HPLC-DAD法測定牛奶中6種氟喹諾酮類藥物殘留的研究

楊 勇，姚天月，龔興旺

（黔西南民族職業技術學院，貴州 興義 562400）

HPLC-DAD法測定牛奶中6種氟喹諾酮類藥物殘留的研究

楊 勇，姚天月，龔興旺

（黔西南民族職業技術學院，貴州 興義 562400）

目的 建立高效液相色譜串聯紫外檢測器（HPLC-DAD）測定牛奶中6種氟喹諾酮類藥物殘留量的方法。方法 樣品以5%乙酸乙腈提取，經改進的分散固相萃取樣品前處理凈化技術凈化，使其溶液澄清，便于進樣和保護色譜柱。結果 6種氟喹諾酮類藥物成分均達到基線分離，具有良好的線性關系（R=0.999 9），重復性、穩定性、精密度較好（RSD均＜2%），低、中和高3個濃度的回收率均＞98%（RSD均＜1%）。結論 本法專屬性強，操作簡單，靈敏度高，適用于牛奶中6種氟喹諾酮類藥物殘留檢測。

高效液相色譜串聯紫外檢測器；牛奶；氟喹諾酮類藥物；藥物殘留

氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，FQs）是喹諾酮類藥物經加氟結構改造后的衍生物，也是近十多年來研究最多、發展最快的一類合成抗菌藥。該類藥物具有吸收好，組織濃度高，半衰期長，抗菌譜廣，與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等優點，因而被廣泛應用于獸醫臨床[1]。FQs藥物由于藥物本身特性和濫用，容易使受體產生諸多不適，如：皮膚過敏及光敏反應、中樞神經系統反應、循環系統反應、消化系統反應、泌尿系統反應、呼吸系統反應、軟骨毒性、肝臟毒性、生殖毒性、跟腱炎和局部刺激癥狀等[2]，對動物及人類健康造成一定危害。隨著FQs藥物在獸醫臨床和水產養殖中的應用，其殘留問題引起廣泛關注。為了監控FQs藥物在動物性食品中的殘留情況，聯合國糧農組織、世界衛生組織、食品添加劑聯合專家委員會以及歐盟等均對氟喹諾酮類藥物殘留量做出了相應規定[3，4]。目前用于FQs藥物殘留的檢測方法主要有微生物法、高效液相色譜法、高效薄層色譜法、液相色譜—質譜聯用法、高效毛細管電泳法、高效免疫親和色譜法、免疫分析法等[5～12]。我國國家標準《牛奶中喹諾酮類藥物殘留的測定（GB 29692-2013）》采用液相色譜—熒光檢測器檢測法和液相色譜—質譜/質譜法進行氟喹諾酮類藥物殘留測定，國家標準《蜂蜜中喹諾酮類藥物殘留的檢測（GB/T 23412-2009）》采用液相色譜—質譜/質譜法進行氟喹諾酮類藥物殘留測定。但是，受設備條件及實驗成本限制，這些方法很難在國內普及，故探索更為經濟實用的氟喹諾酮類藥物殘留檢測方法迫在眉睫。

本文以近年來在獸藥殘留檢測中應用日趨廣泛的分散固相萃取樣品前處理凈化技術（QuEChERS）以及高效液相色譜串聯紫外檢測器（HPLC-DAD）對牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留量進行檢測。經驗證，該方法簡單、快速、靈敏度高，各項技術指標均能滿足牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留檢測要求，具有較強的實用性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（美國戴安公司，配四元梯度泵，120位自動進樣器，Chromeleon色譜工作站，紫外檢測器）；TD6M醫用離心機（長沙平凡儀器有限公司）；BT2202S電子分析天平（德國Sanorius公司）；TALBOYS渦旋儀（美國亨利特里姆有限公司）；KQ-500AD型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（南昌市恒順化驗設備制備有限公司）；0.45μm微孔濾膜。

1.2 試藥

15批牛奶樣品均為市售。6種氟喹諾酮標準品：恩諾沙星（純度為 98.50%C 13170000 lot：91111德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司），沙拉沙星（純度為95.50%C 16908000 lot：10407德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司），雙氟沙星（純度為97.50%C 12627000 lot：91103德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司），諾氟沙星（純度為99.50%C 15648000 lot：10214德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司），環丙沙星（純度為95.00%C 11668500 lot：00526德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司），丹諾沙星（純度為94.00%C 11960500 lot：00920德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）。乙腈、甲醇（色譜純，美國天地試劑公司）；冰醋酸（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；三乙胺（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；N-正丙基乙二胺（PSA）（美國SELECTRA公司）；正己烷（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；無水硫酸鎂（分析純，天津市美琳工貿有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 標準儲備溶液的制備 精密稱取對照品，恩諾沙星0.010 11 g、沙拉沙星0.010 27 g、雙氟沙星0.010 22 g、諾氟沙星0.010 89 g、環丙沙星0.010 70 g、丹諾沙星0.010 81 g，分別置10ml容量瓶中，加入20μl甲酸和適量甲醇溶解，最后用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液1.00m l分置100m l量瓶，用0.2%甲酸水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為9.958 3μg/m l，9.907 8μg/m l，9.964 5μg/ml，10.835 6μg/m l，10.165 0μg/m l，10.161 4μg/m l的標準儲備溶液。

