基于原子力顯微鏡研究p53蛋白與PBR322 DNA的相互作用

陳洋，王艷偉，楊光參

(溫州大學物理與電子信息工程學院，浙江 溫州 325035)

基于原子力顯微鏡研究p53蛋白與PBR322 DNA的相互作用

陳洋，王艷偉，楊光參*

(溫州大學物理與電子信息工程學院，浙江 溫州 325035)

腫瘤(癌癥)是由于細胞在復制過程中，DNA損傷不能修復導致細胞凋亡或者細胞無限增殖而形成的。DNA在細胞中轉錄和翻譯都會涉及蛋白與DNA的結合，腫瘤抑制蛋白也是參與這一過程的關鍵蛋白之一。然而，眾多研究發現，腫瘤抑制蛋白p53具有識別和修復損傷DNA的效果，對于細胞的凋亡、基因的保護和避免癌癥發生有著重要的意義。有研究表明，金屬鎂離子和鋅離子可以增強p53蛋白的結構穩定性和p53-DNA的親和力。因此，我們基于原子力顯微鏡(AFM)，直觀地呈現出p53蛋白與PBR322環狀DNA相互作用的圖像，同時發現p53蛋白可以使環狀DNA自身形成聚集或者相交。但是，對于長度相當的5 000bp的線狀DNA幾乎沒有這樣的效果，而對于20 000bp DNA不會出現這樣的現象。然而，在高濃度鎂離子環境下，環狀DNA會扭轉成為麻花狀，即形成超螺旋結構。這一現象，可為p53蛋白功能和作用機理研究提供指導，也為癌癥治療、癌癥藥物開發以及癌癥檢測方法提供啟發。

p53蛋白；金屬鎂離子；PBR322環狀DNA；相互作用；DNA超螺旋

目前來說，腫瘤依然難以攻克。腫瘤(癌癥)是由于細胞在復制過程中，DNA損傷不能修復導致的細胞無限增殖或者細胞凋亡而形成的[1-6]。眾多研究發現，在人類惡性腫瘤疾病中，腫瘤細胞中的p53基因至少有50%發生了突變[7]。但是，p53蛋白具有識別和修復損傷DNA的效果，從而達到抑癌作用。因此，p53蛋白也叫腫瘤抑制蛋白，是參與細胞復制的關鍵蛋白之一，對于細胞的凋亡、基因的保護和避免癌癥發生有著重要的意義[8-9]。

現在，眾多研究者對于p53蛋白的結構都有一致的認識，認為p53蛋白是由393個殘基構成的多域蛋白。這個多域蛋白可分為五部分，分別為：(1)N端域(N-terminal domain，N-ter)-末端轉錄活化區，能與一系列的蛋白結構結合，調節p53的轉錄功能[10-14]和其與DNA的解離[15]；(2)信號區，富含脯氨酸，有5個脯-X-X-脯重復順序，此區不是轉錄活化區所必須的，但對誘導細胞凋亡是必須的；(3)DNA特異性結合域(DNA binding domain，DBD)，也叫核心域(core domain)，可以特異性結合到DNA[16]；(4)四聚化域(tetramerization domain，Tet)；(5)C端域(C-terminal domain，C-ter)部分與DNA 非特異性結合[1，7，17]。學者們對于p53-DNA相互作用也提出了兩個滑動搜索機制：(1)一維滑動模式。p53蛋白持續與DNA保持接觸形式，沿著DNA滑動擴散[18-22]。(2)“Hopping”模式和“Jumping”模式。Hopping模式，是p53蛋白在一條DNA上跳躍行走。Jumping模式，是p53蛋白從一條DNA上跳躍到另外一條DNA上，這種情況很少發生[23-24]。一直以來，大家關注最多的是p53蛋白在DNA上的滑動機制。然而，p53蛋白與DNA相互作用的機制還沒有完全被搞清楚。可以通過p53蛋白與DNA相互作用的結果推演其作用機制，為完善此作用機制提供可能和方向。

