白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水抑菌特性及穩(wěn)定性研究

徐亞超，盛 杰，劉安軍,*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系，山東 威海 264200）

白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水抑菌特性及穩(wěn)定性研究

徐亞超1，盛 杰2，劉安軍1,*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.威海海洋職業(yè)學(xué)院食品工程系，山東 威海 264200）

以食品中幾種常見的腐敗菌和致病菌，包括金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、根霉、青霉、毛霉、曲霉為供試菌，研究白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水的抑菌效果及其穩(wěn)定性。采用牛津杯法測定抑菌活性；采用二倍稀釋法測定黃水對菌種的最低抑菌濃度；以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，研究pH值、溫度、紫外線、鹽、蔗糖含量和金屬離子種類對黃水抑菌穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：黃水對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌4 種細(xì)菌以及青霉、曲霉2 種真菌具有很好的抑菌活性，而對毛霉和根霉抑菌效果不明顯。以體積分?jǐn)?shù)計，黃水對4種細(xì)菌的最低抑菌濃度均為6.25%，對青霉和曲霉兩種真菌的最低抑菌濃度分別為1.56%和3.13%。黃水呈酸性時抑菌活性增強，呈堿性時抑菌活性稍有下降，但活性仍較高；經(jīng)高溫處理后，抑菌活性稍有下降；紫外線對其抑菌活性幾乎無影響；隨著糖含量和鹽含量的增加，抑菌活性稍有增強；金屬離子對其抑菌穩(wěn)定性幾乎無影響，而且Fe2+還有增強其抑菌活性的作用。

白酒發(fā)酵；黃水；抑菌特性；穩(wěn)定性

黃水是固態(tài)法釀造白酒過程產(chǎn)生的副產(chǎn)物，又稱黃漿水，為棕黃色微黏稠液體。在生產(chǎn)濃香型白酒時，以高粱或其他的谷作物如大米、小麥、豆類等為原料，加入曲種后送水于池內(nèi)，然后進行發(fā)酵[1]。原料中的淀粉經(jīng)過厭氧發(fā)酵，在酶和酵母的作用下生成酒[2-3]。在發(fā)酵過程中，微生物代謝所生成的水與酒醅中未被微生物利用的水分逐漸沉降，從而將酒醅中的有機酸、可溶性淀粉、氨基酸、單寧、還原糖和香味前體物質(zhì)等溶于其中，并沉積到窖底而形成黃水[4-5]。因此黃水中主要含有酸類、醛類、醇類和酯類等呈香呈味物質(zhì)[6-7]，還含有糖類物質(zhì)、含氮化合物、少量的色素及單寧等有機物[8]。由于生產(chǎn)白酒的各個企業(yè)所使用的原料種類、原料配比、窖齡和窖池質(zhì)量等因素的差異，導(dǎo)致各個企業(yè)產(chǎn)出的黃水其主要成分以及含量存在差異[9]（黃水的常規(guī)分析各指標(biāo)為：總固形物含量12.7～17.1 g/100 mL、酸度6.91～7.83 mg/L、淀粉含量2.11%～4.42%、還原糖含量2.23%～4.75%、酒精體積分?jǐn)?shù)3.22%～5.31%、pH 2.95～3.88、黏度35.2～51.7 Pa·s、總氮含量0.27%～0.35%、總酸含量23.8～38.2 g/L、總酯含量1.38～2.78 g/L、單寧及色素含量0.13%～0.23%[10]。黃水的化學(xué)需氧量為25 000～40 000 mg/L，五日生化需氧量為25 000～30 000 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過國家允許的廢水排放標(biāo)準(zhǔn)，部分廠家直接將黃水排放到河流中，這必然會嚴(yán)重污染環(huán)境[11]。因此，關(guān)于如何處理以及合理開發(fā)利用黃水資源的研究越來越受到釀酒行業(yè)的重視[12]。目前，對于黃水的應(yīng)用主要集中在用于勾調(diào)低檔白酒、養(yǎng)窖、培養(yǎng)人工窖泥、利用其中的有機酸釀造食醋或利用其中的氨基酸生產(chǎn)醬油等。