2.1.2 混合標準使用溶液的制備 精密吸取恩諾沙星、雙氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星標準儲備溶液1.00m l，沙拉沙星標準儲備溶液5.00m l，丹諾沙星標準儲備溶液0.20m l置同一100 ml量瓶，用0.2%甲酸水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得相應濃度分別為恩諾沙星0.099 6μg/m l，沙拉沙星0.490 4μg/m l，雙氟沙星0.099 6μg/m l，諾氟沙星0.108 4μg/m l，環丙沙星0.101 7 μl/ml，丹諾沙星0.020 3μg/m l的混合標準使用溶液（使用前現配）。

2.2 供試品溶液的制備

稱取牛奶樣品10.0 g于50 ml離心管中，加入5%乙酸乙腈溶液15m l，渦旋1min；加入無水硫酸鈉1.5 g和無水硫酸鎂6.0 g，渦旋5min，離心（4 000 r/min）5min，取上清液于另一50 ml離心管中，加入正己烷5m l，渦旋1min，取下層溶液；上述殘渣再加入5%乙酸乙腈溶液10 ml，渦旋1 min，離心（4 000 r/min）5min，取上清液經同一份正己烷萃取，合并下層溶液，置50℃水浴鍋上蒸干。上述殘渣加0.2%甲酸水溶液2m l，轉移入另一10m l離心管中，加入PSA凈化劑0.2 g和無水硫酸鎂0.5 g，渦旋1min，離心（4 000 r/min）5 min，上清液過0.45μm微孔濾膜，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm）；檢測波長：279 nm；柱溫30℃；流動相以乙腈為A相，以含0.1%甲酸的20mmol/L甲酸銨水溶液為B相，等度洗脫（A∶B=12∶88）；流速1.0 m l/min；DAD檢測器；進樣量：10μl；根據保留時間定性，峰面積定量。

2.4 系統適應性試驗

分別取混合對照品溶液、陰性供試品溶液和自制模擬樣品溶液注入液相色譜儀，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。從圖中可見，陰性供試品溶液在諾氟沙星、環丙沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和雙氟沙星位置處無干擾峰，自制模擬樣品溶液中各目標組分均達到基線分離（分離度＞1.5），理論塔板數按諾氟沙星峰計算不低于60 000，結果見圖1～3。

2.5 線性方程的考察

按“2.1.2”項下方法配制一定濃度范圍的混合標準使用溶液，按“2.3”項下色譜條件測定峰面積值，以各組分進樣濃度為橫坐標，以峰面積值為縱坐標，繪制線性關系圖，得回歸方程。由表1可見，該方法中6種喹諾酮類藥物在一定濃度范圍內呈良好的線性關系（r=0.999 9），結果見表1。

圖1 6種氟喹諾酮混合標準品色譜圖

圖2 模擬陽性樣品色譜圖

圖3 陰性樣品色譜圖

表1 6種氟喹諾酮類藥物的線性方程

2.6 精密度試驗

取同一批樣品（自制模擬樣品），按照“2.2”項下供試品制備方法和“2.3”項下色譜條件，對該樣品溶液連續進樣測定6次，記錄峰面積值，分別測定上述6種氟喹諾酮類藥物的含量，并計算相對標準偏差（RSD）值。結果顯示，6種氟喹諾酮類藥物的RSD值分別為0.93%、1.23%、1.73%、1.97%、1.62%、1.75%，均＜2%，說明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗

取同一批樣品（自制模擬樣品），精密稱取，平行6份，按上述方法制成供試品溶液，進樣測定6種氟喹諾酮類藥物的含量，計算RSD值。結果顯示，6種氟喹諾酮類藥物的RSD值分別為1.12%、1.26%、1.20%、1.28%、1.07%、1.02%，均＜2%，說明本法重復性好。

2.8 穩定性試驗

取樣品（自制模擬樣品），按上述方法制成供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣測定6種氟喹諾酮類藥物的含量，計算RSD值。結果顯示，6種氟喹諾酮類藥物的RSD值分別為0.84%、0.91%、0.47%、0.83%、0.40%、0.33%，均＜2%，表明供試品溶液在12 h內性質穩定。