金屬離子對于p53-DNA相互作用也有一定影響。比如一些有毒的離子(如汞、鎘、銅等)可以結合到p53蛋白，破壞p53蛋白的結構和p53蛋白與DNA的親和力。再比如鎂和鋅離子等可以增強p53蛋白的結構和p53蛋白與DNA的親和力[25-26]。

在本文中，我們基于AFM掃描p53蛋白與PBR322 DNA相互作用的圖像，直觀地展現了p53與環狀DNA的相互作用結果。研究發現，p53蛋白可以使環狀DNA自身形成聚集或者相交。而對于5 000bp DNA的效果很不明顯，對于20 000bp DNA則沒有這樣的現象。此外，也發現在高濃度鎂離子環境下，環狀DNA會扭轉成為麻花狀，即形成超螺旋結構。這一現象，可以為p53蛋白功能和作用機理研究提供啟示，也希望為癌癥治療、癌癥藥物開發以及癌癥檢測方法提供啟示。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料和樣品制備

1.1.1 人類全長p53蛋白和PBR322 DNA以及相關材料

實驗使用的人類全長p53蛋白購自美國Sigama-Aldrich公司，其母液濃度為200 ～ 600 ng/μL。P53蛋白母液包含50 mmol/L磷酸鈉和50 mmol/L氯化鈉，pH為7.5。P53蛋白的重組與表達都是通過大腸桿菌生產，并且通過SDS-PAGE方式檢測得知，其純度至少達到90%。實驗使用的PBR322 DNA(4 000bp，環狀)/5 000bp DNA/20 000bp DNA(NoLimits，Fermentas/Thermo Fisher Scientific， Burlinton， Ontario ，Canada)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，直接使用，沒有經過再次純化處理，其出廠時的母液濃度為500 ng/μL。溶液環境為1×TE 緩沖液，此緩沖液由10 mmol/L Tris-HCl和1 mmol/L EDTA組成，pH為7.6。配制緩沖液使用的去離子水是Milli-Q系統(美國Millipore公司生產)制備的，其中水的電導率小于1×10-6Ω-1cm-1。云母片被切成1.0 ～ 1.5 cm2正方形，在使用時即撕即用。其他實驗用藥品(比如Tris、氯化鎂等)均購自美國Sigma-Aldrich公司。

緩沖液pH是通過添加鹽酸調節到7.5的狀態，其pH的測量使用的是Sartorius Basic pH Meter PB-10。

1.1.2 AFM樣品制備

DNA對照組樣品的制備。DNA對照組中藥品是用500 ng/μL的DNA母液在5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2溶液(pH為7.5)中培育得到的。通常地，加入二價陽離子是用來將帶負電的DNA吸附到帶負電的云母片上[27- 28]。在此，鎂離子不僅起到吸附作用，而且也是研究對象之一。取0.4 μL DNA母液與119.6 μL 5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH為7.5)緩沖液混合，形成DNA濃度為1 ng/μL的溶液200 μL，然后，充分混合均勻，再冰浴30 min。之后，取30 μL的DNA對照組溶液滴到剛撕好的云母片(1 cm×1 cm)上，沉積3 min，使DNA粘附到云母片上。然后用50 μL的去離子水輕輕沖洗15次左右，以便沖去多余的雜質分子。再用氮氣輕輕地吹干，之后用AFM掃描成像。如圖1所示。

圖1 AFM樣品制備流程圖Fig.1 Flow chart of AFM sample preparation

P53-DNA復合物對照組樣品制備，操作方法與DNA對照組樣品制備一致，只是p53蛋白與DNA的配比不同。把p53蛋白和DNA濃度配比調制為2∶1，即p53蛋白濃度為2 ng/μL，DNA濃度為1 ng/μL。