黃水中含有豐富的有機酸[13-14]，楊新力[15]研究發(fā)現(xiàn)，利用混合有機酸來充當(dāng)食品防腐劑比單一成分的有機酸在防腐方面有更明顯的效果。研究者對黃水進行簡單處理后用于醬油的防腐，取得了很好的效果。而對于黃水抑菌特性以及抑菌穩(wěn)定性的研究目前還鮮見報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃水由江蘇大風(fēng)歌酒業(yè)有限公司提供。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bascillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella enteritidis）、根霉（Rhizopus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）、毛霉（Mucor racemosus sp.）均由天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院實驗室保藏[16]。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌15 min，用于細(xì)菌的培養(yǎng)。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮切塊）300 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、氯霉素0.1 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，用于真菌的培養(yǎng)[17]。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-75SII立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH-8恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠；XW-80A微型漩渦混合器 上海滬西分析儀器廠；SHJ超凈工作臺 上海匯龍儀表電子有限責(zé)任公司；PHS-3C pH計 上海理達(dá)儀器廠；LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及菌懸液的制備

將供測試的細(xì)菌和真菌分別接種于牛肉膏蛋白胨和馬鈴薯葡萄糖固體斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，真菌置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，連續(xù)傳代2 次。將活化好的細(xì)菌分別挑取一環(huán)制成初始菌懸液。使用前，采用平板菌落計數(shù)法，將初始菌懸液稀釋成菌濃度為106～107CFU/mL的菌懸液[18]。霉菌用無菌生理鹽水將其產(chǎn)生的孢子從斜面洗下，置于離心管中，渦旋振蕩20 min，用已滅菌的脫脂棉過濾，制成初始菌懸液備用。使用前采用血球計數(shù)法，將初始菌懸液稀釋成菌濃度為106～107CFU/mL的菌懸液。

1.3.2 黃水抑菌活性的測定

采用牛津杯法[19-20]。在培養(yǎng)皿中倒入已融化的固體培養(yǎng)基，待其冷卻凝固后，加入100 μL 1.3.1節(jié)制備好的供試菌菌懸液，然后用無菌涂布棒涂布均勻。再用鑷子等距離、平穩(wěn)地將4 個經(jīng)滅菌的牛津杯放在涂布好的固體培養(yǎng)基平面上，用移液槍在其中3 個牛津杯中分別加入200 μL黃水，另一個牛津杯中加入200 μL無菌生理鹽水作為對照，每種菌種按上述方法平行操作3 次[21]。細(xì)菌置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，真菌置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取出后，對其抑菌圈直徑進行測量。抑菌圈直徑越大，表明抑菌效果越好。

1.3.3 黃水最低抑菌濃度的測定

采用二倍稀釋法。首先，準(zhǔn)備經(jīng)滅菌的并帶有棉塞的試管9 支，用記號筆編號1～9，先將每支試管中加入經(jīng)滅菌的液體培養(yǎng)基5.0 mL，再向第1支試管中加入黃水5.0 mL，充分混勻后取5.0 mL注入到第2支試管中，以此類推進行1∶2～1∶128的稀釋，使黃水的體積分?jǐn)?shù)分別為50.00%、25.00%、12.50%、6.25%、3.13%、1.56%、0.78%。最后第8支試管不加黃水，只加培養(yǎng)基和菌種作為陽性對照組，第9支試管中加入黃水5.0 mL，充分混勻后量取5.0 mL棄去，不加菌種作為陰性對照組。取1.3.1節(jié)制備好的菌懸液100 μL分別加入到1～8 號試管中充分混勻，每個樣品設(shè)3 個重復(fù)。細(xì)菌組置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，真菌組置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。當(dāng)陽性對照組試管內(nèi)呈渾濁狀，而陰性對照組試管內(nèi)呈透明狀時，觀察1～7號試管的透明度情況：若實驗組試管內(nèi)出現(xiàn)渾濁狀，則說明該稀釋倍數(shù)下的培養(yǎng)基內(nèi)有微生物生長；若試管內(nèi)為透明，則說明該稀釋倍數(shù)下沒有微生物生長。選出所用黃水體積分?jǐn)?shù)最低的透明管，該體積分?jǐn)?shù)即為對該菌種的最低抑菌濃度[22-24]。

