptomyces antibioticus. The seed medium, inoculum size and initial pH value were optimized to be lactose-yeast power culture medium, 2%; and 7.0, respectively. The optimal culture medium consisted of 30 g/L lactose, 3 g/L yeast powder, 1 g/L NaCl, 0.5 g/L K2HPO4, 0.5 g/L MgSO4·7H2O, and 0.01 g/L FeSO4at initial pH of 7.0. The optimal culture times for harvesting fermentation broth, the supernatant, and resuspension were 5, 14, and 5 days, respectively. Conclusions: Strain NA-TXL-1 was identified as Streptomyces antibioticus, exhibiting stronger antagonistic effect under optimized fermentation conditions.

Pseudomonas syringae pv. actinidiae; antagonist; screening; identification; optimization of fermentation conditions

10.7506/spkx1002-6630-201716012

S476；Q939.9

A

1002-6630（2017）16-0079-07

2016-10-13

貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)資助項(xiàng)目（黔科合NY字（2009）3022）；貴陽(yáng)市科技局農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目（筑科農(nóng)合合同字第（2009）2-007）

田雪蓮（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橛泻ι锞G色治理及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：591358886@qq.com

*通信作者：尹顯慧（1978—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)橛泻ι锞G色治理及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：agr.xhyin@gzu.edu.cn

田雪蓮, 尹顯慧, 龍友華, 等. 獼猴桃潰瘍病拮抗菌篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 79-85. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716012. http://www.spkx.net.cn

TIAN Xuelian, YIN Xianhui, LONG Youhua, et al. Screening, identification and optimization of fermentation conditions for antagonistic actinomycetes against Pseudomonas syringae pv. actinidiae[J]. Food Science, 2017, 38(16): 79-85. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716012. http://www.spkx.net.cn