2.9 檢出限與定量限

取樣品（自制模擬樣品），按上述方法制成供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，以信噪比法（S/N=3）考察6種氟喹諾酮類藥物的最低檢出限；以信噪比法（S/N=10）考察6種氟喹諾酮類藥物的定量限，結果見表2。

表2 6種氟喹諾酮類藥物的檢出限及定量限（μg/kg）

2.10 回收率試驗

精確稱取陰性供試品10.00 g，按“2.1.2”項下制備方法配制相應濃度的混合對照品溶液，分別加入0.03μg/ml、0.05μg/m l、0.10μg/m l濃度的氟喹諾酮類藥物對照品溶液1m l。按“2.2”項下制備樣品溶液和“2.3”項下色譜條件進行測定，每個濃度平行制備3份樣品，計算回收率及RSD值。結果表明，諾氟沙星、環丙沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、雙氟沙星的平均回收率分別為99.52%、98.70%、99.23%、98.67%、99.24%、99.39%，RSD值分別為0.13%、0.39%、0.56%、0.69%、0.30%、0.75%，符合國家標準對藥物殘留檢測的要求。

2.11 樣品測定結果

取牛奶樣品15批，按“2.2”項下樣品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定。根據樣品與對照品溶液的保留時間定性、峰面積定量，判斷各樣品中氟喹諾酮類藥物的種類及含量。結果顯示，15批樣品中均未檢出這6種氟喹諾酮類藥物。

3 討論

3.1 提取溶劑的考察

目前，對于氟喹諾酮類藥物的提取較為成熟的方法是用乙腈提取，考慮到氟喹諾酮易溶于酸堿故選擇酸或堿性乙腈為提取溶劑。由于牛奶基質的特殊性，實驗過程中發現直接加入乙腈提取，牛奶會變成乳濁液，因此，提取時加入沉淀蛋白，使之形成均相體系，故選擇酸性乙腈作為提取溶劑。本研究同時也對提取溶劑的酸度、提取方法、提取次數、提取時間等因素進行了考察，結果證明，樣品經過5%乙酸乙腈渦旋，振蕩，提取（兩次），每次提取時間為10mm得出的結果最為理想。

3.2 流動相的考察

目前，有關液相色譜法測定氟喹諾酮含量的研究中大部分選用的流動相為磷酸/三乙胺、磷酸鹽/四丁基溴化銨、磷酸/庚烷磺酸鈉體系，實驗條件比較苛刻。由于流動相含鹽不易沖洗，易造成色譜柱和檢測器堵塞，且能滿足條件的色譜柱使用壽命也較短，所以不可取。本研究對比了0.05mol/L磷酸水溶液—三乙胺調pH 2.5、3.0、3.5的0.2%甲酸水溶液和0.1%甲酸的20 mmol/L甲酸銨水溶液，發現選用0.1%甲酸的20mmol/L甲酸銨水溶液作為流動相，6種目標氟喹諾酮類藥物能得到很好的分離，理論塔板數、對稱因子、拖尾因子均滿足要求，且實驗條件較溫和不會對色譜柱造成損傷。此外，我們還對流動相酸度以及洗脫方式進行考察，結果發現0.2%甲酸酸度、等度洗脫得出的結果較為理想。

3.3 凈化劑的選擇

目前，對于喹諾酮類藥物的凈化大多選擇固相萃取。但是，此方法操作步驟繁瑣、費用較高且回收率普遍偏低。本研究對近年來在農獸藥殘留檢驗中應用廣泛的QuEChERS（Quickly，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）進行了探索。分散固相萃取技術常用的吸附劑有C18、NH2、PSA、PAX 4種，根據牛奶基質特點，本研究選取C18柱、HLB柱、SPE柱和PSA比較凈化效果及其對目標物回收率的影響。實驗證明，HLB柱會使目標物有很大損失，然而SPE柱、C18柱和PSA吸附劑對于回收率的影響沒有明顯區別，但C18柱和SPE柱對牛奶中蛋白質類提取物凈化效果有限，故采用PSA作為吸附劑。本研究同時考察了凈化劑用量，實驗證明，PSA吸附劑用量為200 mg時就能起到很好的凈化效果。

3.4 耐用性的考察

本研究考察了不同柱溫、不同色譜柱、不同流速對實驗結果的影響，結果證明所選柱溫、流速均能達到理想效果，通過對不同色譜柱的考察發現，以UltimateXB-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5μm）作為色譜柱能達到有效分離，且峰形較好。

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R155.5+7

：A

：1671-1246（2017）17-0097-03