1.2 實驗儀器、方法和數據處理

實驗時使用的AFM是購自德國JPK公司的NanoWizardⅢ AFM，配置有一個NanoWizard AFM 自動機器人和一臺控制器，還有控溫系統BioScience和NanoScience系統。使用的探針是NanoWorld公司生產的NCHR-50型探針，其詳細參數為：懸臂長為125 μm，寬度為30 μm ，厚度為4 μm ，彈性系數為42 N/m，共振頻率為320 kHz，硅質鍍鋁。將制作好的樣品，放置在AFM操作臺上，在常溫下的空氣中用AC mode(即輕敲模式、非接觸模式)模式掃描樣品。掃描尺寸為1.5 μm × 1.5 μm，掃描線率為1.0 Hz。對于每一個樣品，都選取不同的區域進行掃描，這樣可以減小溶液不均勻帶來的誤差。

得到的每張圖的像素為512×512。使用4.2版本的JPK Data Processing軟件對原圖進行相應且一致的處理，使用Image J軟件對圖像排版和編輯。

2 實驗結果與討論

2.1 p53蛋白與PBR322 DNA的AFM成像結果

使用AFM掃描得到Tris緩沖液培育的PBR322 DNA圖像，發現這些DNA形貌保持一致。如圖2a對照組PBR322 DNA AFM圖像，PBR322 DNA形貌都呈現自由舒展狀態。其中，溶液環境為5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH為7.5)，PBR322 DNA濃度為1 ng/μL。有時由于去離子水的沖洗，留存在云母片上的DNA形貌有些改變，但是，所有圖像中DNA呈現的形貌基本保持自由舒展狀態，這是因為DNA本身帶負電導致的[28-29]。

圖2b為p53-PBR322 DNA聚合物的AFM圖像。其中，溶液環境為5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH為7.5)，p53濃度為2 ng/μL，PBR322 DNA濃度為1 ng/μL。可以明顯看到PBR322 DNA由于p53蛋白粘附于環上的兩個點，致使PBR322 DNA出現兩個環或者更多環的現象，其自身交點增多，甚至有的直接聚集為棒狀。出現這樣的現象，是由于p53蛋白與DNA的靜電相互作用導致的。這也許是聚集的p53蛋白各自的C端分別粘附同一條DNA的不同位置所致。

眾所周知，二價鎂離子不能使DNA發生凝聚[30]。Liu等[31]的研究表明金屬離子可以增強組蛋白與DNA的自組裝現象。在他們的實驗中，金屬鎂離子具有增強組蛋白和DNA自組裝的作用；鈣離子卻具有不一樣的效果。在我們的實驗中，金屬鎂離子也呈現了同樣的效果。我們把緩沖液中鎂離子的濃度變為20 mmol/L，即緩沖液為5 mmol/L Tris 20 mmol/L MgCl2(pH為7.5)，用AFM掃描此緩沖液條件下培育的p53蛋白與PBR322 DNA混合物。培育混合物時，p53蛋白濃度為2 ng/μL，PBR322 DNA濃度為1 ng/μL。我們發現PBR322環狀DNA上的結點會更多，甚至出現麻花狀扭轉(如圖2c所示)。這樣的現象表明，高濃度的鎂離子可以促進p53蛋白與DNA凝聚現象，這也許是由于高濃度鎂離子增強了p53蛋白與DNA的親和力所致。

圖2 p53蛋白與PBR322 DNA AFM圖像(高度圖，1.5 μm ×1.5 μm)。Fig.2 AFM images of PBR322 DNA and p53 protein (Height images, 1.5 μm×1.5 μm).

2.2 p53蛋白與5 000bp和20 000bp DNA的AFM成像結果

使用AFM掃描Tris緩沖液分別培育的5 000bp DNA和20 000bp DNA，在AFM圖像中這些DNA形貌基本一致，都呈現自由舒展狀態(如圖3a、c所示)。其中，溶液環境為5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH為7.5)，DNA濃度為1 ng/μL。但是，對于5 000bp DNA來說，自身很少出現環狀或者交叉現象；對于20 000bp DNA，自身卻很容易出現交叉或疊加，進而呈現出環狀。這是由于20 000bp DNA比較長，自身重力比靜電相互作用力更強，從而導致交叉或疊加現象。而5 000bp DNA長度比較短，靜電相互作用起主導作用。