1.3.4 黃水抑菌穩(wěn)定性測定

實驗以革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌為供試菌種。

1.3.4.1 pH值對黃水抑菌穩(wěn)定性的影響

分別用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，配制成pH值分別為5、6、7、8、9的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[25]。采用1.3.2節(jié)的方法進行抑菌活性的測定，以無菌水做空白對照，每個樣品做3個平行。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

1.3.4.2 溫度對黃水抑菌穩(wěn)定性的影響

將黃水分別在0、20、40、60、80、100、121 ℃條件下處理30 min，恢復(fù)至室溫后，采用1.3.2節(jié)的方法進行抑菌活性的測定，以無菌水做空白對照，每個樣品做3 個平行[26]。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

1.3.4.3 紫外線對黃水抑菌穩(wěn)定性的影響

將黃水分別在紫外燈下照射0、20、40、60、80、100、120 min后[27]，采用1.3.2節(jié)的方法進行抑菌活性的測定，以無菌水做空白對照，每個樣品做3 個平行。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

1.3.4.4 鹽和糖含量對黃水抑菌穩(wěn)定性的影響

向培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl（0.0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）和蔗糖（0%、2%、4%、6%、8%和10%），制成鹽和糖含量不同的微生物培養(yǎng)平板[28]。采用1.3.2節(jié)的方法進行抑菌活性的測定，以無菌水做空白對照，每個樣品做3 個平行。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

1.3.4.5 金屬離子種類對黃水抑菌穩(wěn)定性的影響

向黃水中分別加入Ca2+、Fe2+、Mg2+、Na+、K+5 種金屬離子溶液，并調(diào)節(jié)金屬離子的濃度為1 mol/L[29]，采用1.3.2節(jié)的方法進行抑菌活性的測定，以無菌水做對照，每個樣品做3 個平行。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃水的抑菌活性

表1 黃水對常見腐敗菌和致病菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of yellow water against common spoilage and pathogenic microbes

由表1可知，黃水對革蘭式陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較強的抑制效果，對青霉和曲霉也表現(xiàn)出較強的抑制效果，其抑菌圈直徑均達(dá)到了25 mm左右，而對根霉和毛霉無明顯的抑菌圈出現(xiàn)，表明對其抑菌效果不明顯或無抑菌效果。因此推斷，黃水對大部分細(xì)菌均有較強的抑菌活性，對于真菌而言，只對部分真菌存在抑菌活性。

2.2 黃水對常見菌的最低抑菌濃度

表2 黃水對常見菌的最低抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentration of yellow water against common bacteria and fungi

由表2可知，以體積分?jǐn)?shù)計，黃水對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌4 種細(xì)菌的最低抑菌濃度均為6.25%，對青霉和曲霉兩種真菌的最低抑菌濃度分別為1.56%和3.13%。由此可得，黃水對真菌的抑制效果強于細(xì)菌。

2.3 黃水抑菌穩(wěn)定性的測定結(jié)果

2.3.1 pH值對黃水抑菌活性的影響

由圖1可知，pH值對黃水的抑菌活性有影響，在pH 7的中性環(huán)境中，黃水對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為24.3 mm，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為25.9 mm。在酸性環(huán)境中黃水的抑菌作用增強，當(dāng)培養(yǎng)基的pH值為5時黃水對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別達(dá)到了36.5 mm和37.6 mm。在堿性環(huán)境中黃水的抑菌作用減

圖1 pH值對黃水抑菌活性的影響Fig. 1 Effect of pH on the antibacterial activity of yellow water

2.3.2 溫度對黃水抑菌活性的影響

圖2 溫度對黃水抑菌活性的影響Fig. 2 Effect of temperature on the antibacterial activity of yellow water