如圖3b、d所示，可以清晰看到5 000bp DNA和20 000bp DNA上都粘附有p53蛋白。其中，溶液環境為5 mmol/L Tris 3 mmol/L MgCl2(pH為7.5)，p53濃度為2 ng/μL，DNA濃度為1 ng/μL。圖3b中，p53蛋白多同時結合兩條DNA，很少出現一條DNA呈環狀的情況。甚少有區別于圖3a中的成環現象。也就是說，p53蛋白可以使5 000bp DNA成環或者交叉出現，但是效果很不明顯。

從圖3c、d中，可以明顯看到20 000bp DNA的形貌沒有變化，成環和交叉現象一致。主要區別在于圖3d中DNA上有p53蛋白，而圖3c中的DNA上沒有。因此，我們認為p53蛋白不能誘使較長的鏈狀DNA成環或者交叉。

圖3 p53蛋白與5 000bp DNA和20 000bp DNA的AFM圖像(高度圖，1.5 μm ×1.5 μm)。 Fig.3 AFM images of p53 protein and 5 000bp DNA/20 000bp DNA (Height images, 1.5 μm×1.5 μm).

3 結論

在p53蛋白與PBR322 DNA相互作用的AFM圖像中，可以直觀地看到p53與環狀DNA的相互作用結果。在鎂離子濃度為3 mmol/L，并且沒有p53蛋白時，可以很直觀地看到PBR322環狀DNA都呈現自由的環狀，基本沒有相交現象出現。當加入p53蛋白時，環狀DNA自身形成聚集或者相交，即環狀DNA自身出現更多的環，有的甚至呈現棒狀。對于5 000bp DNA有類似效果，卻很不明顯，對于20 000bp DNA沒有這樣的現象。但是，在高濃度(20 mmol/L)鎂離子環境下，環狀DNA會扭轉成為麻花狀，甚至出現超螺旋。我們認為，這一現象的出現有兩方面的原因：一個是p53蛋白與DNA間相互靜電的作用，另一個是高濃度鎂離子增強了p53蛋白與DNA之間的親和力。鎂離子可以與p53殘基結合，增強結構穩定性，并且可以增加殘基電荷量，使其可以與帶負電的DNA有更強的靜電相互作用力[25-26]。

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Study on interaction between p53 protein and PBR322 DNA based on atomic force microscopy

CHEN Yang, WANG Yan-wei, YANG Guang-can*

(School of Physics and Electronic Information, Wenzhou University, Wenzhou, 325035, China)

∶Tumor (cancer) is caused by the apoptosis or proliferation of cells when DNA damage cannot be repaired in time in the process of replication. The processes of DNA transcription and expression are all involved in the interaction of protein and DNA in living cells. And, tumor suppressor protein is also one of the key proteins involved in this process. However, many studies have found that the tumor suppressor protein p53 can recognize and repair damaging-DNA, which plays a significant role in cell apoptosis, gene protection and avoidance of cancer. Studies have shown that the structural stability of p53 protein and the affinity of p53-DNA can be enhanced by metal ions, such as magnesium and zinc ions. Therefore, based on atomic force microscopy (AFM), the interaction image of p53 protein and PBR322 ring DNA is visually presented. And, it is found that p53 protein can promote a ring DNA aggregation or cross in itself. However, this phenomenon occurrence is rare for linear DNA with the length of 5 000bp, and it is not occurrence in 20 000bp DNA either. However, protein p53 can make ring DNA to be a twist shape in high magnesium concentration solution, that is, the supercoil shape is formed. This phenomenon may provide guidance for the study on the function and mechanism of protein p53, as well as provide insights into cancer therapy, cancer drug development and cancer detection methods.

∶ protein p53；metal magnesium ions；PBR322 ring DNA；interaction；DNA supercoil

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.04.017

2017-03-22

國家自然科學基金(11274245, 10974146, 11304232)；溫州大學創新基金(3162015033)

陳洋(1990—)，男，碩士研究生，研究方向為生命現象中的凝聚態物理。E-mail: speedmatrix2006@126.com

*通信作者，楊光參。E-mail: yanggc@wzu.edu.cn

Q71

A

1002-4026(2017)04-0106-06