由圖2可知，隨著溫度的升高，黃水對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性稍有下降。在121 ℃的高溫條件下處理30 min后，黃水對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為22.6 mm和23.7 mm，抑菌活性仍很高。結(jié)果說明溫度對黃水的抑菌活性影響不大，黃水在抑菌方面具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.3.3 紫外線照射對黃水抑菌活性的影響

圖3 紫外線對黃水抑菌活性的影響Fig. 3 Effect of ultraviolet light on the antibacterial activity of yellow water

由圖3可知，黃水在經(jīng)過紫外線照射后，其抑菌活性幾乎沒有受到影響。經(jīng)紫外線照射120 min后，黃水對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑仍為25 mm左右，與未經(jīng)紫外線照射相比幾乎沒有變化。說明黃水對紫外線的照射呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性。因此，在食品生產(chǎn)過程中，可以在使用黃水進行防腐的同時，采用紫外照射進行相應(yīng)的殺菌處理。

2.3.4 鹽和糖含量對黃水抑菌活性的影響

圖4 鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對黃水抑菌活性的影響Fig. 4 Effect of sodium chloride on the antibacterial activity of yellow water

由圖4可知，鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)對黃水的抑菌活性有影響，鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.0%～2.5%的范圍內(nèi)時，隨著培養(yǎng)基中鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，黃水對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑由25 mm左右增加到28 mm左右。

圖5 糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對黃水抑菌活性的影響Fig. 5 Effect of saccharose on the antibacterial activity of yellow water

由圖5可知，糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0%～10%時，隨著糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，黃水的抑菌活性也稍有提升。這表明鹽和糖對黃水的抑菌活性有一定的增效作用，原因可能是糖和鹽能影響微生物生長的滲透壓，從而抑制細(xì)菌的生長。

2.3.5 金屬離子種類對黃水抑菌活性的影響

圖6 金屬離子對黃水抑菌活性的影響Fig. 6 Effect of metal ions on the antibacterial activity of yellow water

由圖6可知，與對照組相比，黃水中加入Ca2+、Mg2+、Na+和K+后，其抑菌活性無明顯變化。加入Fe2+后，黃水對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別由24.6 mm和25.8 mm增長到36.5 mm和39.2 mm，其抑菌活性明顯增強，原因可能是Fe2+本身對菌體的生長存在弱，當(dāng)培養(yǎng)基的pH值為9時黃水對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別降至21.5 mm和20.6 mm，但抑菌效果仍然較強。一定的抑制作用。由此可見，黃水的抑菌活性幾乎不受Ca2+、Mg2+、Na+和K+的影響，且Fe2+對黃水的抑菌活性還有一定的增強作用。因此，黃水可以應(yīng)用在含有Ca2+、Mg2+、Na+、K+和Fe2+金屬離子較豐富的食品中作為防腐劑使用。

3 結(jié) 論

黃水對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌、沙門氏菌均有較強的抑制作用。對青霉和曲霉也表現(xiàn)出較強的抑制效果，對根霉和毛霉無抑菌效果。由此可得出，黃水對實驗所用細(xì)菌均有較強的抑菌活性，對于真菌而言，只對部分真菌存在抑菌活性。

最低抑菌濃度實驗表明，黃水對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌4 種細(xì)菌的最低抑菌濃度均為6.25%。對青霉和曲霉兩種真菌的最低抑菌濃度分別為1.56%和3.13%。

抑菌穩(wěn)定性實驗表明，pH值對黃水的抑菌活性有影響，在酸性環(huán)境中黃水的抑菌作用增強，在堿性環(huán)境中黃水的抑菌作用減弱，但抑菌效果仍然較強。因此，在食品應(yīng)用中，應(yīng)用在pH值較低的食品中能更好的發(fā)揮其抑菌作用。溫度對黃水的抑菌活性影響不大，黃水在抑菌方面具有良好的熱穩(wěn)定性，因此，可以將其應(yīng)用在需要高溫蒸煮和高壓殺菌的食品當(dāng)中。黃水的抑菌活性幾乎不受紫外線照射的影響，因此，在食品生產(chǎn)過程中，可以在使用黃水進行防腐的同時，用紫外進行相應(yīng)的殺菌處理。鹽、糖對黃水的抑菌活性有一定的增效作用。原因可能是糖和鹽能影響微生物生長的滲透壓，從而抑制細(xì)菌的生長，因此，黃水在鹽和糖含量較高的食品中作為防腐劑使用能更好地發(fā)揮其抑菌作用。Ca2+、Mg2+、Na+和K+的加入對黃水的抑菌活性幾乎無影響，F(xiàn)e2+對黃水的抑菌活性卻有一定的增強作用，原因可能是Fe2+本身對菌體的生長存在一定的抑制作用。因此，黃水可以應(yīng)用在含有Ca2+、Mg2+、Na+、K+和Fe2+金屬離子較豐富的食品中作為防腐劑使用。

綜上所述，黃水具有較高的抑菌活性，而且抑菌活性穩(wěn)定性良好。黃水作為糧食發(fā)酵產(chǎn)物又具有較高的安全性，來源豐富[30]，而且還含有豐富的氨基酸以及醇類和酯類等呈香呈味物質(zhì)。因此，將黃水進行簡單地處理后，應(yīng)用到食品中作為天然防腐劑具有良好的前景，還能實現(xiàn)廢物利用。但由于黃水中成分復(fù)雜，對于究竟是其中的哪些成分起到了抑菌作用及其抑菌機理還需要進一步的探討與研究，以便對其在食品中的應(yīng)用提供充分的理論依據(jù)。

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Antimicrobial Properties and Stability of Yellow Water, a Byproduct of Chinese Liquor Fermentation

XU Yachao1, SHENG Jie2, LIU Anjun1,*
(1. College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2. Department of Food Engineering, Weihai Ocean Vocational College, Weihai 264200, China)

Several common food spoilage bacteria and pathogens, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella, Rhizopus, Penicillium, Mucor, and Aspergillus were used as test bacteria and fungi to explore the antimicrobial properties and stability of yellow water, a byproduct of Chinese liquor fermentation. Antimicrobial properties were measured by the Oxford cup method and minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by the double dilution method. Staphylococcus aureus and Escherichia coli were used as indicator bacteria to investigate the effects of pH, temperature, ultraviolet, sodium chloride, saccharose and metal ions on the stability of the antimicrobial. The results showed that yellow water could inhibit Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella, Penicillium and Aspergillus, but had little effect on the growth of Mucor and Rhizopus. The MIC values were 6.25% for all four species of bacteria, and 1.56% and 3.13% for Penicillium and Aspergillus, respectively. Antimicrobial activity of yellow water increased at acidic pH, and decreased slightly at alkaline pH, but it was still high. Antimicrobial activity of yellow water decreased slightly after high temperature treatment but was hardly affected by ultraviolet light. This antimicrobial activity was slightly enhanced with increased concentrations of sodium chloride and saccharose. Metal ions showed little effect on the stability of the antibacterial. Moreover, Fe2+could enhance the antimicrobial activity.

Chinese liquor fermentation; yellow water; antimicrobial properties; stability

10.7506/spkx1002-6630-201715020

TS201.3

A

1002-6630（2017）15-0122-05

徐亞超, 盛杰, 劉安軍. 白酒發(fā)酵副產(chǎn)物黃水抑菌特性及穩(wěn)定性研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(15): 122-126. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201715020. http://www.spkx.net.cn

XU Yachao, SHENG Jie, LIU Anjun. Antimicrobial properties and stability of yellow water, a byproduct of Chinese liquor fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(15): 122-126. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201715020. http://www.spkx.net.cn

2016-07-04

農(nóng)業(yè)部低鹽、低硝腌臘肉制品生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)裝備研究與示范項目（201303082-3）

徐亞超（1992—），女，碩士研究生，研究方向為功能性食品。E-mail：1136466907@qq.com

*通信作者：劉安軍（1963—），男，教授，博士，研究方向為功能性食品。E-mail：laj@tust.edu.cn